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NAYARIT
UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS
QUMICO BIOLGICAS Y
FARMACUTICAS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:
QUMICO FARMACO BILOGO
PRESENTA:
DIRECTOR DE TESIS:
INDICE .................................................................................................................... 6
NDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 7
NDICE DE TABLAS ............................................................................................... 8
RESUMEN ............................................................................................................ 10
ABSTRACT ........................................................................................................ 11
I. INTRODUCCIN ............................................................................................ 12
1.1. IMPORTANCIA ECONMICA DEL FRUTO ............................................ 13
II. MARCO TERICO ......................................................................................... 15
2.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE FITOPATGENOS. ...................... 17
2.2 BACTERIAS CON EFECTO ANTAGNICO. .............................................. 17
III. JUSTIFICACIN ............................................................................................. 23
IV. OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 23
V. OBJETIVOS SECUNDARIOS ..................................................................... 23
VI. METODOLOGA ............................................................................................. 24
6.1. CEPAS BACTERIANAS ........................................................................... 24
6.2. HONGOS FITOPATGENOS ................................................................. 24
6.3. PRUEBAS DE CONFRONTACIN DUAL ............................................... 25
Experimento A Mtodo Dual. ............................................................................. 25
Experimento B Tringulo equiltero ................................................................... 25
VII. RESULTADOS Y DISCUSIN ....................................................................... 27
EFECTO ANTAGONISTA DE CEPAS DE PSEUDOMONAS FRENTE A
HONGOS FITOPATGENOS MEDIANTE EL MTODO DUAL EN EL
EXPERIMENTO A POR EL MTODO DUAL. ................................................... 27
EFECTO ANTAGONISTA DE CEPAS DE PSEUDOMONAS FRENTE A
HONGOS FITOPATGENOS MEDIANTE EL MTODO B DEL TRINGULO
EQUILTERO. ................................................................................................... 33
VIII. CONCLUSIONES ........................................................................................... 36
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. 9
IX. BIBLIOGRAFA ............................................................................................... 37
6
NDICE DE FIGURAS
7
NDICE DE TABLAS
8
AGRADECIMIENTOS
9
RESUMEN
10
ABSTRACT
11
I. INTRODUCCIN
12
El guanbano tiene un hbito de crecimiento erecto, con una alta relacin en altura
a dimetro, aunque tiende a ser baja de ramificacin y tupidas, con un repunte de
extremidades. Es pequeo, delgado, rboles perennes, de 4 a 9 m de altura cuando
est completamente maduro. Fue domesticado en las tierras bajas de Amrica del
Sur como planta de jardn (Pinto, Cordeiro, & Ferreira, 2005). Los tallos son
redondeados, rugosos y de color caf obscuro. Las hojas tienen peciolos cortos, y
son ovada-oblongas a cilndricas, de 14 a 16 cm de longitud y de 5 a 7 cm de ancho,
debido a las similitudes de la planta y forma de las hojas, la guanbana y la
guanbana de montaa (A. montana.) son a menudo confundidas. Las flores de
guanbana son ms grandes que las otras cuatro especies mencionadas, pueden
ser de 3.2 a 3.8 cm de longitud, la guanbana produce frutos ovados, cnicos o en
forma acorazonada, que son de color verde oscuro, cambian ligeramente a verde
claro cuando estn maduros. La cscara es delgada, el fruto es carnoso, sus
protuberancias son consideras popularmente como espinosas. La guanbana
tiene grandes frutos, pesan de 0.9 a 10 kg, y un peso promedio de 4 kg. La pulpa
es blanca, algodonosa, fibrosa y el jugo se asemeja al de la chirimoya. El sabor es
ms cido y menos dulce que el de chirimoya (Lon, 2005, pg. 445).
14
II. MARCO TERICO
15
En el mundo biolgico existe una interaccin continua entre los patgenos
potenciales y sus antagonistas, de forma tal que estos ltimos contribuyen para que
en la mayora de los casos no desarrollen la enfermedad. En las plantas, los
microorganismos estn en un equilibrio dinmico en su superficie en condiciones
naturales (Fernandez & Vega, 2001).
Debido a que las prdidas por pudricin afectan alrededor del 30% de la produccin
de la fruta en post cosecha se busca implementar una estrategia biolgica para
controlar dichas plagas con el uso de microrganismos que tengan la capacidad de
inhibir o retardar el crecimiento de fitopatgenos. El uso de bacterias del gnero
Pseudomonas, es una opcin prometedora en esta experimentacin para el control
biolgico de fitopatgenos. Este grupo de bacterias es un importante colonizador de
la rizsfera de plantas, adems de presentar actividad antagnica hacia diversos
fitopatgenos y ser promotoras del crecimiento (Bangera & Tomashow, 1996).
