Actividades de aplicacion biologa molecular de

sistemas
Rodrguez Romera, Jose
13 de noviembre de 2017

Indice
1. Usos de la biologa molecular de sistemas 2

2. Crecimiento y fenotipo 5

3. Metaboloma 10

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1. Usos de la biologa molecular de sistemas
1.1. Explicar brevemente el mecanismo de seleccion de
un organismo para realizar un bioproceso. Como se
optimiza? Estudio de omicas y desarrollo del modelo,
determinacion de dianas para optimizacion e inicio
del proceso de optimizacion.
Primero se selecciona un microorganismo del que se tenga informacion en las
bases de datos (fisiologa, transcriptomica, proteomica, metabolomica y flujomi-
ca). NE el proceso de optimizacion se analizan todos los datos de la base de datos
y, mediante metodos de optimizacion basados en bioprocesos se realiza un mo-
delo de microorganismo que este optimizado. Una vez optimizado se prueba en
el laboratorio y si funciona se crean cepas de produccion industrial, si no se
repite el procedimiento.

1.2. Que denominamos trabajo wet y dry en BMS?

En BMS un trabajo wet es el que se realiza en el laboratorio un trabajo dry
es el que se realiza por ordenador.

1.3. Explicar que consideracion le merece lo siguiente: Las

tecnologas Omicas o High Throughput Technolo-
giespueden describir el proceso de ADME/TOX. A
que redes nos estamos refiriendo
Los datos OMICOS nos informan sobre interacciones de un medicamento
con los DNA, RNA, protenas, metabolitos o senales implicados en el proceso
ADME/TOX. De todas las OMICAS son de especial interes la toxicogenomica,
la proteomica asocida, la metabolomica asociada y la farmacogenomica.

1.4. Definir claramente que significa: la farmacogenomica

y la toxicogenomica
La toxicogenomica busca los patrones de expresion de genes dentro del or-
ganismo como respuesta a la ingesta de un toxico o de un medicamento en altas
cantidades. Por otro lado, la farmacogenomica busca las variantes geneticas del
ADN que llevan a distintas respuestas de un organismo frente a un medicamento,
su eficacia y su toxicidad.

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1.5. Explicar brevemente Que supondra la transicion en-
tre enfermedad hacia salud, mediante un intervencion
terapeutica, segun la BMS?
El paso de enfermedad a salud supondra reestablecer el balance desesta-
bilizado mediante la actuacion sobre componentes clave (o checkpoints) de las
redes mediante medicamentos.

1.6. SB es una llave al futuro de los desarrollos medicos,

dicen los cientficos lderes del area. Por que?
Esto se debe a:
Complejidad de los sistemas biologicos
Si el sistema se perturba puede resultar en una enfermedad
Las aproximaciones de la biologa convencional no da soluciones a las
complejas interacciones que se generan
La eliminacion de un punto diana puede no ser productivo, la enfermedad
sobrepasara el efecto de la droga
La SB puede dar mejores resultados porque implica un conocimiento mas
preciso y permita hacer perturbaciones para ver que se puede producir

1.7. Definir la matriz en ADME/TOX

?????????????????

1.8. Por que es tan importante que en BMS se hable

de cineticas, analisis, perturbaciones y ventanas de
perturbaciones in vivo?. Definir el estado de salud,
enfermedad, terapia y resistencia a terapia.
Es importante hablar de estos terminos para poder estudiar de forma ma-
tematica los sistemas biologicos.

Salud: balace entre entrada y salida y adecuada respuesta a una pertur-

bacion.
Enfermedad: balance desestabilizado debido a supresion o activacion de
ciertos estados, resultando una inadecuada salida del sistema.
Resistencia a terapia: perdida de sensibilidad de la salida o respuesta
a los medicamentos.

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1.9. Que supone el Modelling en biomedicina?
Crear modelos generales del organismo frente a todos los metabolitos en el
cuerpo permitira estudiar in silico las propiedades de los farmacos y su toxicidad
as como explicar enfermedades y desarrollar su cura antes de probarse in vivo.

1.10. Para que sirve el trabajar con Knock outs, sobreex-

presiones, Chip-chip, y relaciones entre biomolecu-
las en BS.
Todo esto son tecnicas que permiten identificar las relaciones existentes entre
DNA, RNA y protenas dentro de un organismo y relacionarlas con un fenotipo.
Permiten la construccion de un interactoma, flujoma, etc. Utiles en el modelling
en BMS.

