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GUA DE PRACTICA N2
TEMA : ESPECTROFOTOMETRIA
CALIFICACION :
OBSERVACION :
I.- Introduccin
Al observar una solucin acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloracin, la cual
se debe a la interaccin entre las molculas del colorante y la luz que atraviesa la disolucin.
Adems en caso de tener varias soluciones de distintas concentraciones es posible determinar un
gradiente de concentracin a partir de la intensidad de la coloracin. Estas observaciones dan
origen a una serie de prcticas analticas llamada Espectrofotometra, basada en la interaccin de
las molculas y las radiaciones electromagnticas.
Una radiacin electromagntica se puede describir como un flujo de partculas llamadas fotones,
o bien como una onda propagndose en el espacio. De esta ltima descripcin se toma el
concepto de longitud de onda, definindolo como la distancia entre dos mximos consecutivos de
la onda. La longitud de onda es inversamente proporcional a la energa de la misma, de tal
manera que el espectro de radiaciones electromagnticas abarca un amplio rango de energas, las
de menor energa son las ondas de radio y las de mayor energa son las llamadas radiacin
gamma.
Para obtener la mxima sensibilidad en una determinacin debe conocerse la longitud de onda de
mayor absorcin de la sustancia analizada, que no deber coincidir con una alta absorcin de
otras sustancias presentes en la reaccin.
Sea I la intensidad de una radiacin que atraviesa un medio homogneo, parte de la radiacin es
absorbida por la muestra y otra parte es transmitida, ambas con una intensidad, i, de tal manera
que se define transmitancia de una muestra como la relacin entre la radiacin transmitida i
versus la intensidad luminosa incidente I, multiplicado x 100:
% T = ( i / I) x 100
La absorbancia es una medida de la cantidad de Energa luminosa incidente absorbida por una
sustancia en solucin. Est relacionada con Transmitancia por medio de :
Espectrofotmetro
Los aparatos de medida de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan
espectrofotmetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:
La luz procedente de la fuente se hace pasar a travs del monocromador, que la desdobla en
haces monocromticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y segn su abertura se
obtiene luz de una determinada longitud de onda. La longitud de onda que se desee utilizar se
selecciona variando la posicin del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar
por la solucin y luego incide sobre el fototubo, donde se detecta. La seal se enva a un
registrador, el cual puede ser la escala de un galvanmetro calibrado.
Espectro de absorcin
Consiste en un grfico que representa el % T o la Absorbancia en funcin de la Longitud de onda a
la cual se realiza la medicin, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma
concentracin c de la muestra.
Permite determinar las longitudes de onda ptimas de absorcin y las concentraciones adecuadas
de trabajo. La longitud de onda optima ser aquella en el que el valor de absorbancia sea mximo
Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el grfico ser una recta y ser posible sacar
un factor ya que la pendiente de la recta ser la misma en todos los puntos. As se podr calcular
la concentracin de la muestra problema.
Si la sustancia no cumple la Ley, el grfico ser una curva y se extrapolar dentro de un rango
apropiado para calcular el valor de la muestra problema.
Parte experimental
Objetivos
- Realizar una curva de calibracin para determinar la concentracin de una muestra problema
de azul de metileno.
Actividades:
1- Espectro de absorcin de solucin de azul de metileno
Observar cul es la longitud de onda de mayor absorcin que se utilizar para realizar la curva
de calibracin y determinar la concentracin de una muestra problema.
2- Curva de calibracin
A partir de la solucin patrn de 5 mg/l realizar siete diluciones: 1/2; 1/4; 1/5; 1/6; 1/8; 1/10;
1/15. Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar
absorbancia versus concentracin.
Problemas
3- Calcule la concentracin de una solucin de ATP que posee una absorbancia de 0,87 a 259
nm,si el coeficiente de absorcin molar a pH 7,0 es de 15,4 l/molcm y la longitud de paso de la
cuba es de 1cm. Cul ser la absorbancia de una solucin de ATP de concentracin 10g/L?. PM
ATP: 491
4- Una solucin que contiene 2 gr/l de una sustancia, transmite el 75% de la luz incidente en
una cubeta de 1 cm a una determinada longitud de onda. Calcular la transmitancia de una
solucin que contenga 4 gr/l y la absorbancia de una solucin que contenga 6 gr/l.
