ANALISIS INSTRUMENTAL AZUCARES REDUCTORES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERA
ESCUELA ACADMICA PROFESIONAL DE INGENIERA
AGROINDUSTRIAL

TTULO:
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES DE UN
ALIMENTO POR ESPECTROFOTOMETRIA

INTEGRANTES:

Valverde Arteaga Walter

CURSO:
Anlisis Instrumental

DOCENTE:
Ing. Vctor Castro

NUEVO CHIMBOTE PER

2017
ANALISIS INSTRUMENTAL AZUCARES REDUCTORES

NDICE

I. RESUMEN ................................................................................................................. 3

II. INTRODUCCIN ...................................................................................................... 3

III. MATERIALES Y MTODOS ................................................................................ 4

IV. RESULTADOS Y DISCUSION .............................................................................. 6

VI. CONCLUSION ..................................................................................................... 11

VII. RECOMENDACIONES........................................................................................ 11

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................... 11

IX. CUESTIONARIO ................................................................................................. 12

ANALISIS INSTRUMENTAL AZUCARES REDUCTORES

I. RESUMEN

Se desarroll un procedimiento para determinar la concentracin de

azcares reductores totales en jugos de mango y naranja por el mtodo
del cido 3,5 dinitro saliclico (DNS). As mismo se hiso una determinacin
de azucares reductores por el mtodo convencional de espectrofotometra
(espectrofotmetro) llegando as a comparar resultados. El mtodo del
DNS es ms rpido, ms exacto y ms eficiente, mientras que por el
mtodo convencional es ms lento y con menos exactitud.

II. INTRODUCCIN

Se emple en mtodo del cido 3,5 dinitro saliclico (DNS) para calcular
la concentracin de azcares reductores en distintas muestras. El
procedimiento se basa en una reaccin redox que ocurre entre el DNS y
los azcares reductores presentes en la muestra. Este mtodo ha sufrido
varias modificaciones a travs de los aos para adecuarse al anlisis de
diferentes materiales y su principal ventaja radica en su alta sensibilidad
y productividad debido a que es un mtodo espectrofotomtrico.

El mtodo del DNS no es recomendable utilizarlo para la determinacin

de azcares reductores en muestras intensamente coloreadas como
mieles y caldos de fermentacin que la contengan. Estudios de Otero y
colaboradores muestran dispersin en la determinacin de azcares
reductores en mieles por el mtodo del DNS con la modificacin de Miller.
En el presente trabajo se desarrolla un procedimiento para la
determinacin de azcares reductores totales en jugos mezclados de
caa de azcar por el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico. 2 Para la
determinacin de la curva de calibrado se hiso uso del equipo Multi modal
dndonos as una curva de calibrado.

La curva patrn permitir relacionar la absorbancia a 540 nm de los tubos

con la cantidades moles de glucosa y fructosa presentes en la disolucin
y, por lo tanto, haciendo el clculo correspondiente, se podr estimar la
velocidad a la que ha funcionado la enzima (moles de sacarosa
hidrolizados por la enzima por unidad de tiempo), es decir, su actividad.

Esta tcnica tiene la ventaja de ser un mtodo preciso y rpido en

comparacin con los que utilizan derivados fenlicos. Presenta
desventajas por la presencia de polifenoles que ocasiona la reduccin del
reactivo.
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III. MATERIALES Y MTODOS

Materiales
Espectrofotmetro UV VIS Marca Tuner cubeta de cuarzo

Fiolas Pipetas y micro pipetas

Papel Tissue Pizeta con agua destilada

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3,5 cido dinitrosalcilico

Reactivo DNS

Tartrato de Sodio y Potasio

Hidrxido de Sodio
Metabisulfito de Sodio
Reactivo DNS

Mtodos

- Preparacin del Reactivo DNS:

- Se mezcla y disuelve en 250 ml. de agua destilada 8 gr. De
NAOH y 15 gr. de tartrato de Sodio y Potasio.
- Posteriormente se agregan 5 gr. de Acido 3,5 dinotrasalicilico
bajo calentamiento. Se aforan a 500 ml con agua destilada y se
almacenan a temperatura ambiente protegindolo de la luz.

