TFSATORES

ARNI ROS
Artigo
RATAMENTO
ASSOCIADOS . Original
ETDE ALCRIANAS
INTERRUPO
DESNUTRIDAS
DE TRATAMENTO ANTI-RETROVIRAL
HOSPITALIZADAS

ISOLAMENTO, DIFERENCIAO E ASPECT

ISOLAMENTO OS BIOQUMICOS DE CL
ASPECTOS ULAS-TRONCO DE
CLULAS
LQUIDO AMNITICO
ANTNIO CARLOS VIEIRA CABRAL, PATRCIA CAROLINE NGELO, HENRIQUE VITOR LEITE, ALAMANDA KFOURI PEREIRA, ANA PAULA BRUM MIRANDA LOPES, MARIA
BEATRIZ DE OLIVEIRA, KARINA BRAGA GOMES BORGES, VICTOR CAVALCANTI PARDINI, ALESSANDRO CLAYTON DE SOUSA FERREIRA *
Trabalho realizado pelo Departamento de Gentica Humana e pela Criovida do Instituto H. Pardini, Belo Horizonte, Minas Gerais e no Hospital
das Clnicas e Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG

RESUMO
As clulas-tronco mesenquimais (MSCs) so clulas com grande potencial de diferenciao e esto sendo recente-
mente introduzidas na clnica para tratamento de vrias doenas. Possuem vrias vantagens incluindo sua estabilidade
fenotpica in vitro.
OBJETIVO. isolamento das MSCs de lquido amnitico, sua expanso e a demonstrao da sua capacidade de se diferenciar
em clulas miognicas e adipognicas, sem alterar a estabilidade cromossomal em meio de cultura.
MTODOS. a fim de avaliar a mudana funcional destas clulas, foram avaliados parmetros bioqumicos nas clulas
adipognicas j diferenciadas e antes da diferenciao atravs da dosagem de triglicrides. A diferenciao em clulas
musculares foi avaliada comparando os nveis de creatinofosfoquinase - CK, desidrogenase ltica - LDH e aldolase produzidas
por estas clulas antes e aps diferenciao.
RESULTADOS. os nveis de triglicrides foram significativamente maiores nas clulas diferenciadas, mostrando ainda a formao
de grnulos intracitoplasmticos. Todos os outros valores obtidos foram significativamente maiores nas clulas miognicas
*Correspondncia: diferenciadas quando comparadas s no diferenciadas.
Instituto H. Pardini
Rua Maranho, 1040
CONCLUSO. os resultados sugerem que estes protocolos podem ser usados para avaliar diferenciao de clulas-tronco
Funcionrios em clulas adipognicas e miognicas, e que o lquido amnitico pode ser uma fonte para obteno destas clulas.
Belo Horizonte MG
CEP 30150-331
Tel./Fax: (31) 3287-3205
UNITERMOS: Clulas-tronco mesenquimais. Lquido amnitico. Triglicrides. Creatinofosfoquinase (Creatina
alessandro@labhpardini.com.br quinase). Desidrogenase ltica (L-lactato desidrogenase). Aldolase (Frutose-bifosfato aldolase).

