Pada praktikum kali ini uji pirogen menggunakan LAL (Limulus Amoebocyte

Lysate) dengan metode clotting gel. Prinsip metode clotting gel ini adalah LAL
menggumpal jika bereaksi dengan endotoksin. Endotoksin adalah toksin yang
dihasilkan oleh bakteri gram negative. Semua endotoksin bersifat pirogen tetapi
tidak semua senyawa pirogen merupakan endotoksin. Alat yang digunakan yaitu
Pyrotell STV (Single Test Vial) yang memiliki sensitifitas 0,125 eu/ml. sedangkan
sampel yang digunakan yaitu cairan infus glukosa yang telah dibuat pada
praktikum sebelumnya. Produk cairan infus termasuk produk parenteral yang
harus steril karena pemberian langsung ke sirkulasi darah, namun kadang produk
parenteral dapat terkontaminasi oleh endotoksin yang tidak hilang saat proses
sterilisasi sehingga perlu dilakukan uji pirogen untuk sediaan-sediaan parenteral
untuk mengetahui ada tidaknya endotoksin yang terdapat pada sediaan. Uji LAL
memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda terhadap invasi
bakteri gram negative. Pertama-tama sebelum digunakan, STV disimpan terlebih
dahulu di lemari pendingin pada suhu -20 agar STV tidak terkontaminasi
mikroorganisme. Praktikum kali ini merupakan pengujian terhadap pirogen
sehingga tempat bekerja harus aseptis yaitu di kelas A atau Laminar Air Flow
karena LAF memiliki pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga
merupakan tempat yang steril. Selanjutnya sebelum memulai kerja, nyalakan
lampu UV terlebih dahulu untuk membunuh mikroorganisme. Setelah lampu UV
dimatikan, nyalakan lampu neon yang merupakan lampu untuk bekerja dan
blower untuk mengatur sirkulasi udara. Ketika lampu neon dan blower sudah
dinyalakan artinya LAF sudah dapat digunakan. Pertama-tama masukkan 0,2 ml
cairan infus glukosa yang akan diuji pirogenitasnya ke dalam STV LAL
menggunakan syringe steril, di dalam STV tersebut sudah terdapat pirotel yang
merupakan reagen LAL. Setelah pemberian larutan uji, pirotel akan larut oleh
larutan uji dan selanjutnya STV dimasukkan ke dalam incubator pada suhu 37
selama 60 menit hal ini bertujuan untuk memberikan suhu dan lingkungan yang
optimal agar pirotel dan endotoksin dapat bereaksi dengan baik. Setelah masa
inkubasi selesai, STV dibalik secara perlahan-lahan untuk melihat ada tidaknya
gel yang terbentuk. Tabung harus dibalik secara perlahan karena jika terlalu keras
ketika membalik STV maka gel yang terbentuk mungkin dapat rusak sehingga
hasil pengujian tidak akan akurat. Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit
kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion
yang berinteraksi menyebabkan terjadinya penggumpalan. Endotoksin gram
negative mengkatalisis aktivasi proenzim dalam LAL. Kecepatan awal aktivasi
ditentukan oleh konsentrasi endotoksin. Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim
koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal yang
juga terdapat pada LAL yang menghasilkan koagulin. Sekali terhidrolisis,
koagulin yang dihasilkan bergabung dan membentuk suatu gumpalan gel.