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2. Crecimiento y fenotipo
2.1. Justificar la equivalencia entre factor de produccion
- consumo y el coeficiente de produccion - consumo
en cultivos celulares.
De acuerdo con las diapositivas, el termino Yi/j se conoce como factor o
coeficiente de produccion/consumo de forma que no hay ninguna diferencia.

2.2. Determinar las ecuaciones de produccion de celulas y

producto en un reactor discontinuo, sabiendo que la
cinetica es de tipo Monod.
Ecuacion para la cinetica tipo Monod:
max S
= (1)
KS + S
tambien se puede definir como:
dS 1
= (2)
dt x
Sabiendo que dSdt corresponde con la produccion de celulas, sustituyendo
de la ecuacion 1 en la ecuacion 2 y despejando x obtendramos la siguiente
expresion de produccion de celulas:
dS max S
= x (3)
dt KS + S
Por otro lado, la produccion especfica de producto se definira como:
dP 1
qp = (4)
dt x
Y el coeficiente de produccion de producto con respecto a la produccion de
celulas sera:
qp
YP = (5)
x
dP
Si sustitumos qp de la ecuacion 4 en la ecuacion 5 y despejamos dt obtene-
mos la siguiente expresion:
dP
= YP x (6)
dt x

Si despejamos de la ecuacion 1 en la expresion 6 obtenemos la ecuacion de

produccion de producto:
dP max S
= YP x (7)
dt KS + S x

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2.3. Establecer la ecuacion que determina el crecimiento
de hongos filamentosos en sistemas discontinuos.
La tiene Antonio en sus ejercicios

2.4. Clasificacion de microorganismos segun Gaden.

Grupo 1: todo el producto producido procede del metabolismo primario
y energetico con una estequiometra definida.
Grupo 2: el producto procede indirectamente del metabolismo energetico.
Grupo 3: el producto procede del metabolismo secundario y solo se pro-
duce cuando se alcanza el estado estacionario.

2.5. Explique brevemente la relacion existente entre el co-

eficiente observado de produccion de producto a par-
tir de sustrato (Y P ) y el coeficiente observado de pro-
s
duccion de producto a partir de celulas (Y P ). Que
x
relacion existe entre Y P y Y O2 ?
x P

qs
YP = YP
x s
qO2
Y O2 =
P YP
x

2.6. Indique los procedimientos mas comunes existentes

para calcular la concentracion de celulas en un cultivo
celular. Ventajas e inconvenientes que presenta el uso
de cada uno de ellos.
Masa celular: peso seco y paquete celular. Son metodos sencillos y bara-
tos pero tienen mucho error y no distinguen entre celulas vivas y celulas
muertas.
Conteo celular:
Contador de partculas: es un metodo mas fino y rapido que los de
masa celular pero no distingue entre celulas vivas, celulas muertas y
partculas de tamano similar. Es automatizable.
Citometra de flujo: es la cana, distingue entre celulas vivas y muertas
ademas de darnos informacion adicional de cada celula como conte-
nido de ADN o tamano celular. El problema es que es caro.

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 Metodos qumico/fsicos: como la absorbancia a 450nm, presenta las mis-
mas ventajas e inconvenientes que los metodos de masa celular. Este es
automatizable.

2.7. En condiciones aerobias como se calculan los parame-

tros cineticos?
Tomando distintas medidas de masa celular a distintos tiempos y repitiendo
el experimento varias veces con varias concentraciones iniciales de sustrato. En
cada experimento se obtiene una max aparente que se puede representar frente a
las distintas concentraciones iniciales de sustrato de forma que podemos obtener
graficamente max y Ks .

