Un Ingeniero Qumico una

Empresa

CATEDRA : ANALISIS CUANTITATIVO ORGANICO

CATEDRATICO: Ing. ANDRES CORCINO ROJAS QUINTO

ALUMNOS :

MEZA CAHUANA, Mary Cruz. (IQA)

SULLCA ROMERO, Yesenia Nelly. (IQA)

SEMESTRE: V
 OBJETIVOS

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua de microorganismos coliformes

totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
fecales.
Aplicar las tcnicas de cuantificacin de microorganismos totales y comparar con las
tcnicas de determinacin de viables.
 INTRODUCCIN

La determinacin de la calidad bacteriolgica reviste gran importancia en el mbito de la

salud pblica ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando
as epidemias gastrointestinales.

El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o
por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patgenos
(principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la
disentera (Shigella dysenterieae) o el clera (Vibrio cholerae) entre otros.
 MARCO TEORICO

E. coli se acepta de modo general como el indicador ms positivo de contaminacin fecal:

una poblacin de coliformes fecales es posible que contenga una alta proporcin de E. Coli
o sus variantes probablemente de origen fecal reciente. Los coliformes comprenden,
adems de E. coli, las diversas especies de Enterobacter (Aerobacter) y Klebsiella, algunas
de las cuales pueden multiplicarse ,o persistir en hbitat no fecales durante largos perodos.
Estos microorganismos proporcionan una indicacin ms exacta de las contaminaciones
posteriores a los tratamientos industriales y de la eficacia de los sistemas de limpieza y
desinfeccin en las industrias, en los alimentos que han sido sometidos a tratamiento o
procesos suficientes para inactivados.

La aplicacin de fecales que se aplican estos organismos tiene un significado importante.

La contaminacin de un alimento por E. coli lleva implcito el riesgo de que tambin hayan
podido llegar al alimento microorganismos entricos patgenos, haciendo su consum
peligroso. Esta contaminacin se produce de modo general por deficiencias en la limpieza
y desinfeccin de las industrias.

AGUA: UNA SUSTANCIA ESENCIAL Y COMPLEJA

El agua es esencial para la vida y se considera como un alimento. Es la nica sustancia que
en nuestro planeta se puede presentar en los tres estados fsicos. Es imprescindible para la
vida por varias razones: estabiliza la temperatura corporal, porta nutriente y productos de
desecho, es reactivo y medio donde se producen reacciones, es el disolvente universal,
estabiliza la conformacin de los polmeros, etc.
El agua interviene en nuestra alimentacin, en la preparacin de alimentos, pero, adems,
puede ser un vector de grmenes peligrosos.

El agua es indispensable para el organismo humano, que diariamente necesita una cantidad
de uno y medio a dos litros. Parte de esta agua se ingiere en los alimentos; otra porcin se
forma en el organismo por las combustiones de las grasas, los hidratos de carbono y las
protenas; y el dficit, a veces considerable, hay que cubrirlo con el agua de bebida.
Como se indica en el prembulo de la Ley de Aguas; el agua es un recurso natural, escaso,
indispensable para la vida y para el ejercicio de la inmensa mayora de las actividades
econmicas, y es irreemplazable, no ampliable por la mera voluntad del ser huma no. Por
tanto, es un recurso unitario, que se renueva a travs del ciclo hidrolgico.

Desde este punto de vista, no cabe distinguir entre aguas superficiales y subterrneas. Unas
y otras estn ntimamente relacionadas, tienen identidad de naturaleza y funcin y, en su
conjunto, deben estar subordinadas al inters general y puestas al servicio de la nacin. Se
trata de un recurso que ha de estar disponible, no slo en la cantidad necesaria, sino
tambin con la calidad precisa, en funcin de las directrices de la planificacin econmica.
De acuerdo con las previsiones (le la ordenacin territorial y en la forma en que la propia
dinmica social demanda.

Todas estas peculiaridades implican a necesidad de que los instrumentos jurdicos regulen,
actualizadas, las instituciones necesarias, sobre la base de la imprescindible planificacin
hidrolgica y el reconocimiento, para el recurso, de una sola calificacin jurdica, como bien
de dominio pblico estatal.

As, en el B0E 189, de 8 de agosto de 1985, se public la nueva Ley de Aguas, que sustituy
la publicada el 13 de junio de 1879. El objeto de esta ley es la regulacin del dominio pblico
hidrulico, del uso del agua y del ejercicio de las competencias atribuidas al Estado en el
marco de las competencias delimitadas en el artculo 149 de la Constitucin.

Se denomina agua potable a aquella que posee cualidades fsico-qumicas, organolpticas

y microbio lgicas que la hacen apta para el consumo humano. Se diferencia de las aguas
medicinales en el hecho de que stas son aguas con propiedades teraputicas reconocidas
por la ley.

Las diferencias entre unas aguas y otras dependen de las sustancias que lleven disueltas
en suspensin. Al caer y atravesar la atmsfera, el agua (la lluvia disuelve el oxgeno, el
nitrgeno y el cido carbnico, y arrastra los grmenes que flotan Si, accidentalmente, en el
aire hay otros gases, como cido nitroso, amoniaco, gas sulfrico, etc., stos tambin son
disueltos, aunque el agua de lluvia es muy pura y slo contiene indicios de las ltimas
sustancias.

