OPTIMIZACIN DE LA EXTRACCIN DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE EN RESIDUOS DE BORRAJA

Segovia F; Almajano, MP*

EUETIB, Urgell, 186. CP 08036 Barcelona

m.pilar.almajano@upc.edu

Palabras clave:
Borraja, RSM, Extraccin, ORAC, Polifenoles

RESUMEN
La borraja es uno de los vegetales ms tpicos de regiones espaolas como Aragn y
Navarra. Durante el procesado ms del 60% son subproductos de uso desconocido.
El objetivo de este trabajo es revalorizar los residuos de borraja y optimizar el proceso de
extraccin. Se usa el mtodo de superficie de respuesta (RSM) para optimizar la extraccin
de sustancias antioxidantes. La muestra ha sido obtenida de las 5 villas. Se liofiliza y
homogeniza antes de comenzar.
Los polifenoles totales se determinaron a travs del mtodo Folin-Ciocalteu y la capacidad de
absorcin de los radicales oxigenados a travs del mtodo ORAC. Los solventes que se
utilizan son etanol y agua. El diseo experimental se basa en uno central compuesto. El
rango de las variables son 80-60C, 60-30 % en etanol (V/V) y 35-25 min.
Para las condiciones ptimas encontradas de 70C, 48% en etanol y 30min, el valor de
polifenoles totales fue de 1089 mg GAE/g de materia seca. Para el ORAC el valor fue de
150,4 mM/g de materia seca, para una condiciones de operacin de 71 C, 52 % y de 26
min.
La superficie muestra puntos ptimos y queda demostrada la presencia de polifenoles y su
capacidad antioxidante.

INTRODUCCIN

La Borraja (Borago officinalis L.), es una planta cultivada ampliamente en la regin de

Aragn y Navarra a la cual se le atribuyen gran cantidad de propiedades antiespasmdicas y
antiinflamatorias. Por otra parte, el aceite de borraja reduce el nivel de colesterol en sangre,
fosfolpidos y triglicridos (Gilani et al., 2007). Tambin se encuentra asociada al tratamiento
de la artritis reumatoide, ya que acta en los procesos inflamatorios destructivos controlando
el factor de necrosis tumoral alfa, relacionado con este tipo de enfermedad (Richard et al.,
2001).
La industria de los alimentos produce gran cantidad de subproductos y desperdicios, los
cuales pueden ser utilizados para obtener sustancias reutilizables para otros procesos o como
materia prima (Ayala-Zavala et al., 2011, Wijngaard et al., 2010b). Por ejemplo, encuentran
en pulpas y otros desperdicios derivados de la produccin de jugos de frutas y vinos se
pueden encontrar compuestos polifenlicos (Wijngaard et al., 2010a, Guerrero et al., 2008).
Estos polifenoles pueden ser grandes antioxidantes y, en algunos casos, resultan mejores
que los antioxidantes sintticos. En la Borraja (planta y semilla), se pueden encontrar
diversos tipos de cidos fenlicos: glico, clorognico, rosmarnico, p-comrico, trans-
cinmico, entre otros (Mhamdi et al,. 2010, Mhamdi et al., 2009) y durante el procesado el
60% de se desecha, usando solos los tallos para el consumo humano, considerando todo lo
dems como subproducto (Garcia-Iniguez de Ciriano et al., 2009).
La metodologa de superficie de respuesta (RSM) es una herramienta til para la
optimizacin de procesos (Sun et al., 2011). Con sta se puede estudiar la influencia de
variables independientes sobre una o varias respuestas y obtener un modelo matemtico
capaz de reproducir el comportamiento, realizando pocos experimentos (Pompeu et al.,
2009; Ballard et al., 2010). El diseo comnmente usado en l{{426 Saha,Jayati 2011; 427
Singleton,V.L. 1965}}a industria de los alimentos es el diseo central compuesto rotable
(CCD). En l se pueden evaluar las variables (factores) con diferentes valores (niveles) y sus
interacciones, usando la menor cantidad de experimentos (Jayati et al., 2011).
En este trabajo, se optimiza la extraccin de sustancias antioxidantes en funcin de la
cantidad de polifenoles presentes en los desperdicios de la borraja y tambin, de la actividad
antiradicalaria por medio del ensayo de la capacidad de absorcin del oxigeno radical
(ORAC), para luego hacer una validacin del modelo obtenido mediante la aplicacin del
RSM.
MATERIAL Y MTODOS

Borraja
La borraja fue adquirida en el mercado local, proveniente de la comarca de las cinco villas de
Zaragoza (Aragn). Las muestras se cortaron y almacenaron en recipientes plsticos en un
congelador (Deep Freezer, ilShin Lab. Co., Ltd) a -80C, hasta su uso. Este material se
liofiliz (UNICRYO MC 2L-60C), durante 3 das y se moli (Moulinex, Multitrio 450W), hasta
obtener un polvo homogneo.

