Colorantes Biolgicos

Las bacterias son casi incoloras por lo cual resulta difcil verlas en el microscopio; hay
que teirlas para distinguir los pormenores de sus estructuras externa e interna, que
sirven de base para su identificacin y clasificacin.
En los primeros aos de la bacteriologa predominaban las sustancias tintreas
naturales, de las que actualmente se emplean solo unas pocas. Gradualmente las han
reemplazado los colorantes artificiales o sintticos. Como los primeros tintes de esta
clase se obtuvieron a partir de la anilina, es corriente llamarlos tintes o colorantes de
anilina, a pesar de que muchos de ellos no proceden de este compuesto ni tienen con
l relacin; sera mejor denominarlos colorantes de alquitrn, ya que proceden en su
totalidad de una o ms sustancias contenidas en el mismo.
Los colorantes de alquitrn se pueden considerar derivados del compuesto cclico
benceno o benzol.

Colorantes
Puede definirse un tinte como una sustancia o compuesto orgnico que tiene los
grupos cromforo y auxocromo ligados al ncleo bencnico. Un grupo cromforo
comunica al cuerpo la propiedad del color. Los compuestos de benceno que tienen
radicales cromforos se denominan cromgenos. Estos compuestos, aunque poseen
color, no son tintes, pues carecen de afinidad o capacidad para unirse a fibras o
tejidos; el color puede eliminarse fcilmente por medios mecnicos. Para que sean
tintes es necesario que contengan, no solo el grupo cromforo, sino tambin otro que
les comunique la propiedad de disociacin electroltica. Los grupos de esta segunda
clase son los auxocromos, que proporcionan al compuesto la cualidad de formar sales.
El proceso de tincin supone una reaccin de intercambio de iones entre el colorante y
los sitios activos de la superficie o del interior de la clula, de tal forma que, los iones
teidos del colorante reemplazan los iones de los componentes celulares.

Colorantes cidos y bsicos

Los grupos auxocromos son cidos (OH) o bsicos (NH2). Los tintes cidos se ionizan
y dan a la porcin colorante de la molcula un anin o carga elctrica negativa: los
tintes bsicos, al ionizarse, ceden a esa porcin de la molcula un catin o carga
elctrica positiva.
El grupo amino es bsico porque su tomo de nitrgeno (N) pasa a pentavalente por
adicin de agua o de un cido.
El grupo hidroxilo es dbilmente acido por que proporciona hidrogeniones por
disociacin. El grupo amino (NH2) es ms fuerte como base que el grupo (OH) como
acido. Cuanto mayor sea el nmero de uno de estos grupos en un compuesto, ms
fuerte ser el cido o la base que formen. Si ambos radicales se hallan en la molcula,
predomina el carcter bsico del radical amnico.

Tipos de Cromforos
a) Bsicos o catinicos: La carga del ion cromforo es positiva. Corresponde
a colorantes que tien estructuras nucleares o similares. Los cromforos
 bsicos comprenden los grupos azo, acina e indamina. Algunas de estas son:
Fucsina Bsica, Cristal Violeta o Violeta de Genciana, Azul de Metileno, etc.
Frecuentemente se aade un mordiente que ayuda a fijar el colorante a las
estructuras

El grupo indamnico: Se halla en las indaminas, tiacinas, y otras sustancias.

Muchos de estos colorantes tienen dos anillos bencnicos unidos al tomo de
nitrgeno; uno de los grupos muestra estructura quinonica.
En las tiacinas, los anillos bencnicos estn unidos adems por un tomo de azufre.
El ncleo de tiacina ms sencillo tendr la siguiente constitucin:

S NH
N

Un colorante muy conocido con esta base tiacnica es el azul de metileno.

b) cidos o aninicos: La carga del radical cromforo es negativa.

Corresponden fundamentalmente a colorantes citoplasmticos, ya que los
citoplasmas de las clulas se consideran bsicos, captando muy bien los
colorantes cidos. Suelen usarse en coloraciones de contraste. Entre estos
estn: las eosinas, las auraminas, etc.

Los cromforoscidos comprenden el grupo nitro y el anillo quinonico.

1.- El grupo nitro (NO2) se halla en muchos compuestos; un ejemplo de ellos es el
cido pcrico.
2.- El ncleoquinonico

Se encuentra en muchos colorantes, como indaminas, xantenos, di y trifenilmetanos.

