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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE

NAYARIT
UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS
QUMICO BIOLGICAS Y
FARMACUTICAS

INHIBICIN DE HONGOS FITOPATGENOS DE


GUANBANA (Annona muricata L.) MEDIANTE
METABOLITOS SEGREGADOS DE BACTERIAS
Pseudomonas spp.

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:
QUMICO FARMACO BILOGO

PRESENTA:

AGUIAR TIRADO ELAS ALBERTO

DIRECTOR DE TESIS:

Dra. ADELA YOLANDA BUENO DURN.


INDICE

INDICE .................................................................................................................... 6
NDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 7
NDICE DE TABLAS ............................................................................................... 8
RESUMEN ............................................................................................................ 10
ABSTRACT ........................................................................................................ 11
I. INTRODUCCIN ............................................................................................ 12
1.1. IMPORTANCIA ECONMICA DEL FRUTO ............................................ 13
II. MARCO TERICO ......................................................................................... 15
2.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE FITOPATGENOS. ...................... 17
2.2 BACTERIAS CON EFECTO ANTAGNICO. .............................................. 17
III. JUSTIFICACIN ............................................................................................. 23
IV. OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 23
V. OBJETIVOS SECUNDARIOS ..................................................................... 23
VI. METODOLOGA ............................................................................................. 24
6.1. CEPAS BACTERIANAS ........................................................................... 24
6.2. HONGOS FITOPATGENOS ................................................................. 24
6.3. PRUEBAS DE CONFRONTACIN DUAL ............................................... 25
Experimento A Mtodo Dual. ............................................................................. 25
Experimento B Tringulo equiltero ................................................................... 25
VII. RESULTADOS Y DISCUSIN ....................................................................... 27
EFECTO ANTAGONISTA DE CEPAS DE PSEUDOMONAS FRENTE A
HONGOS FITOPATGENOS MEDIANTE EL MTODO DUAL EN EL
EXPERIMENTO A POR EL MTODO DUAL. ................................................... 27
EFECTO ANTAGONISTA DE CEPAS DE PSEUDOMONAS FRENTE A
HONGOS FITOPATGENOS MEDIANTE EL MTODO B DEL TRINGULO
EQUILTERO. ................................................................................................... 33
VIII. CONCLUSIONES ........................................................................................... 36
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. 9
IX. BIBLIOGRAFA ............................................................................................... 37

6
NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Distribucin potencial de la guanbana (a. Muricata l.) En mxico. ...... 15


Figura 2. Izquierda: imagen macroscpica (a, c y e) y microscpica 40x (b, d y f)
con coloracin azul de lactofenol de a. Niger (a y b), rhizopus spp., (c y d) y a.
Ochraceus (e y f). ........................................................................................... 19
Figura 3. Mtodo del tringulo equiltero para antagonismo de bacterias
pseudomonas frente a hongos fitopatgenos aislados de guanbana. .......... 26
Figura 4 enfrentamiento in vitro entre p. Diminuta y hongos fitopatgenos. ......... 29
Figura 5 enfrentamiento in vitro por 7 das p. Diminuta frente a. Nger. ............... 29
Figura 6 enfrentamiento in vitro entre p. Fluorescens y hongos fitopatgenos. ... 30
Figura 7. Enfrentamiento de p. Fluorescens frente a rhizopus spp junto a su
control de 7 das. ............................................................................................ 31
Figura 8 enfrentamiento in vitro entre p. Aeruginosa y hongos fitopatgenos. ..... 32
Figura 9. Inhibicin de a. Ochraceus por metabolitos de p. Aeruginosa durante 7
das. ................................................................................................................ 32
Figura 10. Representacin in vitro del antagonismo de pseudomonas frente a a.
Niger. .............................................................................................................. 33
Figura 11. Representacin in vitro del antagonismo de pseudomonas frente a
rhizopus spp. .................................................................................................. 33

7
NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Posicin taxonmica de los diferentes fitopatgenos.............................. 18


Tabla 2. Caractersticas de las especies de pseudomonas con importancia .
Caracteristicas cepas Pseudomonas .............................................................. 22
Tabla 3. Pd, pa, pf y su control correspondiente, frente a A.ochraceus (1), A.niger
(2) y Rhizopus spp (3) (0 = inhibicin del hongo sin crecimiento; % =
porcentaje de inhibicin calculado respecto al control). .................................. 27
Tabla 4. Inhibicin del crecimiento de los hongos A.ochraceus, A.niger y
Rhizoppus spp., por las cepas P.diminuta, P.aeruginosa y P.fluorescens % de
inhibicin se obtuvo respecto al control. Las mediciones del dimetro del
micelio se realizaron a los 7 das a 25c ......................................................... 28