240 0,100
250 0,099
260 0,170
270 0,245
280 0,290
290 0,198
300 0,171
310 0,115
0,37 11
0,404 12
0,438 13
0,472 14
0,505 15
Determinar si el compuesto cumple con la Ley de Lambert y Beer a esa longitud de onda.
0,23 0,20
0,47 0,40
0,65 0,60
0,90 0,80
II.- Objetivo:
- Objetivos Generales:
- Objetivos Especficos:
- Materiales y reactivos
Refractmetro
Termo higrmetro
Agua destilada
alcohol-acetona
Piseta
Papel absorbente
Papel filtro
Vasos de precipitado / 100 ml placa de Petri
Pipeta 1 mL
IV.- Procedimiento
Calibrado del refractmetro.
Para el calibrado del refractometro (Hi96801) se puso a prender el instrumento luego
pusimos una gota de agua destilada con la ayuda de una piseta en la celula de
medicion y calibramos esta nos saldra zero , luego pasamos a secar de la forma
adecuada ya recomendadas por el guia de practica
4.1.- Metodologa
REFRACTOMETRO: 10.1
BRIXOMETRO : 10
REFRACTOMETRO : 18.3
BRIXOMETRO : 17.5
REFRACTOMETRO BRIXOMETRO
Sumo Naranja 11,9 11,9
Sumo Camu Camu 10,1 10
sumo Mango 17,5 18,3
sumo Sumo de uva 18,5 20
Mermelada 64 excede
Vino 16,1 16
Dulce de Camu Camu 75,8 excede
Elaboracin propia
V.-Resultado y Conclusiones
Luego de haber realizado todo lo establecido los resultados de nuestras Muestras de medidas
Refractometro y Brixometro son :
REFRACTOMETRO BRIXOMETRO
zumo Naranja 11,9 11,9
zumo Camu Camu 10,1 10
zumo Mango 17,5 18,3
zumo de uva 18,5 20
Mermelada 64 excede
Vino 16,1 16
Dulce de Camu Camu 75,8 excede
o
C Para restar de la lectura
Ejemplo:
Sabiendo ello realizamos como nuestros datos les corresponda ( Sumar ).el cual nos dio como
resultado lo Siguiente:
Luego de haber realizado los anlisis segn el protocolo establecido en la presente prctica se
lleg a las siguiente conclusion.
Que a una T 29C y un el estado de maduracin organolptica los zumo de las muestras ya
mencionadas tienen un Brix mencionadas en el siguiente Cuadro.
T : 29C
REFRACTOMETRO BRIXOMETRO
zumo Naranja 11,9 11,9
0,68 0,68
12,58 brix 12,58 brix
zumo Camu Camu 10,1 10
0,68 0,68
10,78 brix 10,68 brix
zumo Mango 17,5 18,3
0,69 0,69
18,19 brix 18,99 brix
zumo de uva 18,5 20
0,69 0,71
19,19 brix 20,71 brix
Mermelada 64 excede
0,73
64,73 brix No DATOS
Vino 16,1 16
0,69 0,69
16,79 brix 16,69 brix
Dulce de Camu Camu 75,8 excede
0,73
76,53 brix No DATOS
VI.- Recomendaciones
Que el brixometro solo determina el porcentaje de azcar, mientras que el refractmetro tiene
mayor proporcin de anlisis como el porcentaje de slidos solubles, esto abarca tambin el
azucar, asi tambin sal y minerales.
VIII.- Citas
Abb(1874) y Pulfrich(1887).
Meyer,( 1984)
IX.- BIBLIOGRAFIA
http://www.acenologia.com/ciencia72_03.htm
X.- Anexo
En Catalua, la produccin de vino de las diferentes denominaciones de origen en el ao 2004 fue de 3 196 082 hL
con una superficie de viedo de 61 375 hectreas (5,4% del total de viedos estatales). En un mercado tan
competitivo se debe tener un especial inters en las tcnicas que evalan la calidad de la uva. Actualmente, las
tcnicas ms utilizadas como la refractometra, las valoraciones de acidez, la cromatografa de gases y lquidos no
proporcionan informacin del potencial aromtico del vino. La necesidad de producir vinos de calidad para hacer
frente a las tendencias del mercado tiene como consecuencia el desarrollo progresivo de mtodos que permitan
cuantificar la calidad aromtica de la uva en el momento de entrar en la bodega.