INTRODUO Estas clulas tm sido utilizadas com bastante otimismo na medicina

As clulas-tronco so definidas como clulas com grande capacida-
de de diferenciao. Durante o desenvolvimento embrionrio, as
clulas-tronco do blastocisto do origem s clulas progenitoras que se
tornam progressivamente restritas s clulas especializadas. As clulas-
tronco tambm esto presentes em tecidos maduros, sendo denomi-
nadas de clulas-tronco adultas, e tambm contribuem para o desen-
volvimento ps-natal por substituir clulas j diferenciadas que so
perdidas devido injria, apoptose programada ou turnover fisiol-
gico1. As clulas-tronco adultas no somente possuem a capacidade
multipotente, como tambm pluripotente, como foi demonstrado em
trabalhos com camundongos, no qual clulas-tronco hematopoiticas
derivadas da medula ssea foram capazes de regenerar tecido muscular
esqueltico lesionado quimicamente2. Neste mesmo trabalho tambm
foi possvel verificar a capacidade dessas clulas de migrarem da medula
para as regies lesionadas.
As clulas-tronco mesenquimais (CTM) correspondem a uma
populao de clulas progenitoras multipotentes capazes de atuarem
na hematopoiese e se diferenciarem em tecidos mesenquimais, como
clulas das linhagens osteognica, adipognica e condrognica3,4.
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regenerativa e engenharia tecidual, como o desenvolvimento de clulas
musculares, regenerao heptica e formao de clulas do sistema
nervoso central5. Aliado possibilidade de ser possvel isolar e dife-
renciar as CTM em meio de cultura, o uso em estudos clnicos e
pr-clnicos tem demonstrado seu alto poder teraputico.
A fonte de CTM mais utilizada a medula ssea, no entanto, como
o nmero e a capacidade de diferenciao destas clulas diminuem com
a idade, seu potencial teraputico tambm declina com o tempo6.
Assim, devido a estas limitaes, outras fontes de CTM foram
identificadas, sendo possvel isol-las em trabculas sseas, tecido
adiposo, lquido sinovial, sangue perifrico e musculoesqueltico5.
Hoje a maioria dos procedimentos clnicos de transplante
de clulas-tronco tem utilizado como fonte clulas extradas de sangue
de cordo umbilical7, o qual, no entanto, tem demonstrado baixa
freqncia de clulas progenitoras mesenquimais8.
Sabe-se que o lquido amnitico contm mltiplos tipos celulares
derivados do feto em desenvolvimento e alguns autores tm demons-
trado que as clulas de lquido amnitico expressam genes embrio-
nrios como o OCT-4, que responsvel pelo carter pluripotente de
clulas-tronco embrionrias9. Alm disso, o lquido amnitico possui
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CABRAL ACV ET AL.
como vantagem a facilidade de obteno, uma vez que a amniocentese
um procedimento utilizado rotineiramente como mtodo de
propedutica fetal e associa-se a um nmero pequeno de complica-
es. tambm conhecida a proibio tico-legal da manipulao de teofilina (0,5 mmol/L, Abbott), insulina (10 mg/L, Sigma) e
clulas embrionrias, mesmo que com fins teraputicos.
Assim, este trabalho teve como objetivo o isolamento de CTM em
lquido amnitico, sua expanso (multiplicao) in vitro, alm da (Merck) com concentrao final de 1%v/v ou DMSO acrescido de
demonstrao da capacidade em se diferenciarem em clulas com
caractersticas adipognicas e miognicas, produzindo mediadores
bioqumicos caractersticos. Desta maneira, a diferenciao celular
pode ser evidenciada de forma rpida e reprodutvel. Alm disso,
buscou-se avaliar a estabilidade cromossmica das clulas mesen-
quimais em cultura aps o processo de expanso.
Alm disso, foi demonstrado que o lquido amnitico apresenta-se
como uma nova fonte de CTM com grande potencial de proliferao
e diferenciao, sem interferir no processo de cariotipagem fetal,
podendo ser no futuro a fonte de escolha para a obteno destas clulas
e suas aplicaes teraputicas.
MTODOS
Amniocentese
Aproximadamente 5 mL de lquido amnitico foram coletados em
cinco gestantes, com indicao clnica para o procedimento, atravs de
puno de abdome com agulha BD-20G. Antes da puno foi realizado
procedimento de anti-sepsia com soluo povidina-iodo tpico e
anestesia local do abdome materno por todo o trajeto da agulha
