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Cdigo: MET POA/11/02/01

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Laboratrio de Produtos de Origem Animal
Emisso: 28/11/2013
Mtodo de Ensaio - MET
Determinao de Nitrognio Total em Leite e derivados Lcteos pelo mtodo
de Micro-Kjedahl
1 Escopo
Este MET tem como objetivo determinar os procedimentos para o ensaio Determinao de
Nitrognio Total em Leite e Derivados Lcteos utilizando o mtodo de Micro-Kjedahl.
aplicvel para:
a) leite fluido in natura ou nas apresentaes integrais, semidesnatadas e desnatadas, tratadas
por processos de UHT ou pasteurizao;
b) derivados lcteos desidratados (leite em p, casena, caseinatos e soro);
c) queijos;
d) creme e doce de leite;
e) bebidas lcteas e leite fermentado.

2 Fundamentos
A frao nitrogenada do leite possui nitrognio de duas fontes: (1) protico, da casena e das
protenas do soro e, (2) nitrognio no protico NNP. A casena o principal componente da
frao protica do leite perfazendo cerca de 80% do total das protenas presentes no produto. Ela
encontra-se na forma de um complexo, o fosfocaseinato de clcio. Outros componentes proticos
encontrados no leite so as protenas do soro lcteo que constituem cerca de 20% da frao
protica do leite e, portanto, juntamente com a casena perfazem praticamente o total das protenas
presentes no leite. Entre as protenas do leite encontra-se nmero bastante elevado de enzimas
(fosfatase, lactoperoxidase, catalase, etc.), muitos dos quais tem notvel importncia na
industrializao do leite e seus derivados. Os compostos nitrogenados presentes na frao de NNP
so basicamente produtos finais do metabolismo do nitrognio e representam de 5 a 6% do
nitrognio total. Entre estes compostos esto uria, peptdios, aminocidos, cido rico, creatina e
creatinina.
A protena do leite comumente expressa como protena total ou protena bruta e sob o ponto
de vista analtico, corresponde ao teor percentual de nitrognio total (NT) multiplicado pelo fator de
converso 6,38 conseqente do teor mdio de 15,67% de nitrognio nas protenas do leite.
O mtodo de Kjeldahl baseia-se na transformao do nitrognio da amostra em sulfato de
amnio atravs da digesto com cido sulfrico e posterior destilao com liberao da amnia,
que fixada em soluo cida e titulada.
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Determinao de Nitrognio Total em Leite e derivados Lcteos pelo mtodo
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Este mtodo dividido em trs etapas principais: a digesto, destilao e titulao.

a) Digesto: nesta etapa ocorre o aquecimento da amostra com cido sulfrico concentrado at
que o carbono e hidrognio sejam oxidados. Com a finalidade de aumentar a temperatura de
ebulio do cido e aumentar a velocidade de oxidao da matria orgnica adicionada
reao uma mistura cataltica.
Durante a digesto, o carbono transformado em dixido de carbono (CO2) e o hidrognio em
gua (H2O). O nitrognio da protena reduzido e transformado em sulfato de amnio, conforme
reao abaixo:
H 2 SO4
Matria orgnica SO3 + SO2 + CO2 + H 2O + ( NH 4 ) 2 SO4

b) Destilao: o objetivo desta etapa transformar o nitrognio presente na soluo na forma de
sulfato de amnio (NH4+) para NH3 gasoso. Com adio de NaOH concentrado e aquecimento,
ocorre a liberao da amnia que separada da mistura por destilao. O gs ento reage com
uma soluo de cido brico, formando borato de amnio.

( NH 4 ) 2 SO4 + 2 NaOH


Na2 SO4 + 2NH 3 + H20

NH 3 + H 3 BO3 NH 4 H 2 BO3

c) Titulao: a etapa final consiste na titulao do borato de amnio com uma soluo de cido
sulfrico padronizada.

2 NH 4 H 2 BO3 + H 2 SO4 ( NH 4) 2 SO4 + 2 H 3 BO3

Quanto maior o volume de cido sulfrico gasto na titulao, maior a quantidade de nitrognio
presente na amostra.