La principal mineralizacin del agua comienza al ponerse en contacto con el terreno, lo cual
vara segn la naturaleza y las condiciones de ste: as, no es lo mismo que el agua
atraviese un terreno grantico que un terreno rico en selenio.

El agua atraviesa las capas porosas del terreno y llega hasta las capas impermeables.
Puede reaparecer en forma de manantial o de fuente. De este modo, as aguas de los ros,
riachuelos, arroyos, etc., que corren al descubierto, tienen condiciones muy distintas a tas
de las aguas subterrneas y, por tanto, tambin difieren en su composicin.

El agua se puede clasificar en:

Aguas de consumo: en este grupo estn el agua de distribucin pblica, el agua potable,
las aguas de captacin individual y las aguas envasadas.

Aguas no destinadas a consumo: son aguas para la preparacin de hielo de uso industrial,
aguas para el lavado de material, aguas recicladas y aguas para agricultura.

El estudio de las aguas ofrece un gran inters desde el punto de vista higinico, tanto ms
cuanto que, en muchos casos, el consumo de ciertas aguas constituye un verdadero peligro
para la salud pblica.

Las aguas de distribucin pblica corresponden a lo que se considera agua potable. Son
captadas a partir de las aguas superficiales, de vetas de agua o de aguas subterrneas y,
antes de su distribucin, se someten a tinos procesos de depuracin.
Estos procesos son:
Filtracin, decantacin y floculacin, desinfeccin por ozonizacin o cloracin por cloro o un
derivado de ste.
Las aguas de captacin individual proceden de fuentes o yacimientos subterrneos sirven
para abastecer casas de campo o industrias que no reciben aguas de distribucin pblica.
Este tipo de aguas deben ser tratadas para su posterior uso.

Las aguas envasadas proceden de yacimientos subterrneos protegidos de la

contaminacin y no se someten a ningn tratamiento desinfectante si se envasan en
condiciones de higiene para su consumo.

Con respecto a las aguas no destinadas al consumo y que tienen otros fines, como en la
industria alimentaria, han de tener una calidad bacteriolgica satisfactoria.

DEFINICIONES DE AGUA Y HIELO

Se ha reglamentado una serie de definiciones aplicables a los distintos tipos de aguas o

hielo para unificar criterios y manejar una terminologa comn:

a. Aguas de bebida envasadas

Son las distintas aguas caracterizadas corno minerales naturales, de manantial y potables
preparadas, que se comercializan envasadas. Tambin se incluyen aqu aquellas aguas
que, por circunstancias accidentales, se distribuyen envasadas excepcionalmente (Real
Decreto N64/l 991).

b. Aguas minerales naturales envasadas

Estas aguas son bacteriolgicamente sanas, tienen su origen en un estrato o yacimiento

subterrneo y brotan de un manantial en uno o varios puntos de alumbramiento, naturales
perforados. Se distinguen de las restantes aguas potables en:

Su naturaleza, caracterizada por su contenido en minerales, oligoelementos y otros

componentes y, en ocasiones, por determinados efectos.
 Su pureza original, se ha conservado intacta, dado su origen subterrneo, mediante
la proteccin del acufero contra todo riesgo de contaminacin.

Estas aguas tienen en el etiquetado unas exigencias complementarias a las generales.

c. Aguas de manantial envasadas

Se trata de aguas potables de origen subterrneo que emergen espontneamente a la

superficie de la tierra o que se captan mediante labores practicadas al efecto, con las
caractersticas naturales de pureza que permiten su consumo, previa aplicacin de los
mnimos tratamientos fsicos requeridos para superar los elementos materiales inestables.

d. Aguas preparadas envasadas

Se trata de aguas que, previa autorizacin de la autoridad sanitaria competente, se someten

a unos tratamientos necesarios para reunir las caractersticas establecidas.
Se diferencian dos tipos:

Potables preparadas, que proceden de un manantial o por captacin.

De abastecimiento pblico preparadas, en el supuesto de que tengan esta

procedencia.

e. Aguas de consunto pblico envasadas

Son aquellas aguas que, de manera puntual, se envasan para una distribucin domiciliaria
de modo gratuito, cuando hay que suplir deficiencias en el suministro de la red general y
con autorizacin previa.

f. Aguas Potables de Consunto pblico

Estas aguas son las destinadas para este fin, cualquiera que sea su origen, ya sea en su
estado natural o despus de un tratamiento adecuado. Se pueden utilizar para el consumo
o para la industria alimentaria, de forma que no pueda afectar a la salubridad del producto
final (Real Decreto 1138/1 990).

g. Agua potable

El agua potable rene las caractersticas fsico-qumicas y microbiolgicas que se indican

en la Reglamentacin Tcnico Sanitaria de aguas.

h. Agua tratada

Se trata del agua que, habiendo sido sometida a un tratamiento adecuado, tiene las
caractersticas propias de las aguas potables.

i. Agua no potable

Esta agua presenta unas condiciones fsico-qumicas y caracteres microbiolgicos o de

radiactividad tales, que impiden su inclusin en alguna de las clases anteriores.

j. Agua de bao

Son aguas de bao las de carcter continental, corrientes, estancadas o embalsadas, en la

que se autoriza expresamente el bao, o en as que, sin estar prohibido, se practica
habitualmente por un nmero importante de personas (Real Decreto 734/1 988).