Extracciones
Las extracciones se realizaron siguiendo el mtodo descrito por Wijngaard et al (2010), con
algunas modificaciones. Se toman 0,250 g de muestra y se colocan en un envase de vidrio
ambarino. Se agregan 10 ml de disolvente (segn diseo) y se agita la muestra (multipoint
magnetic stirrer, S.B.S), a 8000 rpm durante 1 minuto para garantizar que la misma se
distribuyera uniformemente. Luego se completa hasta 25 ml , volumen final de extraccin.
Las extracciones se realizan en un bao a temperatura constante y agitacin a 3000 rpm
(multipoint magnetic stirrer, S.B.S). La concentracin del disolvente (etanol en agua),
tiempo y temperatura de extraccin estn determinadas por el diseo experimental
realizado. Los extractos se filtran (papel de filtro Whatman No 1001-110) y luego se
almacenan a-20C hasta su cuantificacin.

Polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales fue determinado espectrofotomtricamente, siguiendo el
mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965), ligeramente modificado y
adaptado a microplacas. Se toman muestras de la soluciones de extracto y se diluyen 1:4
(V:V) (7,7 % en volumen), se agrega el reactivo Folin-Ciocalteu (4% en volumen) y una
solucin de carbonato de sodio al 20% (30,8% en volumen) y el resto con agua Milli-Q. Se
deja reaccionar durante 1 hora en la oscuridad y se mide la absorbancia a =765 nm.

Capacidad de Absorcin de Radicales de Oxgeno (ORAC)

Las muestras del extracto obtenido se diluyen 1:200. Estas se colocan en una microplaca
(20% en volumen) y se agreg Fluorisceina (8,0310-7M). Se realiz una lectura inicial en el
equipo de anlisis (FLUOstar OMEGA, PerkinElmer, Paris, France), el cual se encontraba a
una temperatura de incubacin de 37,0 C. Una vez realizada esta, se agreg AAPH (0,3 M)
y se continu con las mediciones durante 2 horas hasta obtener una curva. La curva de
calibracin se realiz usando Trolox a diferentes concentraciones.

Diseo Experimental
Se aplica el RSM para optimizar el proceso de extraccin descrito. El diseo es del tipo
central compuesto, con las variables: temperatura (T), concentracin de etanol (%) y tiempo
(t); esto implica un diseo de 20 puntos de los cuales 6 son centrales. El rango empleado
para las variables se determina con el mtodo de ascenso ms pronunciado donde se
estimaron los puntos mximos de cada variable. Para realizar y analizar el diseo se emplea
el software MINITAB, que permite tambin el anlisis de ANOVA. Se usa el modelo
representado por un polinomio de segundo orden para establecer la ecuacin adecuada para
el proceso. El modelo obtenido y los coeficientes de la regresin se consideran significativos
slo cuando si presentan un valor de p < 0,05.

RESULTADOS

La tabla 1 muestra el diseo experimental empleado para determinar las condiciones ptimas
de la extraccin, adems de las respuestas obtenidas para cada tipo de anlisis realizado.

Tabla 1. Diseo experimental. Polifenoles totales en mg GAE/g de

materia seca. ORAC en M/g de materia seca

# Temperatura Conc. etanol (%, Tiempo (min) Polifenoles Totales ORAC

(C) V/V)
1 86,82 45,00 30,00 957,38 129,11
2 60,00 30,00 25,00 810,29 120,29
3 80,00 60,00 35,00 903,10 126,56
4 70,00 45,00 30,00 1099,54 151,98
 5 70,00 45,00 30,00 1080,91 147,88
6 70,00 45,00 30,00 1076,49 144,82
7 70,00 45,00 30,00 1085,34 147,24
8 70,00 45,00 38,41 1013,20 145,60
9 60,00 60,00 35,00 954,44 136,79
10 60,00 30,00 35,00 897,28 119,50
11 53,18 45,00 30,00 935,07 126,58
12 70,00 19,77 30,00 766,25 113,52
13 70,00 45,00 21,59 982,68 139,44
14 70,00 45,00 30,00 1086,32 152,40
15 80,00 30,00 35,00 890,76 136,56
16 60,00 60,00 25,00 919,56 140,39
17 80,00 60,00 25,00 958,66 147,53
18 70,00 45,00 30,00 1077,47 148,51
19 70,00 70,23 30,00 940,17 133,84
20 80,00 30,00 25,00 929,95 132,69

Se observa que la temperatura y la concentracin de etanol del solvente tienen efecto sobre
la variable respuesta. Adems, al incrementar la concentracin de etanol la cantidad de
polifenoles totales y ORAC descienden coincidiendo con los resultados de Ballard, que para
estos compuestos antioxidantes observ un decrecimiento del 37,3 % (Ballard et al., 2009).