3 Reagentes, padres e materiais

3.1 Reagentes:
1) cido sulfrico (H2SO4) p.a.;
2) Indicador misto: pesar cerca de 0,132 g de vermelho de metila (C15H15N3O2) e cerca de 0,06
g de verde de bromo cresol (C21H14Br4O5S). Dissolver em aproximadamente 200 mL de
soluo de lcool etlico a 70 % (v/v). Filtrar se necessrio e guardar em frasco mbar. O
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indicador misto pode ser incorporado soluo de cido brico a 4 % na proporo de 8 mL
por litro;
3) Mistura cataltica:
a) Sulfato de potssio (K2SO4) p.a., sulfato de sdio anidro (Na2SO4) p.a. ou bissulfato de
potssio (KHSO4) p.a.;
b) Sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) p.a.;
4) Misturar (a) e (b) na proporo de (10+1), triturando em gral de porcelana at obter um p
fino.
5) Soluo de cido brico (H3BO3) a 4 % (m/v): pesar cerca de 4 g de cido brico p.a.,
transferir para um bquer de 250 mL, adicionar aproximadamente 80 mL de gua e aquecer
sob agitao branda at dissoluo. Resfriar, transferir para balo volumtrico de 100 mL e
completar com gua. Filtrar se necessrio;
6) Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) a 50 % (m/v);
7) Soluo padro de cido sulfrico (H2SO4) 0,1 N ou soluo padro de cido clordrico (HCl)
0,1 N;
8) Zinco metlico granulado;
9) Anti-espumante (talco, parafina ou silicone).

3.2 Materiais
1) Tubo de Kjeldahl de 100 mL;
2) Bquer de 250 mL;
3) Buretas de 25 ou 50 mL;
4) Frasco de Erlenmeyer de 125 ou 250 mL;
5) Esptula;
6) Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrognio);
7) Pipeta graduada de 1 e 10 mL ou material volumtrico similar;
8) Provetas de 50 mL ou material volumtrico similar;
9) Tenaz metlica.
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4 Equipamentos
1) Bloco digestor e destilador micro-Kjeldahl;
2) Balana analtica.

5 Precaues analticas
1) Verificar as condies do aparelho de destilao com soluo padro de sulfato de amnio
((NH4)2SO4) p.a., cuja recuperao deve ser no mnimo 99,5 % em nitrognio.
2) Para produtos muito gordurosos, digerir a amostra com adio de um anti-espumante.
3) Para a pesagem de algumas amostras, como por exemplo, doce de leite, necessrio
utilizar papel livre de nitrognio.
4) Como ocorre o desprendimento de vapores irritantes pelo aquecimento do cido, realizar a
etapa de digesto da amostra dentro de uma capela de exausto.

6 Procedimentos
O mtodo usualmente classificado em macro, semi-micro e micro Kjeldahl conforme a
quantidade absoluta de protena na amostra que vai sofrer digesto. No laboratrio utiliza-se o
procedimento micro-Kjeldahl e realiza a determinao em duplicata.

6.1 Mtodo micro Kjeldahl

6.1.1 Digesto ou mineralizao:
1) Pesar em balana analtica exatamente a quantidade de amostra de acordo com a tabela I e
transferir para tubo de Kjeldahl;
2) Adicionar cerca de 2,5 g de mistura cataltica e 7 mL de cido sulfrico p.a.;
3) Aquecer o tubo em bloco digestor da seguinte forma: no caso de amostras lquidas, aquecer,
a princpio lentamente (iniciar com temperatura em torno de 120C por cerca de 30 minutos);
logo aps, aumentar para 250C (em torno de 30 minutos) elevando gradativamente para
450C at que o lquido se torne lmpido e transparente, de tonalidade azul-esverdeada.
Para amostras com baixa umidade (ex. leite em p), o aquecimento iniciado a 250C (em
torno de 30 minutos) e elevar a 450C da mesma forma descrita para amostras lquidas.
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Tabela I Quantidades necessrias para o ensaio Determinao de Nitrognio Total em Leite e
Derivados Lcteos

Item de ensaio Quantidade de amostra (g)

Leite fluido e bebida lctea 1,5-2,0

Leite em p, casena, caseinatos, soro

0,25-0,3
desidratado, queijo e doce de leite

Creme de Leite 1,0

Leite fermentado 1,5

6.1.2 Destilao:
1) Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo cerca de 20 mL de soluo de cido brico a
4 % com 4 ou 5 gotas de soluo de indicador misto (erlenmeyer receptor do destilado);
2) Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar a soluo de hidrxido de sdio a 50 %
at que a mesma se torne negra (cerca de 20 mL);
3) Proceder destilao. Recolher o volume necessrio para a completa destilao da amnia
(aproximadamente 75 mL). A soluo coletora mantida fria durante a destilao.

6.1.3 Titulao:
Titular com soluo de cido sulfrico 0,1 N ou soluo de cido clordrico 0,1 N at a viragem
do indicador (colorao verde leve tom rseo - avermelhado).