Curva estndar

Utilizar un estndar de 1.0 mg/ml. de glucosa, realizar las

diluciones para obtener concentraciones de 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y
1.0, Realizar una curva patrn de glucosa.

Anlisis de Muestra

Diluir 1 ml. de cada muestra en 100ml. de agua destilada en una

probeta, luego extraer 1 ml de esta solucin en un tubo de
ensayo adicionando un 1ml. de la solucin DNS, agitar y llevar
luego a ebullicin por 10 min. Enfriar rpidamente y agregar 10
ml. (o 5 ml.) de agua destilada con previa agitacin.
Llevar la muestra al espectrofotmetro a 540 nm y leer su
absorbancia. Con este dato encontrado insertamos en la curva de
calibracin previamente construida y el resultado se lee como
gramo de glucosa.
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Clculos
1. Graficar los datos de la curva patrn colocando en el eje de
las abscisas la cantidad de azucares reductores en mg./ml. y
en las ordenadas la absorbancia a 540 nm. Calcular la
pendiente ajustando la ordenada a cero.
2. Con el valor de la pendiente calcular la cantidad de azucares
reductores para cada tiempo en la muestras:
Y = mx + bX = (y - b)/m
Azucares reductores mg./ml. = (Abs de la muestra/pendiente) x
dil. Tomar en cuenta la dilucin para cada muestra.
Procedimiento
Para la realizacin de nuestra prctica que consista en medir la
absorbancia se utilizaron: una muestra de jugo de naranja y
mango cifrut. La naranja y el mango fueron exprimidos en un
vaso precipitado para lo cual se llev a un proceso de filtracin,
luego la solucin se le puso en un recipiente de plstico y se le
llev a la centrfuga para separar el sobrenadante. Lo mismo se
hizo con el cifrut.
Con la ayuda de la micropipeta se sac una pequea muestras
y se las colocaron en fiolas rotuladas, para as poder diluirlas.
Se les coloc en tubos de ensayo y se las agreg el reactivo
DNS. Se llev el tubo de ensayo a bao mara por unos minutos
hasta que suceda un cambio de color.
Luego se extrajo con la micropipeta una pequea muestra de
estay se puso en la las microplacas luego se agreg en el blanco
y se llev las muestras fueron llevadas al espectrofotmetro que
se encuentra en el tercer piso de la escuela y leyeron sus
respectivas absorbancias.

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

Calculo de la absorbancia a diferentes concentraciones el clculo se

realiz a una longitud de onda de 540 nm

Muestra Concentracin absorbancia En la Tabla. Se puede

1 0.4
2 0.6
3 0.8
4 1
observar Absorbancia
0.0034 calculada para cada una de
0.0053 las soluciones patrn, que
luego estos valores fueron
0.008 empleados para la
construccin de la curva de
0.0101
calibrado.
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concentracion - absrovancia
0.012

y = 0.0114x - 0.0013
0.01 R = 0.9959

0.008

0.006 absrovancia
Linear (absrovancia )

0.004

0.002

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Grafica 1. Concentracin vs absorbancia

En la curva de calibracin para los valores de absorbancia con respecto a

los de la concentracin de los patrones, se aprecia que vara linealmente
en funcin de la concentracin de azucares reductores.
En el grafico 1 se puede observar que la grfica no es exactamente una
recta si se aproxima bastante a dicha forma y las desviaciones de la
linealidad son posibles errores en la preparacin de las soluciones patrn,
donde afecta directamente la concentracin de las muestras y la
tendencia de la curva de calibracin.

MUESTRA ABS

ZUMO DE
NARANJA 0.007

ZUMO DE
MANGO 0.0171

Tabla de absorbancia de las muestras de zumo de naranja y mango.