Una estrategia empleada desde hace mucho tiempo para contender contra las
enfermedades vegetales y frutales es el uso de compuestos qumicos como
plaguicidas sin embargo, se ha comprobado que estos tienen diversas
consecuencias negativas en el ambiente, as como en la salud humana (Kah &
Brown, 2006).
16
2.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE FITOPATGENOS.
17
Tabla 1. Posicin taxonmica de los diferentes fitopatgenos
Reino Fungi La colonia en Agar PDA es de color Hifas hialinas septadas y lisas, presencia de
Phylum Ascomycota amarillo pardusco en pleno mtula en la cual se adhieren las fialides, las
Clase Euascomycetes crecimiento, despus de una conidias surgen de las fialides formando cadenas
Orden Eurotiales semana la colonia se aprecia de una no ramificadas y se encuentran adheridas a estas
Familia Aspergillaceae coloracin negruzca debido a que dndole a las cabezas conoidales forma globosa.
Gnero Aspergillus complet su desarrollo, de
Especie Niger crecimiento circular y de bordes
color claro.
Reino Fungi Colonias de crecimiento rpido Hongo filamentoso que presenta esporangiforos
Divisin Eumycota cubren prcticamente toda la sin ramificar de color pardo oscuro que nacen de
Sub-divisin Zygomycotina superficie de la placa en tres das, de un nudo de rizoides bien desarrollados.
Clase Zygomycetes aspecto consistente, con denso Esporangios esfricos negros con columela y sin
Orden Mucorales micelio areo, algodonosas, al orientacin definida. Esporangiosporas negras. El
Familia Rhizopodaceae principio blancas, despus gris esporangio, esfrico, de paredes tambin oscuras
Gnero Rhizopus oscuras. Se reconoce fcilmente por que contiene los esporos. Una evaginacin de la
sus rizoides numerosos y pardos y capa interna del esporangiforo, llamado columela
sus esporangios negros. se observa en el interior del esporangio.
18
A B
C D
E F
19
Por otra parte, las Pseudomonas presentan un crecimiento rpido as como la
posibilidad de ser analizadas y manipuladas por un conjunto de tcnicas genticas.
En conjunto, todas estas caractersticas las coloca como bacterias putativas para el
control biolgico contra fitopatgenos (Madigan & Martiniko, 2005).
Los siderforos son molculas de bajo peso molecular, sintetizadas por bacterias y
algunos hongos como respuesta a la condicin de estrs generada por la baja
disponibilidad de hierro; son consideradas como agentes quelantes de alta afinidad
y su funcin es tomar el hierro del ambiente y volverlo mineral, dejndolo disponible
para la clula. Las investigaciones en este campo empezaron alrededor de cinco
dcadas atrs y el inters ha aumentado con el descubrimiento de que la mayora
de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos sintetizan al menos un
siderforo (Winkelmann, 1991).
20
Por lo anterior, la caracterizacin y seleccin de cepas autctonas de estos gneros,
que muestran efecto antagnico ante patgenos que atacan a cultivos de
importancia econmica, pueden ser tiles en sus potencialidades como agentes de
control biolgico con fines fitosanitarios.
21
Tabla 2. Caractersticas de las especies de Pseudomonas con importancia antagonista.
Caractersticas de las especies de Pseudomononas
P. aeruginosa Microorganismo comn en el medio ambiente y puede encontrarse en las heces, el suelo, el agua y las
aguas residuales. Puede proliferar en ambientes acuticos, as como en la superficie de materias
orgnicas propicias en contacto con el agua. P. aeruginosa es una fuente conocida de infecciones
intrahospitalarias y puede producir complicaciones graves. Se han aislado en gran variedad de
ambientes hmedos, como fregaderos, baos de agua, sistemas de distribucin de agua caliente,
duchas y baeras de hidromasaje. (9)
P. fluorescens Poseen varios flagelos polares. Son conocidas por su capacidad de estimular el crecimiento de las
plantas que viven en contacto con ellas (10). Especie: fluorescens Migula.
Sus flagelos polares hacen posible su movimiento activo en lquido. Su pigmento fluorescente
(fluorescena) la hace reaccionar frente a la luz ultravioleta, aunque algunas veces no fluoresce cuando
el cultivo es reciente o despus de varios cultivos de laboratorio.