K. Hielo natural

Es hielo natural aquel que se obtiene mediante procedimientos no mecnicos, es decir,

aprovechando los agentes atmosfricos de la naturaleza o las condiciones climatolgicas
propias de los perodos invernales, que congelan el agua procedente de lluvias, torrentes,
estanques, etc. (Orden de 1 6 de agosto de 1964).
m. Hielo artificial

El hielo artificial se consigue congelando agua mediante un procedimiento fsico-mecnico

(Orden de 16 de agosto de 1964).

n. Hielo alimenticio

Es, nicamente, el hielo artificial fabricado a partir de agua potable que tiene los siguientes
caracteres:

Es inodoro, incoloro, inspido y est exento de impurezas visibles.

Dar por Risin un lquido que satisface las condiciones de pureza y potabilidad
exigidas para las aguas.

CARACTERISTICAS FISICAS Y ORGANOLEPTICAS DE LAS AGUAS POTABLES

Los caracteres organolpticos recogidos en la Reglamentacin Tcnico Sanitaria que deben

cumplir las aguas potables son los que siguen a continuacin.

Transparencia
El agua potable ser transparente: pequeas sustancias suspendidas la hacen opalina.

Color
Las aguas incoloras no existen en la naturaleza, aunque, cuando se considera un pequeo
volumen, su color sea nulo. El color de ciertas aguas naturales es azul, azul verdoso,
amarillo, pardo e incluso, rojizo: esto se debe a mltiples circunstancias: desde el reflujo de
la luz del cielo hasta la presencia de algas o de sustancia orgnicas.
Olor
Las aguas son inodoras: la existencia de olor es sntoma de que presentan impurezas.

Sabor
El sabor es un carcter muy subjetivo. Cuando en el agua se sobrepasa una cierta cantidad
de sales disueltas, aparece mal sabor.

Junto a estos caracteres organolpticos, la legislacin tambin establece las caractersticas

fsico-qumicas que deben cumplir las aguas potables, que son las Siguientes.

Temperatura y reaccin

La-temperatura de un agua potable debe oscilar entre 7C y 11C. Slo el agua fresca es
agradable al paladar.
En cuanto a la reaccin de las aguas sta debe ser neutra o ligeramente alcalina.

Nitritos, nitratos y amoniaco

La presencia de nitrgeno combinado, disuelto en las aguas potables, indica una posible
contaminacin.
Las aguas potables no deben contener nitritos, nitratos ni amoniaco, si bien el agua de lluvia
tiene indicios de estas sustancias. En algunos casos, su presencia no implica que el agua
est contaminada. As, por ejemplo, el cemento que se emplea para revestir las paredes de
los POZOS O de los acueductos puede contener nitratos solubles; igualmente, las aguas
ferruginosas o manganosos reducen os nitratos disueltos a nitritos y amonaco.

cido carbnico

El cido carbnico se encuentra en las aguas de tres formas: como cido carbnico
combinado fuertemente, como cido semi-carbnico y como cido libre.

Se entiende por cido carbnico libre aquel que est sin saturar y del cual el mayor
porcentaje se halla en forma de dixido de carbono. Las aguas naturales contienen
cantidades variables de CO las que son muy ricas en l se denominan acidulas y tienen un
gran valor minero-medicinal.

El dixido de carbono disuelto est presente en las aguas de forma natural como resultado
de la respiracin de las plantas y los animales, la destruccin de materia orgnica y de la
descontaminacin de ciertos minerales. Es la mayor fuente de acidez de las aguas no
polucionadas.

Las aguas superficiales contienen menos de 10 ppm de CO2 disuelto, mientras que las
aguas subterrneas, en particular, si son profundas, pueden contener varios cientos de ppm.
En aguas superficiales, altos contenidos de CO pueden ser indicios de descomposicin
orgnica o mineral anormal.

Oxigeno

El oxgeno est disuelto en las aguas superficiales hasta la saturacin; en las profundas,
puede faltar por procesos de reduccin, como sucede cuando hay sales ferrosas. El oxgeno
disuelto no tiene valor alguno en la alimentacin humana. Sin embargo, los peces y otras
formas de vida acuticas s son muy sensibles a su ausencia.

El nivel de oxgeno disuelto en las aguas naturales es, con frecuencia, una indicacin directa
de su calidad, dado que las plantas acuticas producen oxgeno, mientras que los
microorganismos normalmente lo con sumen. A temperaturas bajas, la solubilidad del
oxgeno aumenta, frente al verano, en que los niveles de saturacin bajan.

Finalmente, hay que sealar que el oxgeno desempea un papel importante, junto con el
cido carbnico, en la corrosin de algunos metales en las aguas agresivas.