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2.8. En un reactor continuo con E. coli transformada co-
mo biocatalizador, se esta produciendo una hormona
recombinante de crecimiento porcina a partir de un
medio complejo, que contiene las fuentes carbonada,
nitrogenada y fosforada adecuadas, ademas del resto
de nutrientes necesarios. Cuando se alcanza el estado
estacionario la concentracion de la fuente carbonada
(sustrato limitante) es de 6 g/L. A partir del mismo
proceso en discontinuo, se sabe que el cultivo funciona
tal y como se observa en la siguiente tabla, ademas la
velocidad especfica fue la mitad de la maxima cuan-
do la concentracion de fuente carbonada era 4 g/L.
Calcular el coeficiente de produccion de celulas a par-
tir de sustrato y la velocidad de dilucion a la que esta
funcionando el reactor en continuo, sabiendo que la
concentracion de fuente carbonada en la alimentacion
es de 100 g/L y la D O. alcanzada es 0,850 (medida a
650 nm). (Nota: de estudios previos, se sabe que una
D.O. de 0,200 medida a 650 nm equivale a 4 g/L de
celulas).
Tiempo (h) X (g/L) S (g/L)
0.0 0.2 25.0
0.5 0.22 24.8
0.75 0.32 24.6
1.0 0.47 24.3
1.5 1.00 23.3
2.0 2.10 20.7
2.5 4.42 15.7
3.0 9.4 5.2
3.2 11.6 0.2

Ajustamos los datos a la ecuacion:

ln(X) = ln(X0 ) + t

Ajustamos los datos por regresion lineal y obtenemos . A continuacion,

despejamos max de la siguiente expresion y calculamos su valor de acuerdo con
los datos obtenidos antes.
max S
=
KS + S

Y obtenemos max = 0,199h1

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 A partir de max podemos calcular D y Y xs :

max See
D= = 0,19h1
KS + See

xee
Y xs = = 0,18gx gs1
S0 See

2.9. Durante un bioproceso en contnuo, las celulas trans-

formadas pueden sufrir perdida del plasmido como
consecuencia de procesos de segregacion. Diga como
puede controlar un experimentador la proporcion de
celulas que poseen plasmido respecto a las que lo han
perdido, en un proceso discontinuo con celulas trans-
formadas que crecen en ausencia del antibiotico al
cual se les ha conferido resistencia. Como se podra
asegurar que la poblacion celular mantiene la infor-
macion genetica correcta?
Para saber la proporcion de celulas que han perdido el plamido determinara
la cantidad de celulas mediante citometra de flujo utilizando una sonda espe-
cial con afinidad por el plasmido de forma que determinara que proporcion de
celulas mantienen el plasmido y cuales lo han perido. Por otro lado, para contro-
lar que todas las bacterias del medio tengan el plasmido, bastara con hacerlas
crecer en el medio con antibiotico al que el plasmido les confiere resistencia.

2.10. Indique que relacion existe entre los coeficientes es-

tequiometricos de produccion o de consumo y los
coeficientes de produccion o consumo en un biopro-
ceso realizado por celulas de algas unicelulares como
biocatalizadores.
2.11. Que quiere decir que = D?
En un bioreactor contnuo en estado estacionario se cumple esta ecuacion
porque el crecimiento celular se iguala a la velocidad de dilucion de celulas.

2.12. Se puede alcanzar la Dmax en un reactor continuo?

Por que?
No se puede alcanzar porque las celulas no creceran tan rapido como la
velocidad de dilucion y ocurrira el fenomeno de Wash out.

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3. Metaboloma
3.1. Explicar brevemente que relaciones existen entre los
omas y el metaboloma. Como se relacionan?
El genoma, el transcriptoma y el proteoma son todos los puntos que, en
conjunto e interaccionando entre ellos llevan al desarrollo de un conjunto de
redes metabolicas (metaboloma) que sera, en ultima instancia, el fenotipo que
representa el genoma, el proteoma y el transcriptoma.

3.2. Que denominamos metaboloma en BMS?

Conjunto de todos los metabolitos endogenos de bajo peso molecular y sus
intermediarios incluyendo sustratos, productos y factores de regulacon, en un
estado fisiologico o de desarrollo particular.

3.3. Que consideracion le merece lo siguiente?: de las

tecnologas Omicas el metaboloma debe estudiarse
tras perturbaciones de menos de 300 segundos. A
que redes nos estamos refiriendo cuando hablamos de
metaboloma?
Mientra que la genomica es invariable y la transcriptomica y proteomica
presentan variaciones a largo plazo (en el orden de horas) ante una perturbacion,
el metabolismo (metaboloma) cambia frente a perturbaciones en perodos de
tiempo muy pequenos. Para poder simplificar estos estudios se puede excluir
la variacion en actividad enzimatica estudiando el metabolismo en perodos
maximos de 300 segundos.