Brevundimonas Bacilo Gramnegativo previamente asignado al gnero Pseudomonas. Su nombre se deriva de las
palabras latinas brevis (corto), unda (onda) y minutus (pequeo), y de la palabra griega monas (unidad),
el cual permite recordarla como una pequea bacteria con un flagelo con longitud de onda corta.
diminuta
Las especies de Brevundimonas spp son no fermentadoras de lactosa, aerbicas, no esporuladas y
o mviles; son microorganismos ambientales con distribucin mundial aislados del agua, el suelo, las
plantas y ocasionalmente de especmenes clnicos.
En la industria se usan distintas cepas de B. diminuta para purificar desechos industriales y disminuir
Pseudomonas diminuta
as, por ejemplo, los nitratos y estrgenos liberados al agua o los niveles de CO 2 liberados a la
atmsfera y responsables del llamado efecto invernadero (9).
22
III. JUSTIFICACIN
Evaluar el efecto inhibitorio del crecimiento in vitro de los hongos Aspergillus nger,
Aspergillus ochraceus y Rhizopus spp., producido por los metabolitos secundarios
de Pseudomonas spp.
V. OBJETIVOS SECUNDARIOS
23
VI. METODOLOGA
24
6.3. PRUEBAS DE CONFRONTACIN DUAL
26
VII. RESULTADOS Y DISCUSIN
Los resultados que obtuvimos de la evaluacin del enfrentamiento entre los hongos
fitopatgenos aislados y las bacterias antagonistas del gnero Pseudomonas,
mediante dos mtodos (experimentos A y B), se muestran a continuacin.
Estos resultados concuerdan con otros trabajos donde se reporta que P.fluorescens
inhibe a patgenos de plantas Colletotrichum lindemuthianum (76%), Colletotrichum
gloesporioides (72%) y Phytophthora cinnamom. (70%), (Santoyo, Valencia
27
Cantero, & Orozco, 2010). No as con P.diminuta que mostr diferente actividad,
para el patgeno A.ochraceus se obtuvo una inhibicin del 50%, el crecimiento del
micelio de A.niger fue inhibido en un 46% y para Rhizopus spp solo el 19%.
Pudiendo deberse a la gran variedad de compuestos con efectos antimicrobianos
que sintetizan las bacterias Pseudomonas.
Tabla 4. Inhibicin del crecimiento de los hongos A.ochraceus, A. niger y Rhizoppus spp.,
por las cepas P.diminuta, P.aeruginosa y P.fluorescens % de inhibicin se obtuvo respecto
al control. Las mediciones del dimetro del micelio se realizaron a los 7 das a 25C.
28
Pseudomonas diminuta vs Hongos fitopatgenos
8
7
Centimetros (Cm.)
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7
Das
PdvsA.och Control PdvsRhizop
Control PdvsA.niger Control
29
En la evaluacion in vitro de P.fluorescens frente a los hongos fitopatgenos, se
obtuvo un 100% de inhibicion frente a los hongos Rhizopus spp. y A. ochraceus
durante los 7 dias de enfrentamiento, A. niger mostr un 46% de inhibicion durante
los primeros 7 dias respecto a su control ( Figura 6 ) observando que el crecimiento
micelial tamben inicia despus del tercer da de incubacin, y despes del claro
crecimiento micelial del da cuarto, este se vuelve muy lento hasta el ltimo da de
incubacin.
En la Figura 7 se muestra la completa inhibicin micelial de Rhizopus spp frente a
P. fluorescens, durante los das de incubacin. Observando que Rhizopus no tuvo
contacto con la bacteria, pudiendo sugerir que P. fluorescens presenta algunos
antibiticos difusivos, como lo reportan (Valencia-Cantero, 2005) frente a Fusarium
oxysporum.
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7
Das
PfvsA.och Control PfvsRhizop Control PfvsA.niger Control
30
FIGURA 7. Enfrentamiento de P. fluorescens frente a Rhizopus spp
junto a su control de 7 das.
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Pseudomonas aeruginosa vs Hongos fitopatgenos
8
7
Centimetros (cm.)
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7
Das
PavsA.och Control PavsRhizop
32
EFECTO ANTAGONISTA DE CEPAS DE PSEUDOMONAS FRENTE
A HONGOS FITOPATGENOS MEDIANTE EL MTODO B DEL
TRINGULO EQUILTERO.