Pertenecientes a este grupo algunos muy conocidos: cidoroslico, fucsina, violeta de
metilo, verde de metilo, violeta cristal, p-rosanilina, etc.

c) Neutros: son sales compuestas de un colorante acido y un colorante bsico

como el Eosinato azul de metileno, que posee propiedades cidas y bsicas.
Se usan usualmente para coloraciones particulares.
 d) Indiferentes: Son colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol donde
no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa, pero, tampoco tienen un
carcter neutro, son los colorantes de los lpidos, se usa a menudo para revelar
la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Ejemplo: Sudan III, Sudan
Negro, etc.

Teoras de la tincin
a) Teora Fsica: Puede decirse que un fenmeno o proceso fsico es una
reaccin entre dos sustancias sin formacin de un nuevo compuesto. Los
partidarios de la teora fsica exponen que todas las reacciones de tincin
pueden explicarse como fenmenos de capilaridad, osmosis, adsorcin y
absorcin. No hay unanimidad respecto al aumento de peso que
correspondera a cada agente, aunque todos convienen en que estos
participan en el proceso de tincin.

b) Teora qumica: Esta probado que algunas partes celulares tienen reaccin
acida, y otras la dan alcalina, lo que ha inducido a los qumicos a explicar los
fenmenos de tincin sobre bases puramente qumicas. Los colorantes de
alquitrn son aninicos (cidos) o catinicos (bsicos); esto es, la parte
colorante de la molcula es el ion negativo o el positivo. Los partidarios de esta
teora mantienen que los componentes cidos de la clula (ncleos, cromatina)
se unen o reaccionan con los colorantes bsicos, y que, recprocamente, las
porciones de reaccin alcalina (citoplasma) reaccionan con los colorantes
cidos. Sin embargo, el proceso no es tan simple como parece, y
probablemente no explica por completo el fenmeno.
Se sabe que las bacterias poseen normalmente una carga elctrica negativa.
McCalla (1940 a, b) demostr que las bacterias atraen los iones cargados
positivamente, segn la ecuacin

(n bases+) + (Bn- ) (n bases+) ( Bn-)

Donde B representa la clula bacteriana, y n, un nmero desconocido de
cargas inicas negativas.
McCalla (1941) descubri que cuando una bacteria con carga negativa se trata
con magnesio, la base es absorbida por la clula hasta que se origina un
sistema neutro. Dicho de otro modo, los iones magnesio cargados
positivamente son atrados por las valencias negativas de la clula bacteriana.
En otra comunicacin posterior, McCalla y Clark (1941) exponen que los
colorantes bsicos son adsorbidos a valores pH por encima del punto
isoelctrico, y los colorantes cidos, a valores pH por debajo de ese punto.
Segn McMalla, la reaccin de los colorantes con las bacterias es un proceso
de intercambio por adsorcin que alcanza proporciones estequiometricas. Por
el lado bsico del punto isoelctrico, los colorantes bsicos actan como
cationes que reemplazan iones con carga anloga en el sistema bacteriano;
por el lado acido, los colorantes cidos se conducen como aniones que
desalojan de igual modo iones con carga similar de tal sistema.
En resumen, puede decirse que actualmente parece contarse con
elementos de juicio suficientes para sealar que la tincin no es un
proceso completamente fsico ni qumico, sino que participa de ambos
aspectos.

Colorantes Simples
Es aquella que contiene un colorante nico disuelto en el disolvente; se aplica
a las bacterias en una sola operacin. Las soluciones simples que
probablemente se emplean ms para tinciones usuales son las diluidas de
fucsina fenificada, violeta cristal y azul de metileno.

a) Colorante de fucsina: Miembro del grupo de triaminotrifenilmetano,

con frmula qumica: C20H17N3Na2O9S3. Es una sustancia colorante, de
color rojo tirando a prpura. La fucsina bsica decolora con el sulfito y es
empleada en qumica como indicador para detectar aldehdos, ya que estos
toman color rojo-violeta con este colorante. Uno de sus principales usos es
en la tincin Gram, coloreando bacterias Gram (-) en rojo. Tambin se
utiliza en el diagnstico de la tuberculosis

b) Colorante de Violeta Cristal: El violeta cristal es tambin un

miembro del grupo de triaminotrifenilmetano, fuertemente bsico.
Qumicamente es hexametil-p-rosanilina. Se conoce tambin por los
nombres de violeta de metilo 10 B, violeta de genciana, violeta hexametilo,
etc. Produce el matiz ms intenso de las p-rosalinas, y, entre todos los
compuestos violetas, est considerado como el colorante simple ms
satisfactorio para usos generales.
A mayor metilacin, el color violeta ser ms oscuroun violeta ms oscuro:

Tetrametilo; ms conocido como Violeta de metilo 2B, tiene usos en la qumica

y la medicina.
Pentametilo; tambin conocido como Violeta de metilo 6B
Hexametilo; es conocido como Violeta de metilo 10B, o especficamente violeta
cristal. Es mucho ms oscura que la 2B, y an ms oscura que la 6Bk