Sulfatos

Los sulfatos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza. Tienen su origen en las sales
que se encuentran en el suelo o en los procesos de oxidacin de los sulfuros naturales.
Son muy abundantes en aguas de terrenos muy cargados de yeso, denominadas aguas
selenitosas. Estas aguas producen incrustaciones de yeso en las calderas y son malas
conductoras del calor.

Se ha designado a los sulfatos, contaminantes de segundo nivel; a ciertas concentraciones

en aguas potables, afectan al sabor.

Cloruros

El cloruro es el in ms comn en aguas y desages. La sal, aunque es un nutriente vital

para nuestros cuerpos, pasa por el sistema digestivo sin cambiar, para convertirse en la
principal fuente de cloruros de los desages primarios.

La cantidad de cloruros que contiene un agua sirve para conocer su calidad: si el terreno es
grantico y las aguas estn muy cargadas de sal, es posible que haya contaminacin por
orina de animales o humana: si es un ro, la causa puede estar en vertidos industriales.
Hierro y manganeso

El hierro se encuentra disuelto en el agua en forma de carbonato cido de hierro. En

presencia de aire se oxida y precipita como hidrxido frrico; por esta razn el hierro
prcticamente desaparece de las aguas. Si el agua es poco aireada, su presencia le
comunica un sabor desagradable. En las aguas ferruginosas se desarrollan unas algas
tpicas que pueden llegar a obturar las conducciones.

No es conveniente este tipo de aguas en la industria alimentaria, porque perjudica

notablemente la calidad de los productos. Altas concentraciones en agua superficiales
pueden ser indicativas de la presencia de efluentes industriales o de desechos de
operaciones mineras.

Respecto al magnesio, hay que destacar que se encuentra unido al hierro y que favorece el
crecimiento de algas, ocasionando las mismas complicaciones que el hierro.

Dureza
La dureza de las aguas se debe a la presencia de sales de calcio y de magnesio que estn
en disolucin. Los bicarbonatos de estos elementos constituyen lo que se denomina dureza
temporal. Otras sales, cloruros y sulfatos de los alcalinotrreos forman la dureza
permanente; el conjunto se conoce como dureza total.

Dependiendo de la cantidad de carbonato clcico, las aguas se clasifican en duras y

blandas. Las aguas blandas o poco mineralizadas tienen un sabor menos agradable que las
duras, Las aguas duras no son apropiadas para usos domsticos (procesos de coccin,
lavado, etc.).

Materia orgnica

Las sustancias orgnicas estn en las aguas en pequea proporcin, de tal modo que se
valoran y cuantifican en funcin de la cantidad de oxgeno o permanganato potsico que
necesitan para su oxidacin bajo ciertas condiciones.

Para medir la materia orgnica se realiza la determinacin de la Demanda Qumica de

Oxigeno (DQO), que permite conocer el nivel de contaminacin orgnica en aguas
residuales. Con ella se determina la cantidad equivalente de oxgeno requerido para oxidar
la materia orgnica de la muestra.

Slice

El silicio es el segundo elemento ms comn de la corteza terrestre. Est presente en la

mayora de los suministros de agua natural en forma de silicatos. Es posible encontrar
mayores concentraciones de slice en aguas salobres o residuales.

AGUAS MINERALES NATURALES

La Draft European Regional Standard (FAO/OMS, 1 997) establece una serie de diferencias
que separan el agua mineral natural del agua (le bebida ordinaria:

Procede directamente de un manantial o de una perforacin subterrnea hasta llegar a la

bolsa de agua.

Se ha de recoger en unas condiciones que garanticen su pureza bacteriolgica original.

No se debe someter a ningn tratamiento, excepto los de decantacin, sustitucin de gas

o embotellado.

El cierre de la botella ha de hacerse en origen, al salir el agua del manantial.

Se caracteriza por el contenido en ciertas sales minerales y en sus proporciones relativas,

as como en la presencia de indicios de ciertos elementos u otros constituyentes.

El agua mineral natural debe contener, el menos, 1 .000 mg por litro de sales disueltas, tasa
que puede ser inferior en las aguas carbonadas.

El agua minera! Natural, tras su salida del manantial y posterior embotellado, contiene pocos
microorganismos, de lO/ ml a 100/ ml. Esta microflora autctona o natural se compone,
principalmente, de bacterias G-, especies de los gneros Flavobacterium, Cytophaga,
Micrococus y Nocardia. Se trata de una flora aerobia y psicrtrofa, con bajas necesidades
de nitrgeno.

Eras el embotellado, comienzan a multiplicarse las bacterias autctonas, debido al paso de

un sistema abierto a otro cerrado. Se produce un crecimiento crtico, es decir, aumentos y
descensos alternativos en el nmero de bacterias, y cada nueva poblacin de bacterias se
compone, a menudo, de especies distintas a las anteriores, ya que utilizan como nutrientes
los microorganismos muertos de la poblacin anterior. Este crecimiento es completamente
normal.

Otro tipo de flora de las aguas minerales procede de una fuente exgena; son las
denominadas bacterias autctonas, producidas por el almacenamiento previo al
embotellado, del aire del entorno o del propio, embotellado. Las bacterias ms resistentes
son mesfilas G-, especies de Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens y
Pseudomonas aeruginosa.