Este segundo mtodo tambin se realiz por duplicado y los resultados fueron los
siguientes; Se observ que P. fluorescens present mayor efecto antagnico en el
crecimiento micelial de A.niger, seguido de P. diminuta y P. aeruginosa. El efecto
antagnico se muestra en la Figura 6.
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Se observ en los resultados un alto porcentaje de inhibicin del crecimiento micelial
de los hongos fitopatgenos, en especial por P. fluorescens, ya que en los
experimentos por el mtodo dual se present un 100% de inhibicin frente a los
hongos A. ochraceus, Rhizopus sp. y un 69% de inhibicin frente A. niger, el
porcentaje de inhibicin se obtuvo en base al crecimiento micelial de los controles
de los hongos fitopatgenos. Al igual P. aeruginosa mostr un 100% de inhibicin
frente a los hongos fitopatgenos A. ochraceus y Rhizopus spp, y un 48 % de
inhibicin frente A.niger (Figura 8), por P. diminuta el efecto inhibitorio fue menor,
se observ un 50% frente A.ochraceus, un 19% frente a Rhizopus spp y un 46%
frente A.niger (Figura 4). Estas especies de Pseudomonas producen ciertos
metabolitos secundarios antifngicos entre ellos siderforos, pioverdina los cuales
en condiciones estrictas forman parte de los mecanismos de control de las
enfermedades causadas por hongos y bacterias fitopatgenas por la competicin
con el in frrico donde forman quelatos con stos y causan inhibicin al patgeno
por no disponer de ste. En los resultados Rhizopus spp aislado de la guanbana
fue inhibido por los metabolitos de las bacterias P. aeruginosa y P. fluorescens, en
un menor porcentaje la inhibicin frente a Pseudomonas diminuta. El antagonismo
microbiano est dado por la inhibicin, deterioro o muerte de alguna especie de
microorganismos por la accin de otra; o una relacin entre dos poblaciones en la
cual una de ellas causa efectos deletreos o negativos a la otra. En la naturaleza
existe una interaccin continua entre los patgenos potenciales y sus antagonistas,
de forma tal que estos ltimos contribuyen a que en muchos casos no se desarrolle
la enfermedad (Perez, Coto, Echmendia, & Avila, 2015).
34
para su uso en los cultivos agrcolas como agentes de control biolgico (Araya,
2003). Por ejemplo, la cepa ZUM80 suprime significativamente el crecimiento del
patgeno de frijol Colletotrichum lindemuthianum Briosi & Cavaray, y de los
patgenos de aguacate Colletotrichum gloeosporioides Penz y Phytophthora
cinnamomi (Tran & Ficke, 2007).
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VIII. CONCLUSIONES
De las tres cepas utilizadas en las pruebas de confrontacin por el mtodo dual se
logr evaluar el porcentaje de inhibicin frente a los hongos fitopatgenos aislados
de guanbana que producen daos en temporada de post cosecha, donde se
coincide en que existen diferentes mecanismos posibles por los que las
Pseudomonas suprimen y retrasan las enfermedades fungosas. Los mecanismos
ms importantes que incluyen la inhibicin de los patgenos por compuestos
antimicrobianos, la competencia por el hierro, la competicin por sitios de
colonizacin y por los nutrientes exudados por la raz, as como la induccin de
mecanismos de defensa en las plantas.
La inhibicin del patgeno por la produccin de metabolitos antimicrobianos o
queladores de hierro son los que estn considerados como los principales
mecanismos de biocontrol.
36
IX. BIBLIOGRAFA
37
16. SAGARPA. (13 de Agosto de 2015). SAGARPA. Informacion general de
Frutos Tropicales Annonas. DF, Ciudad de Mxico, Mxico .
17. Santoyo, G., Valencia Cantero, E., & Orozco, M. (2010). Papel de los
sideroforos en la actividad antagonica de Pseudomonas fluorescens ZUM80
hacia hongos fitopatogenos. Tierra Latinoamericana.
18. Tran , H., & Ficke, A. (2007). the Cyclic Lipopeptide Massetolidea in Biological
Control of Phytophthora infestans and in Colonization of Tomato Plants by
Pseudomonas fluorescens. New Phytologist.
19. Trigos, A., Ramirez, K., & Salinas, A. (2008). Presencia de hongos
fitopatogenos en hortalizas y su relacion en la seguridad alimentaria. Xalapa,
Veracruz, Mxico: Laboratorio de Ciencias basicas, Universidad
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fitopatogenos del arroz y el maz. Revista de Proteccion vegetal.
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22. Winkelmann, G. (1991). Specificity of iron transport in bacteria and fungi.
Florida: CRC press Boca.
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