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NARANJA
Hallando su concentracin:
De la ecuacin de la curva de calibracin:

= 0.0114 - 0.0013
y = Absorbancia.
x = Concentracin.

Despejando x para hallar la concentracin:

= ( + 0.0013) / 0.0114

Para el ZUMO DE NARANJA:

= (.007 .013)/ .0114

= 0.5

Concentracin del naranja: 0.5 mg/ml

Se extrajo 1ml de la muestra de naranja cuya densidad es 1.0506 g/ml y
su masa es:
=
= 1.0506 g / 1
= 1.0506 g
A esta cantidad de jugo se le afora con 100ml, de aqu se halla el factor
de dilucin:

= 1.0506/100
= 0.0105 / 1000/ 1
= 10.5 /
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Hallando la concentracin del analito en la muestra original (% de

azcares reductores):
10.5 / 0.5 /
100 /

= (100 0.5)/ 10.5

= .76%

MANGO
Hallando su concentracin:
De la ecuacin de la curva de calibracin:

= 0.0114 - 0.0013
y = Absorbancia.
x = Concentracin.

Despejando x para hallar la concentracin:

= ( + 0.0013) / 0.0114

Para el ZUMO DE NARANJA:

= (.0171 .013)/ .0114

= 1.3859

Concentracin del naranja: 1.3859 mg/ml

Se extrajo 1ml de la muestra de naranja cuya densidad es 1.0506 g/ml y
su masa es:
=
= 1.09g / 1
= 1.09 g
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A esta cantidad de jugo se le afora con 100ml, de aqu se halla el factor

de dilucin:
o
= 1.09/100
= 0.0109 / 1000/ 1
= 10.9 /

Hallando la concentracin del analito en la muestra original (% de

azcares reductores):
10.9 / 1.3859 /
100 /

= (100 1.3859)/ 10.9

= 12.7146%
V. DISCUSION

En el libro Principios de Anlisis Instrumental, de Skoog et al (2009), se

dice con respecto a las muestras que El paso siguiente es la etapa de
prediccin, en la que se obtiene la seal de respuesta para la muestra y
se usa para predecir la concentracin desconocida del analito, c-x, a partir
de la curva de calibracin o de la ecuacin de mejor ajuste. La
concentracin del analito en la muestra original se calcula luego mediante
cx aplicando los factores de dilucin convenientes tomados de los pasos
que se siguieron para preparar la muestra. Esto fue exactamente lo que
se hizo en la presente prctica. Para hallar la concentracin diluida, se
us la ecuacin de la recta de la curva de calibracin. Para hallar el
porcentaje de azcares reductores, se dividi la concentracin hallada
anteriormente entre el factor de dilucin y se le multiplic por cien. De aqu
se obtuvo que el porcentaje de azcares reductores en el zumo de naranja
es 4.76%, mientras que para el de mango es 12.7146%.

Para comparar estos resultados con los valores reportados por la

bibliografa, se busc la cantidad de Brix de las muestras. En el caso de
la naranja, este tiene 9-15Brix. Se puede apreciar que los azcares
reductores son solo una parte de los slidos solubles. Por otro lado, el
mango tiene
7-8Brix (segn bibliografa) y se puede observar que los azcares
reductores son una parte de los slidos solubles.
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VI. CONCLUSION

Se logr establecer la curva de calibracin de azucares reductores por

el mtodo espectrofotomtrico convencional. En esta curva de
calibracin se grafic la absorbancia vs la concentracin del colorante
para la observacin de azucares, arrojando la siguiente ecuacin
lineal: = 0.0114 0.0013
Se determin el % de azucares reductores en el zumo de naranja
(4.76mg/1ml).
Se determin el % de azucares reductores en el zumo de mango
(12.7146mg/1ml).