Respecto a los microorganismos patgenos, hay que sealar que, segn investigaciones.
La inoculacin de especies patgenas en el agua mineral natural y su posterior
almacenamiento a 20C ocasiona un lento pero definido descenso de la lasa bacteriana tas
varias semanas. La epidemia del clera que hubo en Portugal en 1974 tuvo en el agua
minera! no carbonatada uno de sus principales vehculos, lo que evidencia la necesidad de
seguir mtodos de fabricacin adecuados y de aplicar un control microbiolgico eficaz en la
produccin de estos tipos de agua.

La carbonatacin del agua mineral a unos niveles de tres a cinco volmenes de CO, tiene
un efecto bactericida sobre la mayora de las bacterias, debido al descenso del pR que
acompaa a la carbonatacin y al efecto per se del dixido de carbono.

Las aguas minerales no deben contener microorganismos patgenos; en general los

criterios que se han de seguir son los mismos que para agua de bebida.

HIELO

Si partimos de la Reglamentacin Tcnico Sanitaria (Orden de 1 6 de agosto de 1964),

veremos que el hielo se define como el agua convertida en cuerpo slido por un descenso
suficiente de la temperatura. Se distinguen dos tipos de hielo: natural y artificial.

El hielo natural es el que se obtiene por procedimientos no mecnicos, aprovechando

agentes atmosfricos de la naturaleza o las condiciones climatolgicas propias de los
perodos invernales, que conducen a la congelacin del agua. El hielo de tipo artificial es el
que resulta de congelar agua mediante algn proceso fsico-mecnico.

Se denomina hielo alimenticio al hielo artificial fabricado a partir de agua potable, y que
rene los siguientes caracteres:

Es inodoro, incoloro e inspido y est exento de impurezas visibles.

 Da por fisin un lquido que satisface las condiciones de pureza y potabilidad exigidas para
las aguas.

Hay varias clases de hielo alimenticio:

Mate u opaco: se elabora congelando agua potable en reposo; su aspecto es lechoso.

Claro o semitransparente: se fabrica congelando agua potable, agitada mecnicamente

durante el proceso. Es transparente en todo su espesor, excepto en el ncleo, que ser
opaco.

Cristalino: se prepara exclusivamente con agua destilada o desionozada y privada de aire.

Debe ser transparente en toda su masa.

Teniendo en cuenta la definicin de hielo alimenticio, slo nos queda sealar que las
condiciones de calidad son las mismas que las referidas al agua potable.

CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLGICO DE LAS AGUAS Y EL HIELO

El control microbiolgico de las aguas se realiza en los suministros de agua o en los

propuestos como tales, a fin de probar la potabilidad del agua. En la unidad de trabajo se
han analizado los aspectos microbiolgicos de las aguas, y se ha sealado la existencia de
tres pos de bacterias: bacterias autctonas, microorganismos procedentes del suelo y
bacterias que habitan el intestino del ser humano y de otros animales.

Asimismo, se ha indicado que la mayora que estas bacterias acuticas son G-

(Pseudomonas, Flavobacterium, etc.), aunque tambin pueden encontrarse
G+(Micrococcus y Bacillus).
El recuento de grmenes viables que se espera, segn el medio empleado, depende de la
naturaleza de la muestra de agua. Comparativamente, 1os ros sin polucin muestran
recuentos ms bajos, aunque, despus de una lluvia fuerte, los arrastres que legan al ro
cont3enen elevado nmero de microorganismos que viven, en el suelo, si bien los recuentos
tambin dependen del estado trfico del ro.

Los recuentos de las aguas abajo de las ciudades son mucho ms elevados a causa de las
descargas de aguas residuales y de efluentes industriales hacia los ros. Aunque estos altos
recuentos de grmenes viables hacen pensar en la contaminacin del agua yen la presencia
de bacterias diferentes de las acuticas, no indican necesariamente contaminacin por
heces, aguas residuales no tratadas, etc., ya que estas bacterias pueden ser saprofitos del
suelo, si bien no son deseables, pues pueden contribuir a incrementar problemas de
alteracin de los alimentos. La contaminacin fecal del agua origina la presencia de
bacterias derivadas del intestino: Escherichia coli, Streptcoccus faecalis y Clostridium
perfrigens y, posiblemente, patgenos intestinales como Salmonella y Vibrio cholerae.

Con el objetivo de determinar la potabilidad de un suministro de agua, es necesario

determinar que no est contaminada por las bacterias patgenas mencionadas. Como los
patgenos intestinales s se hallan presentes, seran sobrepasados en nmero por los
microorganismos que habitan normalmente en el intestino: resulta ms satisfactorio si se
identifican estos microorganismos.

Tanto en el recuento de colonias totales como en los recuentos de coliformes y de

Streptococcus faecalis la siembra se puede realizar en placa, en tubo y mediante el mtodo
de filtracin por membrana, aun que el mtodo oficial es el recuento en tubo a travs de la
tcnica del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo de filtracin por membrana tiene la
ventaja de que se pueden detectar pequeas cantidades de microorganismos, y la cantidad
de la muestra tambin es pequea.