Tabla 2. Coeficientes de las regresiones y valores de R obtenidas

para Polifenoles Totales y ORAC

Coeficientes de regresin Polifenoles Totales ORAC

Constante -5281,13 -571,58
Temperatura (C) 94,83 12,11
Conc. etanol (%) 47,15 7,02
tiempo (min) 125,23 8,33
Temperatura (C)*Temperatura (C) -0,52 -0,07
Conc. etanol (%)*Conc. etanol (%) -0,38 -0,04
tiempo (min)*tiempo (min) -1,35 -0,07
Temperatura (C)*Conc. etanol (%) -0,1 -0,03
Temperatura (C)*tiempo (min) -0,54 -0,03
Conc. etanol (%)*tiempo (min) -0,11 -0,05
R2 0,98 0,92

Los modelos obtenidos para la cantidad de polifenoles totales (1) y el ORAC (2) se muestran,
a continuacin:

(1)

(2)

Donde, Y PT: cantidad de polifenoles totales, Y ORAC: valores de ORAC, T: temperatura, C:

concentracin, y t: tiempo.

El modelo de polifenoles totales presenta un valor de p menor de 0,05 para las regresiones
lineal y cuadrtica y se observa que en la interaccin Ct, el valor de p > que 0,05
estableciendo la no significancia de sta en la respuesta estudiada. El modelo obtenido
posee un R2 satisfactorio (Tabla 2) y una falta de ajuste < 0,05 demostrando que puede ser
utilizado para predecir dicha respuesta (Ballard et al., 2009). Para la ecuacin del ORAC, el
trmino cuadrtico para el tiempo y las interacciones del tiempo con la concentracin y
temperatura, presentan valores de p>0,05 lo que muestra no ser significantes en el proceso
de extraccin. Este modelo, presenta un valor de R2 menor que el anterior de polifenoles
totales y una falta de ajuste cercano al 0,05 lo cual indica que quizs no sea adecuado para
la prediccin de la respuesta.
 Grfica de superficie de Pol. Totales vs. tiempo (min); Temperatura
Valores fijos
C onc. etanol (%) 45

1100

1000
P ol. T otales
900

800 35
30
tiempo ( min)
50 25
60
70 20
80
T emper atur a ( C )

Figura 1. Superficie de respuesta para la cantidad de polifenoles totales

frente a la temperatura (C) y el tiempo (min).

Grficas de contorno de Pol. Totales

Conc. etanol (%)*Temperatura (C) tiempo (min)*Temperatura (C)
Pol. Totales
< 600
60 35 600 700
700 800
800 900
30 900 1000
40 > 1000

25 Valores fijos
Temperatura (C ) 70
20 C onc. etanol (%) 45
60 70 80 60 70 80 tiempo (min) 30
tiempo (min)*Conc. etanol (%)

35

30

25

20 40 60

Figura 2. Contornos de respuesta. Concentracin de etanol y tiempo frente a

la Temperatura; y concentracin de etanol frente al tiempo.

En las grficas de superficie (Figura 1) y de contorno (Figura 2) para la cantidad de

polifenoles totales, se observan puntos mximos alrededor de 70C, 45 % y 30 min,
indicando que la cantidad de polifenoles va en aumento a medida que se incrementan las
variables, pero luego de alcanzado este mximo decrece el valor, debido quizs al deterioro
de los antioxidante presentes en la muestra (Pompeu et al., 2009). Este comportamiento
tambin fue observado en la aplicacin de mtodo de ascenso ms rpido.

Por otra parte, para el ORAC el comportamiento es el mismo, se va incrementando el valor

de ste para luego decrecer, como se observa a continuacin (Figura 3 y 4).

Grfica de superficie de ORAC vs. tiempo (min); Temperatura (C)

Valores fijos
C onc. etanol (%) 45

150

140
O RA C
130

35
120
30
tiempo ( min)
50 25
60
70 20
80
T emper atur a ( C )

Figura 3. Superficie de respuesta para los valores de ORAC frente a la

temperatura (C) y el tiempo (min).

Grficas de contorno de ORAC

Conc. etanol (%)*Temperatura (C) tiempo (min)*Temperatura (C)
ORA C
< 90
60 35 90 100
100 110
110 120
30 120 130
40 130 140
140 150
25 > 150

20 Valores fijos
60 70 80 60 70 80 Temperatura (C ) 70
tiempo (min)*Conc. etanol (%)
C onc. etanol (%) 45
tiempo (min) 30
35

30

25

20 40 60

Figura 4. Contornos de respuesta para los valores de ORAC.

Concentracin de etanol y tiempo frente a la Temperatura; y
concentracin de etanol frente al tiempo.
CONCLUSIONES

Para las condiciones estudiadas, usando etanol, es posible encontrar mximos en las
superficies de respuesta, con valores de R2 aceptables. Por otra parte, existe una relacin
entre los polifenoles totales y el ORAC, dado que, tienen puntos mximos perecidos. Adems
se evidencia el efecto de la temperatura y la concentracin de etanol en las respuestas
obtenidas.

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