utilizando-se lidocana 1% sem vasoconstritor (Astra).
O procedimento foi realizado aps a obteno do consentimento
informado de todas as pacientes e o estudo teve a aprovao do
Comit de tica em Pesquisa (COEP) da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Cultura de clulas
Para obteno e cultivo de clulas mesenquimais, foram testados
dois diferentes meios de cultura, o meio Changs (Irvine Cientific)
suplementado com soro fetal bovino e L-glutamina; e o meio
Amniomax (Invitrogen) com os mesmos suplementos.
Para a realizao das culturas, 5 mL de lquido amnitico foram
centrifugados em tubos cnicos de 15 mL (Corning) a 1.000 rpm por
8 a 10 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e o precipitado
de clulas foram ressuspendidos em 5 mL de meio de cultura Changs
ou Amniomax. Os tubos cnicos foram gentilmente homogeneizados
e seu contedo transferido para frascos T25. Os frascos foram incuba-
dos a 37C e 5% de CO2 durante 4 a 5 dias. Aps este perodo foi
realizada a troca dos meios de cultura. Depois de atingirem uma
confluncia de 80%, as clulas foram tratadas com tripsina (Gibco),
e a partir da foram utilizadas para diferenciao ou expanso.
Expanso celular
As clulas da cultura primria foram centrifugadas em tubo cnico
de 15 mL, ressupendidas em meio Changs e Amniomax e
replaqueadas em frascos de T25, sendo este procedimento repetido
por trs vezes.
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Diferenciao celular
Para diferenciao das clulas em clulas adipognicas, foram
acrescentados ao meio de cultura: dexametasona (1 mol/L, Ache),
indometacina (200 mmol/L, Merck). J para a diferenciao em
clulas miognicas foi acrescentado aos meios de cultura DMSO
cido ascrbico na mesma concentrao. As clulas foram mantidas em
cultura a 37C a 5% de CO2. Os meios de cultura com os insumos
foram trocados a cada dois dias.
Cariotipagem
Ao final da quarta passagem, as clulas obtidas foram novamente
tratadas com tripsina, ressuspendidas, centrifugadas e fixadas com
uma soluo 3:1 de etanol/cido actico (Merck). O pacote celular
final foi ento submetido ao procedimento de cariotipagem com
banda G a fim de avaliar se as divises celulares in vitro provocaram
algum tipo de alterao cromossmica.
Avaliao da diferenciao celular
A diferenciao em clulas adipognicas foi avaliada pela dosagem
de triglicrides pelo mtodo enzimtico colorimtrico utilizando o
aparelho ADVIA 2400 (Bayer), de acordo com o protocolo do
fabricante. A diferenciao em clulas miognicas foi avaliada atravs
das dosagens de creatinofosfoquinase, desidrogenase ltica e
aldolase, ambas pelo mtodo enzimtico utilizando o mesmo equipa-
mento e protocolo padro.
Anlise estatstica
Para a anlise estatstica, foi considerado um intervalo de confiana
de 95% e uma diferena significativa se p<0,05. As variveis quantita-
tivas foram analisadas utilizando-se o teste t para comparao de
mdias de grupos independentes. As anlises foram realizadas atravs
do programa Sigma Stat10.
RESULTADOS
Cultura de clula
Em ambos os meios de cultura (Changs e Amniomax), aps cinco
dias de cultivo, foi possvel observar clulas com aspecto fibroblastide
aderidas ao fundo frasco T25. Neste perodo, o meio Amniomax
mostrou-se mais eficiente por promover uma maior multiplicao
celular em todas as amostras cultivadas. Aps 10 dias de cultivo, as
clulas j se mostravam com confluncia maior que 80% com aspecto
caracterstico fibroblastide (Figura 1).
Cariotipagem
A fim de avaliar se a cultura celular induziu alguma alterao
cromossmica, foi realizada a cariotipagem das clulas obtidas logo
aps amniocentese e comparada aos resultados do caritipo das clulas
em cultura aps trs passagens. Trs amostras em cultura apresenta-
ram um caritipo sem alteraes (duas amostras 46, XY e uma amostra
46, XX), o qual foi compatvel com o sexo fetal. Foi observado que uma
das amostras apresentava trissomia do cromossomo 18 (Figura 2A) e
outra correspondia a uma amostra triplide (Figura 2B). Estes
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ISOLAMENTO, DIFERENCIAO E ASPECTOS BIOQUMICOS DE CLULAS-TRONCO DE LQUIDO AMNITICO