3.4. Definir claramente que significa metabolito/molecu-

las dentro del interactoma metabolico.
Molecula organica de bajo peso molecular (<800 Daltons) no polimerica que
forma parte de una red metabolica en forma de sustrato, producto, factor de
regulacion o metabolito intermedio.

3.5. Explicar brevemente Que supone desarrollar una pla-

taforma metabolomica. E importancia en la BMS?
Crear una base de datos donde se vuelquen toda la informacion sobre el
metaboloma de distintos organismos permitira ayudar al desarrollo de la inves-
tigacion en enfermedades humanas, la mejora de microorganismos en industria
entre otros aportes en la investigacion de la BMS.

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3.6. Explcar por que la metabolomica requiere:
Advance methology: estudiamos gran cantidad de metabolitos distintos
a concentraciones muy bajas. La metabolomica requiere las tecnicas de
vanguardia.
Expensive equipment: las tenicas punteras requieren maquinaria cara ge-
neralmente.
No standard procedure for all metabolites: la gran cantidad de metabolitos
distintos que queremos estudiar y sus diversas propiedades hace que no se
pueda usar una tecnica para todos ellos.
Quenching and extraction methods are needed, no standard are avaliable
for certain metabolites and need to be chemically sythetized. Como los
cambios en el metaboloma son tan rapidos es necesario detener el meta-
bolismo mediante el proceso de quenching, y en cualquier caso el estudio
de los metabolitos se debe reducir a unos 150 por estudio.

Sabiendo que los metabolitos son:

Diverse
High polar
Non-volatile
In general poor detectable
Similar properties

3.7. Definir el proceso de quenching metabolico. Y el pro-

ceso de extraccion de metabolitos internos.
El quenching metabolico sera la rapida inacctivacion del metabolismo en
las muestras celulares necesaria para realizar medidas fiables de metabolitos
intracelulares.
Por otro lado, la extraccion de estos metabolitos internos requiere la selec-
cion de los procedimientos adecuados que eviten que dichos metabolitos sean
catabolizados o degradados qumicamente.

3.8. Por que es tan importante que se realice el quenching

de forma adecuada?. Que metodos se utilizan?. De-
finir el concepto de leacking.
El quenching es importante porque las concentraciones de los metabolitos
que se miden en metaboloma cambian considerablemente en cortos perodos
de tiempo, de forma que para obtener medidas fiables de las concentraciones
intracelulares de los metabolitos es necesario detener el metabolismo mediante

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este proceso. Estos procesos pueden ser a baja temperatura (con metanol o
filtracion rapida y congelado con N2 ) o en caliente (evaporacion en etanol puro).
Algunos procesos de quencing generan poros en las membranas celulares
que llevan a la perdida de metabolitos intracelulares. Este proceso se denosmina
leaking.

3.9. Que supone el usar la baja temperatura, o los meto-

dos de ebullicion en quenching? Cree que la alta tem-
peratura puede afectar a los metabolitos que van a ser
detectados?
En funcion del microorganismo, el quenching es mas efectivo a baja o a
alta temperatura. Por otro lado, trabajar a altas temperaturas puede afectar a
metabolitos termolabiles.

3.10. Para que sirve el trabajar los siguientes metodos

en la extraccion?
Low temperature
Cold methanol extraction (-20o C)
Chloroform/methanol extraction
Perchloric acid extraction
High temperature
Hot ethanol extraction
Potassium hydroxide extraction

El metodo de extraccion con el que se trabaje debe asegurar que el metabolito

no se degrada qumicamente ni sufre catabolismo. Es por esto por lo que se suele
trabajar a bajas temperaturas.

3.11. Por que se puede incluso utilizar tecnicas de sepa-

racion como LC, GC y CE y aunque no permitan
su separacion se puede utilizar en combinacion con
MS?
Porque MS, a parte de ser un metodo de analisis tambien es un metodo de
separacion en si mismo, de esta forma, aunque la separacion no sea completa en
LC, GC o CE, los componentes se pueden terminar de separar en el MS.