Con respecto a las tinciones, suele usarse e la triple coloracin Flemming (con Orange
G y safranina) en la tincin Gram y en tinciones histolgicas.

c) Colorante de Azul de Metileno: El azul de metileno es tetrametil-

tionina, colorante bsico, pertenece al grupo de los colorantes de
quinonimina, y dentro de este al de las tiacinas. tiene la siguiente formula:

El azul de metileno del comercio suele ser una sal doble de colorante y
cloruro de zinc; como este metal es toxico, no debe usarse tal producto para fines
medicinales. Es acaso el colorante ms usado en trabajos biolgicos. Por su condicin
fuertemente bsica, tie con mucha intensidad ncleos y grnulos de cido nucleicos.
Si a una bacteria saturada de magnesio se aade azul de metileno, este sustituye al
metal, de acuerdo con la ecuacin:

(1/2nMg++) (Bn-) + nS+Cl- (nS+Bn-) + 1/2 nMgCl2

En donde S representa el colorante (ion azul de metileno). El magnesio es desalojado
por el azul de metileno en proporciones estequiometricas.
Factores que afectan la tincin

a) Pureza del colorante: A un mayor grado de impurezas, habr un mayor

error, y por lo tanto una menor calidad en la tincin.

b) Concentracin del colorante: A una mayor concentracin del colorante,

habr un mayor error en la tincin, de misma forma que a menor
concentracin. Los valores ideales estn entre 0,2 y 2%

c) EL pH del colorante: El pH del colorante es elemental, ya que determinar

que el colorante pueda fijarse.

d) Conservacin del colorante: Siempre debe estar ubicado en lugares

frescos, secos y oscuros, adecuadamente envasados.

e) Elaboracin: La elaboracin de los colorantes se da a travs de soluciones

acuosas o hidroalcohlicas y polvos colorantes en cantidades exactas

f) Tcnica empleada: Se debe ser cuidadoso y escrupuloso a la hora de

realizar la tincin, cuidando usar instrumentos limpios y desengrasados; y no
mezclar los colorantes

g) Temperatura: Se debe aplicar una determinada temperatura segn se

indique, lo usual es usar el temperatura ambiente, como la tincin Gram; pero
tambin en algunos casos se necesita temperaturas altas, como en el verde
malaquita en la tincin de esporas, para facilitar la penetracin del colorante a
las estructuras

h) Cantidad de muestra: Para la tincin se debe usar una cantidad

representativa y homognea, ni demasiado por que quedar sobre acumulado,
ni muy poco, porque no habr distincin. Para la tincin simple siempre se
debe poner el tinte en exceso, por el tiempo determinado.

i) Realizar correctamente el frotis: Para esto, se debe realizar una buena

fijacin, ya que si se hace incorrectamente, al adicionar el colorante se
arrastraran los microorganismos y no se visualizarn

j) Soluciones mordientes: A veces es necesario utilizar una solucin

mordiente para poder fijar mejor el colorante. En la tincin Gram se utiliza el
mordiente lugol para fijar al cristal violeta
 k) Tiempos de tincin: Es necesario que a la adicin del colorante o el
mordiente, se mantenga un tiempo preciso, ya que esto puede generar una
tincin excesiva, o al contrario, que no se logre teir adecuadamente.
Usualmente el tiempo se da en un intervalo de uno y diez minutos.

Tinciones Bacterianas
a) Tincin simple:
Necesita un proceso de fijacin previo
Se utiliza un solo colorante (existe muy poca refraccin entre las estructuras a
observar y el medio acuoso)
Permite la visualizacin de la morfologa bacteriana
Se basa en la afinidad de los componentes (las clulas bacterianas en pH
neutros presentan carga negativa)
Usualmente se utilizan colorantes bsicos

Tincin simple con cristal

violeta de Staphylococcus
aureus (100x)

Tincin simple con safranina

de Micrococcus luteus (100x)

b) Tincin negativa:
Parecido a la tincin simple, ya que se usa un solo colorante
No necesita fijacin previa
Se puede observar la morfologa de la bacteria y otras caractersticas
estructurales en un fondo oscuro (Ejm: cpsula)
 Suele utilizar colorantes cidos, ya que debido a su carga negativa, repeler la
carga de los microorganismos (Tinta china, nigrosina)

Tincin de cpsulas de
Azotobacter vinelandii. Las
flechas indican estas
estructuras.