resultados foram compatveis com os obtidos antes da cultura celular, Figura 1 - Clulas-tronco no diferenciadas cultivadas em meio de cultura
mostrando que estas alteraes numricas no foram induzidas in vitro, Amniomax. Observar caracterstica fibroblastide das clulas
o que j era esperado, pelo fato das mulheres submetidas
amniocentese j apresentarem condies clnicas que justificassem o
procedimento.

Diferenciao celular
As culturas celulares antes e aps induo foram tratadas com
tripsina, ressuspendidas em 1 mL de tampo Hanks (Gibco) e lisadas
mecanicamente atravs de ultra-som. Em seguida, as clulas lisadas
foram centrifugadas 14.000 rpm durante cinco minutos e o
sobrenadante foi submetido s dosagens.
A diferenciao em clulas adipognicas comeou a ser percebida
aps dois dias de induo com os fatores de diferenciao acima
mencionados. Foi observada mudana na morfologia das clulas, as
quais adquiram aspecto arredondado quando comparado ao aspecto
fibroblastide inicial e um acmulo de grnulos intracitoplasmticos
(Figura 3).
A avaliao da diferenciao adipognica foi realizada atravs da
dosagem de triglicrides na cultura de clulas lisadas. As clulas pr-
induo mostraram nveis indetectveis de triglicrides. J as clulas
adipognicas induzidas mostraram nveis significativamente elevados
com mdia de 129,62 + 8;71 mg/dL (p=0,00).
A diferenciao em clulas miognicas s foi obtida em meio de Figura 2A - Caritipo com Banda G de uma das amostras analisadas em
cultura acrescido do DMSO isoladamente (Figura 4) e foi avaliada cultura aps trs passagens mostrando trissomia do cromossomo 18
atravs da dosagem bioqumica de creatinofosfoquinase - CK (37.2 +
13,84 U/L), desidrogenase ltica - LDH (379.2 + 240,76 U/L) e
aldolase (59.18 + 31,96 U/L.) As clulas no induzidas mostraram
baixos valores destes analitos: CK (4.6 + 5.94 U/L), LDH (43.2 +
31.96 U/L) e aldolase (1.34 + 1.16 U/L), quando comparados aos
valores obtidos aps induo. Os valores mostram uma diferena
significativa entre os resultados obtidos nas culturas celulares antes e
aps induo (CK: p=0.0013; LDH: p =0.015; aldolase: p =0.0037).

DISCUSSO
Recentemente, vrios trabalhos tm sido publicados com o intuito
de identificar, caracterizar e diferenciar clulas-tronco de fontes diver-
sas. Estes trabalhos tm demonstrado a caracterstica de pluripotncia
destas clulas com potencial teraputico para tratamento de patologias
tanto intra-tero quanto aps o nascimento11,12,13.
A diferenciao destas clulas tem sido principalmente demonstra-
da por tcnicas moleculares e por ensaios citolgicos e histolgicos
utilizando coloraes especiais como Oil Red e Von Kossa. Entretanto, Figura 2B - Caritipo com Banda G de uma das amostras analisadas
em cultura aps trs passagens mostrando triploidia
em nenhum destes trabalhos foram evidenciadas alteraes das fun-
es bioqumicas das clulas diferenciadas oriundas de lquido
amnitico. A importncia do presente trabalho consiste no fato de que
as alteraes ocorridas nas clulas diferenciadas foram demonstradas
no s nas suas caractersticas morfolgicas, mas essencialmente na
mudana funcional evidenciada pelas anlises bioqumicas.
Desta forma, cinco amostras de lquido amnitico foram coletadas e
cultivadas em meio de cultura para proliferao. As condies do cultivo
foram padronizadas neste trabalho, no qual se observou que o meio
Amniomax permitiu a obteno de um resultado mais eficiente sendo
observado um tempo menor de cultura para confluncia celular de 80%.