6.2 Verificao do destilador atravs da avaliao de recuperao de nitrognio na

destilao
Realizar a verificao das condies do aparelho de destilao com soluo padro de um sal
de amnio, cuja recuperao deve ser no mnimo 99,5% em nitrognio conforme procedimento
descrito na IU do destilador.
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7 Resultados

Os dados brutos obtidos na determinao do nitrognio total so registrados em formulrios

especficos descritos no POP POA/06 Controle de Itens de Ensaio Leite e Derivados Lcteos e
inseridos em planilhas eletrnicas conforme IT POA/04 para que os resultados sejam calculados
automaticamente.
O clculo obtido atravs da seguinte frmula
V x N x 0,014 x100
% nitrognio total =
m
Onde,
V = volume da soluo de cido sulfrico 0,1 N, ou soluo de cido clordrico 0,1 N, gasto na
titulao aps a correo do branco, em mL;
N = normalidade terica da soluo de cido sulfrico 0,1 N ou soluo de cido clordrico 0,1
N;
f = fator de correo da soluo de cido sulfrico 0,1 N ou soluo de cido clordrico 0,1 N;
m = massa da amostra, em gramas.
O mtodo de Kjeldahl quantifica o nitrognio total da amostra. Para que seja obtido o teor em
protenas, aplica-se um fator, chamado fator de converso Kjeldahl.

% protidios = % nitrognio total F

F = fator de converso da relao nitrognio/protena, F = 6,38.

Como a determinao feita em duplicata, expressar o resultado da mdia (teor de protenas
%) com uma casa decimal.

7.1 Critrios para a repetio do ensaio:

1) Se a diferena entre as duplicatas for maior do que 3% repetir a determinao de nitrognio
com uma nova alquota da amostra.
2) Outro critrio considerado em conta numa eventual repetio do ensaio o fechamento
centesimal dos componentes do leite. A soma dos teores de acares (lactose), protenas e
cinzas (resduo mineral fixo) deve ser prximo ao ESD: quando a diferena entre estes
resultados for superior a 5%, a determinao dos glicdios redutores em lactose repetida
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para confirmao, se possvel em nova embalagem. Se confirmar o resultado, repetir ento o
EST, a gordura, a protena e cinzas.

8 Arquivamento dos registros

Os formulrios utilizados nesta metodologia so arquivados conforme procedimento descrito no
POP POA/06 Controle de Itens de ensaio Leite e Derivados Lcteos e IT POA/04 Uso de
Planilha Eletrnica na Reviso de Clculos de Dados Brutos nas Anlises de Leite, Derivados
Lcteos, gua e Mel.

9 Referncias
BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Regulamentos Tcnicos de
Identidade e Qualidade dos Produtos Lcteos. Portaria 146, 07/03/96. Braslia: Ministrio da
Agricultura, 1996.
BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Regulamento Tcnico para
Fixao de Identidade e Qualidade de Doce de Leite. Portaria 354, 04/09/97. Braslia: Ministrio
da Agricultura, 1997.
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuria. "Padres de Identidade
e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados". Resoluo 5, 13/11/00. Braslia: Ministrio da
Agricultura, 2000.
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Regulamentos Tcnicos de Produo, Identidade e
Qualidade do Leite. Instruo Normativa 51, 18/09/02. Braslia: Ministrio da Agricultura, 2002.
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuria. Regulamento Tcnico
de Identidade e Qualidade de Leite de Cabra. Instruo Normativa 37, 31/10/00. Braslia:
Ministrio da Agricultura, 2000.
BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuria. Mtodos Analticos
Fsico-Qumicos para Controle de Leite e Produtos Lcteos. Instruo Normativa 68, 12/12/06.
Braslia: Ministrio da Agricultura, 2006.

10 Anexos
No aplicvel.
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11 Alteraes
Alterao da formatao dos marcadores nos itens 3, 4 e 5.
Excludo a letra c do item 7.1 (critrios para a repetio do ensaio) da verso anterior por no
ter relao com o procedimento descrito neste documento.
Excludo o anexo A da verso anterior que apresentava os valores estabelecidos na legislao,
pois os mesmos podem sofrer alteraes na vigncia deste documento.
Pequenas alteraes no texto para facilitar a compreenso do MET.

12 Responsabilidades
de responsabilidade do RT ou seu substituto do POA assegurar que os analistas que
utilizarem este MET tenham sido treinados e capacitados para sua execuo e o mesmo esteja
sendo corretamente seguido.

Elaborao/Reviso: Aprovao: Verificao:

Rita Beatriz Andrade - POA Tiago Charo de Oliveira - POA Juliana Nichele Kich - UGQ
Data: 27/11/2013 Data: 28/11/2013 Data: 28/11/2013