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3.12. Que significa El HPLC es el sistema mas estandar
de separacion. No obstante, hay veces que en el
mismo pico eluyen varios metabolitos y es el MS
el que tiene quehacer el trabajo de estudiar los frag-
mentos que se generan.
La misma respuesta que para la pregunta anterior. El MS actua como sistema
complementario de separacion ademas del HPLC.

3.13. The separation is based on the differential electrop-

horetic mobilities of solutes, which are characteris-
tic properties of analyte ion in a given media and
at a given temperature. A que nos estamos refi-
riendo con esa afirmacion?
Esta afirmacion hace referencia a la base teorica de la separacion de meta-
bolitos en una electroforesis.

3.14. Describir los elementos de un MS.

Ionizador: puede ser por varias tecnicas (MALDI, electrospray...), se en-
carga de ionizar las partculas procedentes del sistema de separacion.
Analizador: Estos iones son seleccionados a continuacion mediante un
sistema de imanes y separados en funcion de su relacion masa/carga.
Detector de iones: detecta los iones procedentes del analizador y los
manda al sistema informatico.
Sistema de datos: analiza los datos del detector de iones y los representa
en un espectro de masas. Compara los resultados obtenidos con bases de
datos para identificar el compuesto del que se trate.

3.15. Fases del ESI.

Fase 1: La muestra se mezcla con un disolvente y se introduce en un
capilar. El extremo del capilar se carga con un alto voltaje de forma que
carga a las moleculas que pasan por el capilar. Las moleculas cargadas se
repelen y se separan en pequenas gotas que se difuminan.

Fase 2: las gotas pasan por una serie de canales mientras se secan con ayu-
da de gas nitrogeno. Mediante el avance algunas gotas se separan en gotas
mas pequenas. El proceso crea al final una nube de moleculas sencillas
cargadas que pasan al analizador.

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3.16. En MALDI, como ocurre la ionizacion? Se debe a
que la matriz le transfiere cargas sin fragmentar la
molecula? Es una fotoexcitacion de la matriz?
En MALDI, un rayo laser apunta a la superficie de una disolucion solida de
matriz y analito. El compuesto cromoforo de la matriz se acopla con la frecuencia
del laser causando la vibracion del material por excitacion, lo que lleva a la
desintegracion localizada de la disolucion solida. Los fragmentos liberados de la
superficie consisten en moleculas de analito rodeadas por matriz e iones salinos.
Las moleculas de matriz se evaporan de estos fragmentos dejando el analito libre
en fase gaseosa.
En segundo lugar, las moleculas de matriz foto-excitadas se estabilizan me-
diante la transferencia de protones al analito, ionizandolos. Los iones son enton-
ces llevados al espectrometro de masas para su analisis.

3.17. Explique la siguiente frase: El MS permite determi-

nar: Molecular weight, structure, identity, quan-
tity, and purity.
El espectometro de masas se basa en el analisis de iones en movimiento a
traves de un vaco. Del analisis de estos iones podemos obtener informacion de
la muestra como el peso molecular de los analitos, la estructura, la identidad,
la cantidad de analito (mediante una recta patron) y la pureza pues es capar de
determinar tambien la presencia de otras sustancias cualesean.

3.18. Definir cada uno de los tres tipos de estudios de

metaboloma
Metabolic profiling : deteccion mediante masas de unos pocos metabo-
litos de todo el metaboloma.
Metabolic figerprinting :deteccion de todos los metabolitos de una celu-
la en un momento determinado.
Metabolic footprinting : deteccion de todos los metabolitos excretados
por una celula en un momento determinado.

3.19. Por que los MS mas utilizados son los ESI y MAL-
DI?
Porque son metodos de ionizacion suaves que permiten ionizar las biomolecu-
las que son mas debiles, generando iones de los que se pueda sacar informacion.

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3.20. En que se basa el cuadrupolo (Q), el QQQ y el
Q-ion trap?
Son tres dispositivos que permiten la separacion de los iones dentro de un
espectrometro de masas de forma mediante el uso de campos electromagneticos.
El primero es un analizador sencillo (solo un cuadrupolo), el QQQ sera la
combinacion de tres quadrupolos en serie y el Q-ion trap sera un quadrupolo
encargado de la separacion de iones mediante un sistema de campos electricos
dinamicos.

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