VII. RECOMENDACIONES

Usar adecuadamente los instrumentos en cuanto a mediciones en el

laboratorio ya que ellos depender que al calcular en el
espectrofotmetro los datos obtenidos sean precisos y confiables,
teniendo la mayor exactitud para realizar un muestreo perfecto.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Douglas A. Skoog, F. James Holler, Stanley R. Crouch. 2009. Principios de

anlisis instrumental, 6ta Edicin Ediciones Paraninfo.
Densimetra en Alimentos Lquidos. 2014. Disponible en:
http://www.buenastareas.com/ensayos/Densimetria-En-
AlimentosLiquidos/51150569.html
Densidad del Tomate. Disponible en:
https://tomatesalmeria.wikispaces.com/Densidad+del+Tomate
Procesamiento a pequea escala de frutas y hortalizas amaznicas nativas.
Disponible en: http://www.fao.org/docrep/x5029s/X5029S06.htm
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IX. CUESTIONARIO
1. Cules son los mtodos que determinan cualitativamente los
azucares reductores?
Descrbelos La reaccin o prueba de Benedict identifica azcares
reductores (aquellos que tienen su OH anomrico libre), como la
lactosa, la glucosa. En soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+
que tiene color azul a Cu+, que precipita de la solucin alcalina como
Cu2O de color rojo-naranja. El fundamento de esta reaccin radica en
que en un medio alcalino, el ion cprico (otorgado por el sulfato
cprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo Aldehdo del
azcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un
precipitado rojo ladrillo correspondiente al xido cuproso (Cu2O). Y
todo esto porque conta de Sulfato cprico; Citrato de sodio; Carbonato
anhidro de sodio. Esta racin dio positiva para la lactosa y glucosa
porque en el medio alcalino facilita que el azcar est de forma lineal,
puesto que el azcar en solucin forma un anillo de piransico o
furansico. Una vez que el azcar est lineal, su grupo aldehdo que
tiene un oh libre que puede reaccionar con el ion cprico en solucin;
en la sacarosa, no dan positivo puesto que sus OH anomricos estn
siendo utilizados en el enlace glucosdico. En resumen, se habla de
azcares reductores cuando tienen su OH anomrico libre, y stos son
los que dan positivo en la prueba de Benedict.
La prueba de Barfoed
Sirve para distinguir monosacridos reductores de disacridos
reductores, basndose en la velocidad de reaccin; en los
monosacridos la formacin del xido cuproso es ms rpido que en
los disacridos. Este reactivo se compone de una solucin de 0.33
molar de acetato de cobre neutro en una solucin de 1% de cido
actico. En la prueba de barfoed la reaccin es positiva para la
galactosa y ribosa, porque al utilizar acetato cprico y cido actico
con lo que solo los monosacridos son capaces de reducir el cobre,
formando as un precipitado rojo ladrillo, en tanto que el almidn es un
disacrido que tienen menor poder de reductor al tener comprometido
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uno de sus carbonos anomricos en el establecimiento del enlace

glicosdico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo.
Reaccin de Seliwanoff
Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir,
que las cetosas en el carbono 2 tienen una funcin cetona, que en
presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados
furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que est
contenido en el reactivo de Seliwanoff. La fluctos da positiva porque
pertenece al grupo cetona y como Esta prueba es especfica para
cetosas y se basa en la conversin de la cetosa en 5-hidro- metil-
furfural y su posterior condensacin con resorcinol formando as
complejos coloreados rojo o rosado. La razn por que dio negativo en
la glucosa es sencillo porque esta pertenece al grupo aldehdo como
ya aviamos mencionada anterior mente y de esta forma no puede
reaccionar con esta reaccin.