c) Tinciones diferenciales:
Necesita fijacin previa por calor
Utilizacin de dos colorantes, siendo el ltimo de contraste
Permite visualizar morfologa y otras caractersticas (como composicin de la
pared, resistencia a la decoloracin, etc.)
Las ms conocidas con la tincin Gram, la tincin Zhiel-Neelsen y la tincin de
espiroquetas

Tincin Gram de Bacillus

cereus (bacilos gram
positivos) (100x)

Tincin Gram de Escherichia

coli (bacilos gram negativos)
(100x)
 Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-
Neelsen) de Mycobacterium phiel. Las flechas
sealan estos bacilos cido-alcohol
resistentes teidos de rojo (100x)

d) Tinciones estructurales:
Necesitan fijacin previa por calor
Utiliza de dos a ms colorantes
Permite observar caractersticas morfolgicas y estructurales (Ejm: esporas,
flagelos, cilios, cpsulas, corpsculos metacromticos, etc.)

Tincin de esporas de Bacillus subtilis.

La flecha indica esta estructura en
verde.

e) Tinciones especiales
Tincin de fluorescencia: Se utiliza usando un microscopio de
fluorescencia y un fluorocromo. Los fluorocromos son capaces de emitir
fluorescencia cuando son excitados con una luz de onda adecuada. : la
longitud de onda ptima de excitacin o absorcin y la longitud de onda a la
cual la emisin de su fluorescencia es mxima.
La permeabilidad de sus molculas, permite que algunas de ellas no puedan
atravesar la membrana citoplasmtica, y que otras se puedan difundir
fcilmente hacia el citoplasma celular
Tienen interacciones especficas con una determinada estructura
 Se debe tener en cuenta la capacidad de retencin de la clula respecto al
fluorocromo
Se debe tener en cuenta el pH, ya que algunos fluorocromos funcionan a uno
determinado

i) Tincin de Auramina:
Se utiliza cuando se debe procesar una cantidad de muestras, ya que es un
procedimiento rpido y cmodo
Tiene fijacin selectiva con los cidos miclicos caractersticos de la pared
bacteriana de los organismos del gnero Mycobacterium
Se usa con luz UV y con un colorante de contraste no fluorescente,
permanganato de potasio

ii) Tincin de naranjo de acridina:

Permite un examen directo en la muestra o campo de cultivo
Es til cuando existen pocos microorganismos (LCR, hemocultivo) o hay restos
celulares que interfieren con la visualizacin
Tiene fijacin selectiva con el ADN bacteriano tomando una coloracin naranja
brillante

Tincin con plata:

Usa plata para modificar selectivamente la apariencia de un objeto
til para resaltar la presencia de microorganismos como: Pseudomonas,
Legionella, Leptospira, H. pylori
Tincin de Papanicolaou:
Mtodo de tincin policrmico que consta de una tincin nuclear y un contraste
citoplasmtico
Utiliza tres colorantes: Hematoxilina, Orange G y Eosina alcohlica

Tincin de Escherichia coli, bacterias teidas con yoduro de

propicio (en rojo) y bacterias teidas con SYTO 9 (en verde)
Morfologa microscpica bacteriana
El tamao de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 m, pudiendo llegar en algunos tipos
a 10 m. Las bacterias de inters mdico tienen un tamao entre 0.4 y 2 m. Solo son
visibles entonces, al microscopio ptico o microscopio electrnico.
Para observarlas con el microscopio ptico se usa el objetivo de inmersin (100X),
sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersin) en el preparado a
observar.
A modo comparativo, una clula eucariota mide ms de 5 m (un eritrocito tiene un
dimetro de 7m), mientras que un reovirus mide menos de 0.1m. Su tamao
pequeo determina una relacin entre la superficie y el volumen elevado, con alta tasa
metablica.
La forma est determinada por la rigidez de su pared celular. Se diferencian segn su
forma en cocos (esfricas u ovaladas), bacilos (cilndrica o de bastones; rectos o
curvos) y espirilos (espiral). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras
despus de la divisin celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si
el plano de divisin es nico, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena
(microorganismos del gnero Streptococcus). Si los planos de divisin son muchos, los
cocos pueden agruparse en ttradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos
pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser
redondeados o rectos; pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando
letras chinas (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma
(Vibrio).
 Diplo: En grupos de dos. Coco: forma esfrica

Tetra: En grupos de cuatro. Bacilo: forma de bastoncillo

Estrepto: En cadenas. Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma,

juda o cacahuete.
Estafilo: cocos en agrupaciones
irregulares o en racimo Espirilo: en forma helicoidal rgida o en forma de
tirabuzn.
Espiroqueta: en forma de tirabuzn (helicoidal
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