En este artculo se presenta el estudio, realizado en Bodegas Miguel Torres, en el que se evala la cuantificacin de
las agliconas presentes en la uva como posible parmetro indicador del potencial aromtico.
Las agliconas (GG) de la uva son, principalmente, molculas de terpenos, C13- norisoprenoides, alcoholes alifticos
y derivados bencnicos, enlazadas a glucosas. Estos compuestos, tambin llamados precursores glucosdicos, no
tienen importancia en el color y aroma del vino, pero durante la fermentacin se hidrolizan liberando al medio
todos estos metabolitos secundarios que afectan al aroma y al calor final del vino. Una correlacin entre la cantidad
de precursores glusosdicos en el mosto y la intensidad aromtica del vino obtenido permitira evaluar, a priori, la
calidad de la uva.
El mtodo, segn Williams,1 para variedades de uva blanca se basa en tres pasos: se realiza un aislamiento de los
precursores del mosto mediante una resina C-18, seguidamente, una hidrlisis del enlace glucosdico y, finalmente,
la glucosa liberada se analiza enzimticamente con hexoquinasa/glucosa-6-fosfato.
En las variedades tintas se encuentran cantidades importantes de precursores fenlicos que no tienen importancia
sensorial. Siguiendo el mtodo anterior se obtiene la cantidad de agliconas totales, tanto aromticas como no
aromticas. Al ser necesario encontrar correcciones del mtodo que minimicen al mximo las interferencias de los
glucsidos no aromticos surgen dos nuevos parmetros: la glucosa-glucosdica libre de materia colorante (RFGG) y
la glucosa-glucosdica libre de materia fenlica (PFGG).
Iland2 desarrolla un mtodo para determinar la RFGG en la uva mediante la sustraccin de la cantidad de antocianos
asociados a la glucosa al valor de los agliconas totales. Dentro de los compuestos fenlicos glucosilatos, se
encuentran compuestos que tienen importancia sensorial como la vainillina, vainillato de etilo, etc., y otros que no,
como el cido cafeoiltartrico, p-cumaroiltartrico, sirngico, saliclico o los antocianos. Zoecklein3 y Whiton evalan
dos mtodos de extraccin de los precursores glucosdicos eliminando las interferencias de las agliconas fenlicas:
extraccin del mosto a pH 13 con OasisTM HLB y extraccin a pH 10 con resina C-18. A pH bsico, los precursores
fenlicos se ionizan y no se retienen en la resina. El mejor mtodo es usar la resina Oasis pero, juntamente con los
glucsidos, se elude otros compuestos que interfieren en la cuantificacin enzimtica de la glucosa, lo que dificulta
el anlisis. En el laboratorio de Bodegas Miguel Torres se utiliza resina C-18 y el mosto a pH. En estas condiciones no
se eliminan todas las interferencias de los compuestos fenlicos, pero se obtienen valores repetitivos y
comparativos. A partir de aqu, la cuantificacin sigue como propone Zoecklein.
Se calcula el coeficiente de variacin del mtodo cuantificador doce veces cada parmetro en doce das diferentes.
Las variedades escogidas son moscatel y garnacha negra (tabla 1).
Tabla 1 Clculo para la cantidad de precursores aromticos (coeficiente de variacin)
GG: agliconas; RFGG: glucosa-glucosdica libre de materia colorante; PFGG: glucosa-glucosdica libre de materia
fenlica; M: micromoles de glucosa glucosdica por litro de mosto; DE: desviacin estndar. CV (%): coeficiente de
variacin
Los coeficientes de variacin obtenidos son bajos y, por tanto, el mtodo es reproducible ( fig. 1). La linealidad del
mtodo se comprueba dopando alcuotas de mosto de moscatel con diferentes cantidades de n-octilglucsido
previamente a la extraccin. Se obtiene un coeficiente de regresin de 0,9926 (fig. 1)
Se escogen parcelas de las variedades de moscatel, chardonnay y garnacha blanca. Se hacen dos determinaciones
glucosdicas de cada parcela en dos momentos diferentes de madurez. Como se puede ver en la figura 2, en
aumentar la madurez es una variable a tener en cuenta en los diseos de experiencias.
Figura 2 Cantidad de precursores glucosdicos (GG) en micromoles de glucosa-glucosdica por litro de mosto segn
variedades y grado de maduracin
Se escogen diferentes parcelas de las variedades de chardonnay, moscatel, garnacha blanca, riesling, garnacha tinta
y syrah. La toma de muestra se realiza cuando la uva est a aproximadamente 22 Brix, excepto la garnacha negra
que est a 24 Brix. Segn las figuras 3 y 4, parecera que, mediante el anlisis de precursores glucosdicos, se
podra llegar a diferenciar uvas de diferentes orgenes.