Reaccin de molish
En la reaccin de Molish, el agregado de cido sulfrico concentrado
a la leche provoca la deshidratacin del glcido en la interface, para
dar un anillo de furfural o hidroximetilfurfural que reacciona con alfa-
naftol, para dar un producto de color 17 prpura. La presencia de
carbohidratos en nuestra muestra se pone de manifiesto por la
reaccin de Molisch, Basada en la accin hidrolizante y deshidratante
del cido sulfrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reaccin el
cido sulfrico cataliza la hidrlisis de los enlaces glucosdicos de la
muestra y la deshidratacin a furfural (en las pentosas) o
hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan
con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reaccin de Molisch) dando
un producto coloreado. Prueba de Bial Es una prueba qumica para la
presencia de pentosas. Los componentes incluyen orcinol, cido
hidroclrico, y cloruro frrico. Que En presencia de una pentosa, el
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pentosoma ser deshidratado para formar furfural. La solucin dar

muestra azulada.
2. Explique porque la sacarosa y el almidn no son reductores.
La sacarosa: no presenta poder reductor porque la unin glucosdica
se establece entre el carbono 1 de la glucosa y el carbono 2 de la
fructosa, con lo cual se estabilizan las estructuras cclicas, pues se
constituye un acetal y no queda ningn hemiacetal capaz de dar una
cadena abierta por hidrlisis. El almidn: se considera un azcar no
reductor porque a pesar de que tiene carbonos anomricos libres
capaces de oxidarse, hay muy pocos en comparacin a la cantidad de
unidades de monosacridos que componen el almidn. Es decir, solo
los de los extremos de la larga cadena que compone al almidn, puede
oxidarse y calculando que una cadena de almidn (que a su vez tiene
ramificaciones) tiene ms de 10000 residuos de monosacridos,
entonces se concluye que si bien el almidn puede oxidarse, su poder
de reductor es prcticamente nulo debido al muy bajo rendimiento y
que la cantidad de carbonos libres son muy pocos, conocindose esto
como un azcar no reductor.
3. Qu funcin cumple el blanco en la medicin de la absorbancia?
Todo mtodo espectrofotomtrico se basa en la comparacin de la
absorbancia de una sustancia de concentracin desconocida con la de
una solucin de la misma sustancia cuya concentracin se conoce y a
la cual se denomina solucin patrn o estndar. La absorbancia de
una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya
concentracin se desea conocer y la de otros componentes del
sistema (solventes, reactivos) que absorben tambin a esa longitud de
onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe
descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario
hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del
sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama
blanco y la absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema
y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a
absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisin.
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4. Diferencie entre patrn interno y patrn externo

El mtodo del estndar externo
Consiste en inyectar en el equipo volmenes constantes de
disoluciones de concentraciones conocidas y crecientes del
compuesto que se pretende cuantificar; tras este proceso, se
representa la cantidad de compuesto frente al tamao del pico (rea o
altura), debindose obtener una linea recta. A partir de esta recta de
calibrado, es posible realizar la cuantificacin en una muestra
desconocida, por interpolacin grfica o matemtica del pico obtenido
en la recta de calibrado. El principal problema que plantea la
calibracin por medio de este mtodo es la reproducibilidad de la
inyeccin, o bien el control estricto de las cantidades inyectadas,
aunque tomando las debidas precauciones, la exactitud alcanzada
puede ser notablemente alta. Por otra parte, la calibracin debe
repetirse peridicamente para verificar la fiabilidad de la cuantificacin,
lo que en algunos casos puede hacer que este mtodo sea un poco
tedioso.
El mtodo de estndar interno
Se utiliza con frecuencia en el anlisis cuantitativo para compensar
posibles errores derivados de la manipulacin de la muestra. Este
mtodo consiste en 19 esencia en aadir una cantidad conocida de un
compuesto patrn a la muestra a analizar antes de realizar con ella
cualquier manipulacin; en el cromatograma, aparecern los picos
correspondientes al analito y al patrn aadido, y de la relacin entre
el tamao de ambos, podr calcularse, previo calibrado, la cantidad de
analito existente en la muestra. Para efectuar el calibrado en este
mtodo, se preparan disoluciones de concentracin creciente del
compuesto a analizar a las que se aade una cantidad idntica en
todos los casos del compuesto patrn; tras obtener los
correspondientes cromatogramas, se representa la concentracin del
compuesto a cuantificar en funcin de la relacin de los picos
problema/patrn.