Una vez filtrada una determinada cantidad de agua (100 ml de la muestra), la membrana se
incuba en una placa con caldo y temperatura apropiados. Si no se observa crecimiento
bacteriano, el agua es satisfactoria; en caso contrario, las bacterias se identificarn haciendo
una resiembra.
Las muestras de agua deben ser siempre simples y se han de recoger en frascos estriles
de boca ancha con tapones de vidrio esmerilado. Se tendr mucho cuidado durante el
muestreo para prevenir a contaminacin de la muestra. Si sta se toma de un grifo, deben
limpiarse completamente el interior y el exterior de la boca con agua o con alcohol, despus
de lo cual el grifo se abrir unos minutos para renovar el agua contenida en la tubera;
despus, se proceder a la toma de la muestra.
 PARTE EXPERIMENTAL

Materiales

Muestra
Agua almacenada

Material por equipo

Frasco de boca ancha con tapn esmerilado
Papel Kraft
1 pipeta de 1mL

Reactivos
Solucin de tiosulfato de sodio 10%
Etanol
Algodn

Metodologa

a) Preparacin de los frascos

1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabn o detergente

2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL)
3. Colocar una tira de papel kraft de 1 x 5cm entre tapn y cuello (frascos refractarios con
tapn esmerilado)
4. Cubrir el tapn y el cuello del frasco con papel kraftin
5. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

b) Toma de la muestra

1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%

2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodn y etanol y dejar correr el agua
por 3 minutos.
3. Generar zona asptica cuando sea posible hacerlo.
 4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente.
5. Para la recoleccin de agua a partir de depsitos naturales y cuerpos receptores, retirar
la cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua 30cm.
6. Destapar y llenar contra corriente o movindolo al frente, llenar hasta 2/3 del recipiente
y tapar inmediatamente.
7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos.
8. Llevar las muestras al laboratorio lo ms pronto posible, para analizarlas antes de que
transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.

Muestreo 2

Materiales

Muestra
Hielo raspado (sin sabor)

Material por equipo

Bolsa de plstico con cierre (ziploc)
1 pipeta de 1mL

Reactivos
Solucin de tiosulfato de sodio 10%

Metodologa

a) Toma de la muestra

1. Comprar con un da de anterioridad 3 vasos de hielo raspado (1.5L) o granizado de los

carritos y colocarlo en la bolsa plstica.
2. Cerrar inmediatamente y refrigerar (no congelar).
 3. Llevar las muestras al laboratorio lo ms pronto posible, para analizarlas antes de que
transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.

1 sesin

Tcnicas de Dilucin y vaciado en placa, NMP, y Filtracin.

Materiales

Material por equipo

2 mecheros
Tripi y tela de asbesto
Gradilla
Equipo Millipore estril
Accesorios de equipo Millipore

Medios de cultivo
1 matraz de 250mL con 150mL de Agar Cuenta Estndar.
5 tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentracin (3X)
1 caja con Agar Bilis Rojo Violeta

Material de los alumnos

3 tubos con 9mL de solucin salina estril
Pipetas serolgicas de 10, 5 y 1mL estriles
10 cajas petri estriles de vidrio o plstico estriles

Muestras requeridas
Agua de sabor (10mL)
Hielo raspado (600mL)

Metodologa
a) Determinacin de mesfilos aerbios

1. Homogenizar la muestra de agua de sabor.

2. Realizar 2 diluciones decimales en SSI.
3. Depositar con pipeta 1mL de muestra o dilucin en cada caja de Petri estril (esquema
1). Realizar cada dilucin por duplicado.
4. Verter en cada caja aproximadamente 20mL del medio agar cuenta estndar, fundido
y enfriado a 45C, homogenizar y dejar solidificar.
5. Etiquetar cada una de las cajas.
6. Verter una en una caja medio de cultivo sin muestra como control.
7. Una vez solidificadas, incubar las placas a 35C durante 24 horas.
8. Contar todas las colonias presentes, en las cajas que contengan de 25 a 250.

Esquema 1
1 mL 1 mL

Muestra

Homogenizar

1 mL 10 -1 10 -2
1 mL 1m L
20 mL

Agar cuenta
estndar Control
 b) Determinacin del NMP de coliformes en agua o hielo potables (esquema general)

Tubos con 10.0mL de Lectura de tubos positivos en Lectura de tubos

Tubos con
positivos en caldo lactosa verde tablas. NMP de coliformes
10.0 mL de
tablas. NMP de coliformes brillante bilis 2% totales /100mL
caldo EC o EC-MUG
de muestra fecales /100mL de muestra.

Siembra de tubos positivos en

placas de Agar EMB para la
bsqueda de Escherichia coli

2 -4 h

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos

Tubos con mL de caldouril CLSS +. mL de positivos
produccin de gas) en caldo
de sodio lariple concentracin
10.0 sulfato3X ( 20 0muestra lactosa
( verde brillante bilis 2% y caldo
(CLSS) t )
EC

2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo

3 44.