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Figura 3 - Clulas adipognicas diferencidas. Pode ser observada
a mudana na morfologia celular no aspecto arrendodado e na
aquisio de grnulos intracitoplasmticos
Nas culturas no foram utilizados fatores exgenos de crescimento
como bFGF, aFGF, visto que estes fatores podem levar a possveis
mutaes cromossmicas in vitro. A ausncia de aneuploidias e/ou
poliploidias foi evidenciada atravs da cariotipagem nas culturas de
quarta passagem. A cariotipagem demonstrou ainda que no ocorreu
contaminao do material coletado com clulas maternas, pois em
culturas de fetos sabidamente masculinos, o caritipo confirmou ploidia
normal e presena de cromossomo Y.
As condies de diferenciao das clulas em cultivo em clulas
adipognicas foram adaptadas substituindo a isobutil-metil-xantina
(IBMX), comumente utilizada em vrios trabalhos14,15 por teofilina,
outro inibidor de fosfodiesterase. Em virtude dos resultados obtidos,
pode-se considerar a teofilina como possvel substituto para o IBMX.
Neste trabalho procurou-se verificar mudanas bioqumicas nas
clulas induzidas diferenciao adipognica pela dosagem de o tratamento e cura de vrias doenas.
triglicrides. Nas clulas diferenciadas foi possvel observar a nova
capacidade em produzir triglicrides, caracterizando assim o ganho de
uma nova funo, e possivelmente armazen-los sob a forma de
grnulos intracitoplasmticos observados nestas clulas microscopia.
A possibilidade de que este valor obtido seja proveniente do meio de
cultura e outros fatores utilizados na diferenciao poder ser descar-
tada, uma vez que todos os suprimentos isoladamente foram subme-
tidos mesma dosagem e nenhum valor foi detectado.
Uma nova etapa na diferenciao celular foi conduzida com o
intuito de avaliar sua transformao em clulas miognicas. Para isto,
foram testados os meios de cultura enriquecidos com DMSO e cido
ascrbico, e num segundo momento, apenas com DMSO. Observou-
se que no primeiro caso no houve crescimento celular quando
observadas as culturas em 14 dias, mas contrariamente a este resultado,
a adio do DMSO isoladamente ao meio de cultura conferiu um
resultado satisfatrio onde se observou grande confluncia de clulas.
A fim de avaliar a mudana funcional destas clulas, foram compa-
rados os valores obtidos das clulas diferenciadas e no diferenciadas
492
Figura 4 - Clulas miognicas diferenciadas obtidas em
meio de cultura enriquecido com DMSO
para trs analitos: CK, LDH e aldolase. Estas enzimas so produzidas
especialmente em clulas musculares. Quando analisadas em conjunto,
elas do uma idia da natureza miognica das clulas analisadas.
Em todos os analitos dosados foram observadas diferenas signifi-
cativas entre as clulas pr diferenciao e clulas miognicas, suge-
rindo que o protocolo de diferenciao padronizado neste trabalho
poder ser utilizado na obteno de clulas com caractersticas de
clulas musculares.
CONCLUSO
A obteno de clulas adipognicas e miognicas in vitro surge
como um fator de grande relevncia e a possibilidade de utilizar o
lquido amnitico como fonte de obteno de CTM abre novas
perspectivas de tratamento que podero no futuro ser a chave para
AGRADECIMENTO
Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG
Conflito de interesse: no h
SUMMARY
ISOLATION, DIFFERENTIATION AND BIOCHEMICAL ASPECTS OF
AMNIOTIC FLUID STEM CELL
The mesenchymals stem cells (MSCs) are cells with the great potential
of differentiation are being introduced in the clinic for treatment of several
diseases. Mesenchymal stem cells have several advantages including the
stability of their phenotype in vitro. Background: isolation of MSCs in
amniotic fluid, its expansion and the demonstration of the capacity of these
cells to differentiate in adipogenic and miogenic cells, without to change
the chromosomal stability of the MSCs in culture. Methods: in order to
evaluate the functional change of these cells, were gotten values of the
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differentiated adipogenic cells and not differentiated through the dosage
of triglycerides. The miogenic nature of the differentiated cells was
analyzed comparing the creatine kinase - CK, lactic dehydrogenase - LDH
and aldolase produced by the cells. Results: the values of triglycerides were
significantly higher in differentiated cells, showing intracitoplasmatic gra-
nule form after differentiation. All the biochemical characters were
significantly higher in differentiated miogenic cells. Conclusions: this study
suggests that the standardized protocol of differentiation can be used in
the attainment of cells with characteristics of adipogenic and muscular
cells, from amniotic fluid. [Rev Assoc Med Bras 2008; 54(6): 489-93]
KEY WORDS: Mesenchymals stem cells. Amniotic fluid. Triglycerides.
Creatine kinase. Lactic dehydrogenase (L-lactato desidrogenase).
Aldolase (Fructose-biphosphate aldolase).
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Artigo recebido: 27/02/07
Aceito para publicao: 24/03/08
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