Figura 3 Cantidad de precursores glucosdicos (GG) en micromoles de glucosa-glucosdica por litro de mosto en
diferentes parcelas de la misma variedad
Figura 4 Cantidad de precursores glucosdicos (GG) libre de materia colorante en micromoles de glucosa-glucosdica
por litro de mosto en diferentes parcelas de la misma variedad
En los apartados anteriores se demuestra que el mtodo es viable. Se realiza, por tanto, un estudio completo de dos
fincas de syrah, con el objetivo de correlacionar la cantidad de precursores y el anlisis organolptico. En este caso,
por ser una variedad tinta, se analizan los precursores glucosdicos libres de materia colorante (RFGG) y los
precursores libres de materia fenlica (PFGG).La toma de muestra y la cuantificacin de cada parcela se hace
cuando el grado Brix es de 22,8. Segn un estudio de varianza se encuentra que las dos muestras son
significativamente diferentes por un : 0,01% en los dos parmetros (tablas 2 y 3).
Tabla 2 Cuantificacin de precursores aromticos del vino de uva syrah, por el mtodo RFGG
RFGG (M): micromoles de glucosa-glucosdica libre de materia colorante por litro de mosto; CV (%): coeficiente de
variacin
Tabla 3 Cuantificacin de precursores aromticos del vino de uva syrah, por el mtodo PFGG
PFGG (M): micromoles de glucosa-glucosdica libre de materia fenlica por litro de mosto; CV (%): coeficiente de
variacin
Se vinifica cada muestra y se analiza sensorialmente cada vino. Todas las experiencias sensoriales se disean con el
programa Fizz 1.2 Biosystem. Se realiza un test triangular con los dos vinos para establecer si son sensorialmente
diferentes. Se dispone de 25 jueces entrenados de los cuales 17 detectan correctamente la muestra diferente; con
un : 0,1%, se concluye que las muestras son significativamente diferentes.
Cada muestra se caracteriza segn los atributos: intensidad aromtica, untuosidad, concentracin en boca y
preferencia. Un grupo de diez catadores entrantes puntan cada muestra del 0 al 5 segn intensidad creciente del
descriptor. Se realiza un anlisis de varianza de cada atributo (tabla 4).
Tabla 4 Anlisis de varianza segn cata de vino de uva
syrah
Promedio de intensidades de cada atributo
Segn las estadsticas, el nico atributo que presenta diferencias significativas es la intensidad aromtica (p < 0,05).
El vino de uva syrah A que ms cantidad de precursores glucosdicos contiene es el que ms intensidad aromtica
presenta.
Conclusiones
La cuantificacin de los precursores glucosdicos parece ser de utilidad de cara a comparar la calidad aromtica de
uvas de diferentes procedencias dentro de una determinada variedad. El conocimiento de este parmetro
juntamente con los clsicos como el grado, el pH y la acidez voltil nos conduce a un mayor control de la calidad de
la uva.Los precursores totales en la uva blanca dependen del grado de madurez y juntamente con el RFGG y PFGG
parece que permiten diferenciar procedencias de una variedad. En el caso de la uva tinta, el RFGG y PFGG son
complementarios: el mtodo para detectar precursores libres de materia colorante (RFGG) elimina las
interferencias para antocianos, pero no del resto de precursores fenlicos. El mtodo para cuantificar precursores
libres de materia fenlica (PFGG) elimina todos los fenoles incluidos los que tienen importancia organolptica como
las agliconas asociadas a la vainillina.Mediante el anlisis de precursores glugosdicos no se obtiene un valor
absoluto de la cantidad de precursores aromticos que se encuentra en el mosto, ya que por falta de patrones de
precursores en el mercado no se puede calcular el porcentaje de extraccin de cada compuesto por los diferentes
mtodos. Se obtiene un valor repetitivo y comparativo que permite evaluar la cantidad organolptica de la uva al
llegar a la bodega.Las tendencias actuales apuestan por encontrar un mtodo basado en la deteccin por infrarrojo
de los precursores glucosdicos: con esta tcnica se pretende simplificar y agilizar los anlisis.
Bibliografa