2 4 2 4

24
b.1.)Prueba presuntiva. Determinacin del NMP de coliformes en agua y hielo potables:

1. A partir de la muestra de agua inocular 20mL en cada uno de 5 tubos con caldo lauril
sulfato de sodio (CLSS) triple concentracin. Rotular.
2. Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.

c) Tcnica de filtracin:

1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta con los siguientes datos:

1515-11-# de equipo Filtracin

(muestra) dd/mm/aa

2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un rea estril. En condiciones
de asepsia instalar el equipo Millipore estril. Antes de instalar el vaso y las pinzas
de pato, colocar una membrana de 0.45 m estril sobre la base del filtro conector.
Las pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la
membrana.

3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra lquida

solicitada, si presenta partculas en suspensin filtrar previamente con algodn y
gasa.

25
 4. Abrir la llave de vaco y filtrar el medio a travs de la membrana. Una vez que hubo
pasado todo el medio cerrar el vaco.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja
de Petri con Agar Bilis Rojo Violeta. Presionar ligeramente la superficie para favorecer
la adherencia de la membrana.

7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recin inoculada e incubar a
37C durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubacin revisar los resultados y guardar en refrigeracin.

2 sesin

Resultados de tcnicas de NMP, Dilucin y vaciado en placa, y Filtracin.

Materiales

Por equipo
2 gradillas
2 asas

Por grupo
3 cuentacolonias
Medios de cultivo
5 tubos con 10.0mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%
5 tubos con 10.0mL de caldo EC
2 cajas con agar EMB

Metodologa

a) Interpretacin de resultados de la tcnica de dilucin y siembra por vertido en placa.

26
1. Al trmino del periodo de incubacin, hacer el recuento de UFC (Unidades Formadoras
de Colonias), para ello:

a. Seleccionar las cajas de la dilucin cuyo nmero de colonias oscile entre 25 y

150 UFC
b. Contar el nmero de colonias con ayuda de un cuentacolonias.
2. Multiplicar el promedio por el inverso de la dilucin para obtener las UFC/mL de
muestra.
3. Promediar el nmero de colonias de las cajas que cumplan con el criterio establecido.
4. Revisar la caja testigo para descartar cualquier tipo de contaminacin. En caso de
haber desarrollo en la caja, la prueba deber ser invalidada.

b.2) Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva,

a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
3. Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 horas.
4. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y
produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 horas.
5. Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos
coliformes totales/100mL.

b.3) Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva

a tubos con caldo EC.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
3. Incubar a 44.5 g 0.1C en incubadora o un bao de agua con circulacin durante 24 a
48 horas.
4. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y
produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 horas.
5. Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos
coliformes fecales/ 100mL.

Control de calidad para coliformes fecales

1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.

c) Interpretacin de resultados de la tcnica de filtracin:

1. Contar las colonias que desarrollaron en la membrana y anotar los resultados.

27
2. Ubicar la presencia de colonias rojas (lactosa positiva).
3. Utilizar un cuentacolonias para contar las colonias con las caractersticas antes
descritas y calcular el nmero de UFC/100 mL de muestra.
4. Consultar la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, que seala los lmites
permitidos de bacterias coliformes fecales y confirmar si el agua analizada rene y
cumple con lo establecido.

28
3 sesin

Identificacin de bacterias coliformes

Materiales

Por equipo
gradillas
asas
microscopio
juego de colorantes de Gram

Medios de cultivo
caja con Agar Cuenta Estndar o BHI
tubos con medio SIM
4 tubos con caldo RMVP
tubos con Agar Citrato de Simmons
Solucin salina isotnica

Metodologa

b.4) Prueba confirmativa para Escherichia coli

1. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar
por estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
2. Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 horas.
3. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial:
Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay
colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido
E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar
las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas.
4. Incubar las placas a 35C por 18-24 horas.
5. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de
bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

b1.4.1) Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC)

A partir de las cajas de agar cuenta estndar, selecionar una colonia,

resuspenderla en 2mL de solucin salina isotonica para realizar las siguientes
pruebas bioqupimicas.

a. Produccin de indol (I)

Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo con
caldo triptona, incubarlo a 35C por 24 2 horas.

29
 Finalizada la incubacin, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de
Kovacs o
Ehrlich.
La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera
como prueba positiva para la presencia de indol.

b. Produccin de cidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que
contenga caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 horas.
Finalizada la incubacin, adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un
color amarillo es una prueba negativa.
c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que
contenga caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 horas.
Finalizada la incubacin, adicionar 0.6 mL de solucin KOH 40% (VP1),
agitar y 0.2mL de solucin alfa- naftol (VP2 ) y agitar.
Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una
prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilizacin del citrato (C)
Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que
contenga caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional)
Incubar a 35C por 96 horas.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato
de Koser, se considera una prueba positiva.

4 sesin

Tcnicas Redox, Turbidimetra y Microscopia.

Materiales

Por equipo
mecheros
gradilla
microscopio
objetivo micromtrico
ocular micromtrico
juego de colorantes de Gram

Material que deben tener los alumnos

Portaobjetos
tubos de ensayo con tapn de rosca
estriles 4 pipetas serolgicas
estriles.

30
 tubos con SSI estriles

Material y equipo por grupo

Solucin de resazurina (diazoresorcinol)
Solucin de azul de metileno tiocianato
Bao de agua a 37 C
5 matraces nefelomtricos

Metodologa

d) Tcnica Redox (reduccin del azul de metileno y reduccin de resazurina).

1. Agitar la muestra de leche transferir 10mL a cada uno de dos tubos de

ensayo
2. Agregar 1mL de azul de metileno tiocianato a uno de los tubos con leche y
1mL de resarzurina al otro tubo, mezclar bien y colocar en un bao de agua
a 37C (o en la incubadora)
3. Despus de 10 minutos, asegurar los tapones e invertir lentamente los
tubos tres veces para distribuir la capa de crema
4. Observar cada 30 minutos y continuar la incubacin hasta que registre
decoloracin del colorante.
5. Anotar los resultados obtenidos prcticamente, de acuerdo con la siguiente
clasificacin:

Azul de metileno
Calidad Tiempo de incubacin en el que se Nmero de
presenta la decoloracin bacterias/mL
Excelente No se decolora en 5.5 h < de 500 000
Buena Se decolora entre las 2 y 5.5 h 500,000 a 4 000 000
Mala Se decolora entre los 20 minutos y 2 h 4 a 20 millones
Muy mala Se decolora en 20 minutos > de 20 millones

Resarzurina
Calidad Coloracin de la resazurina
Excelente Violeta
Buena Violeta rosado
Mala Rosa
Muy mala Decoloracin total

e) Tcnica turbidimtrica.

31
1. Inocular 24 horas antes cuatro de los cinco matraces de caldo nutritivo con
una cepa de levadura e incubar a 28C en agitacin.
2. Agitar suavemente el matraz que contiene el cultivo de levaduras, insertar
el tubo lateral en el nefelmetro y tomar la lectura en Unidades Klett,
emplear como blanco el matraz sin inocular.
3. Determinar las Unidades Klett en el resto de los matraces y en la curva de
Mac Farland.
4. Graficar la curva de Mac Farland: UK en el eje Y y nmero de
microorganismos en el eje X.
5. Determinar la ordenada al origen (0) y la pendiente de la recta.
6. Determinar el nmero de microorganismos en las muestras problema.
7. Asignar un matraz por mesa y a partir de este realizar tres diluciones
decimales.
8. Inocular por duplicado 0.1mL de la dilucin 10 -3 en una caja con agar PDA
y extender con varilla de vidrio.
9. Incubar a 28C durante 48 horas.

Curva de Mac Farland

Cultivo de
levaduras Nefel metro

UK

1 mL

1 mL 1 mL Nmero de
microorganismos

0. 1 mL

10 -1 10 -2 10 -3 Vaciado
e n placa

Cuenta de Breed

32
f) Recuento microscpico (cuenta de Breed).

1. En un portaobjetos desengrasado marcar un rea

de 2 cm2 2. Agitar la dilucin de 10-1 hasta
homogenizar completamente.
3. Con un asa calibrada o una micropipeta tomar 0.01mL de la leche y
transferirlo al portaobjetos en el rea marcada. Extender la muestra y dejar
secar al aire.
4. Fijar con calor y teir con cristal violeta de Gram 1 minuto.
5. Lavar con agua. Dejar secar al aire.
6. Observar en el microscopio con objetivo de inmersin y contar el nmero
de
7. microorganismos por campo, obteniendo el promedio de 5 campos.
8. Calcular el factor microscpico (FM): medir el dimetro del campo
microscpico por medio del micrmetro objetivo, en mm.
9. Determinar el rea del campo: elevar el radio al cuadrado y multiplicar por
3.1416. Dividir este resultado entre 100 para obtener el rea del campo en
centmetros cuadrados.
10. Determinar el nmero de dichos campos en 2 cm2, dividiendo 2 cm2 entre
el rea del campo obtenido antes.
11. Calcular el nmero de levaduras/mL en el matraz.
12. De ser necesario repetir la operacin con la dilucin 10-2.

0.01 mL Contar de
Tincin simple 5 a 10
con Cristal campos y
Violeta obtener un
promedio.
10 -2 Observar
rea de la
muestra
A= (b x a)

rea del campo / rea de la muestra = FM

Campo
microscpico Factor microscpico o factor de dilucin
2
A=( x r )/2

Disposicin de desechos

33
1. Esterilizar los tubos en los que prepar las suspensiones bacterianas y
posteriormente lavarlos.
2. Despus de realizar las lecturas correspondientes, sellar las cajas de Petri de
plstico y colocarlas en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A

34
 CONCLUSIONES

Se lleg a evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante el

recuento de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli.
Se lleg a diferenciar los organismos coliformes totales de los
microorganismos coliformes fecales.
Se lleg a aplicar las tcnicas de cuantificacin de microorganismos totales
y comparar con las tcnicas de determinacin de viables.

35
 BIBLIOGRAFA

Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios.

Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios.
Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms
probable.
Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007.
Microbiology: an introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA.
QR41.2 T67 2007

36