8
AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado gracias al apoyo de la unidad acadmica de Ciencias


Qumico Biolgicas y Farmacuticas de la Universidad Autnoma de Nayarit, al
Laboratorio del Centro Nayarita de Innovacin Transferencia y Tecnologa.
(CENIT2), a la Dra. Adela Yolanda Bueno Duran, a mis sinodales QFB Roci Gpe.
Barcelos Garca, M.C Herminia Gpe. Ventura Ramn, Dra. Vernica Alejandra
Mondragn Jaimes y a los estudiantes de servicio ngel Alberto Gonzlez Prez,
Lupita Salvatierra Figueroa, Dalia Itzel Ramos Jara y Alejandra Celeste Cervantes
Mercado.

9
RESUMEN

El antagonismo microbiano es una relacin deletrea o negativa; es la


inhibicin, deterioro o muerte de un microorganismo por accin de otro.
El objetivo de este estudio fue determinar el efecto antagnico de
diferentes cepas aisladas del fruto en post cosecha de la Guanbana
(Annona muricata L.) cultivado en el Estado de Nayarit, contra hongos
fitopatgenos. Se utilizaron 3 cepas de Pseudomonas de las cuales
presentaron antagonismo frente a los hongos: Rhizopus sp, Aspergillus
ochraceus y en un menor margen de inhibicin a Aspergillus nger en
los ensayos in vitro en confrontacin por el mtodo dual y por el mtodo
del tringulo equiltero, donde las cepas con un mayor porcentaje de
inhibicin in vitro Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas
aeruginosa.

En general, los antagonistas no tienen un nico modo de accin y la


multiplicidad de mecanismos de accin es una caracterstica para
seleccionarlos. Por lo que se ha tratado de aprovechar las relaciones
antagonistas entre las poblaciones microbianas, para controlar
patgenos vegetales debido al efecto antagnico.

10
ABSTRACT

Microbial antagonism is a deleterious or negative relationship; is the


inhibition, deterioration or death of one microorganism by the action of
another. The objective of this study was to determine the antagonistic
effect of different strains isolated from the post - harvest fruit of
Guanbana (Annona muricata L.) grown in the State of Nayarit against
phytopathogenic fungi. Three strains of Pseudomonas were used, of
which they presented antagonism against the fungi: Rhizopus sp,
Aspergillus ochraceus and in a smaller margin of inhibition to Aspergillus
niger in the in vitro tests in confrontation by the dual method and by the
equilateral triangle method, where strains with a higher percentage of
inhibition in vitro Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas
aeruginosa.

In general, antagonists do not have a single mode of action and the


multiplicity of mechanisms of action is a characteristic to select them. So
we have tried to take advantage of the antagonistic relations between
microbial populations, to control plant pathogens due to the antagonistic
effect.

11
I. INTRODUCCIN

De acuerdo con el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y


Pecuarias (INIFAP) de Mxico, este pas es el principal productor de guanbana en
el mundo, con una oferta que alcanza las 19.841 toneladas al ao y un valor
comercial de alrededor de 104 millones de pesos m.n., las cosechas de guanbana
(Annona muricata) son severamente afectadas por la presencia de patgenos
durante su maduracin, los cuales pueden causar daos significativos en la
produccin y prdida econmica. Es un fruto que ha tenido una demanda
significativa en el pas con mayor produccin ao tras ao.

Estudios recientes ubican en Mxico 14 gneros y 63 especies de la familia


Annonaceae hasta ahora identificados y de stas las de mayor importancia
econmica son: guanbana (A. muricata), chirimoya (A. cherimola), anonna
colorada o amarilla (A. reticulata). Solamente guanbana y chirimoya se cultivan en
Mxico con fines comerciales (2200 hectreas), el resto de las especies se
encuentran en traspatio o en la vegetacin natural de donde se recolectan los frutos
para consumo en fresco. La guanbana es, por lo tanto, la especie de Annona de
mayor cultivo a nivel comercial en Mxico cuyo uso principal es la obtencin de
pulpa congelada para la elaboracin de productos tales como helados, paletas,
licores, jugos y mermeladas, y para el aprovechamiento de la pulpa para consumo
en fresco, el potencial de cultivo de las anonas es alto en Mxico por contar con
grandes reas tropicales y subtropicales. El crecimiento de la superficie nacional ha
sido sostenido, aunque en pequea escala, habiendo algunos factores que han
limitado el crecimiento en mayor proporcin. En general, en Mxico falta mucho por
investigar en el manejo agronmico de la guanbana. Desde hace tres aos, el
INIFAP a travs de Campo Experimental Santiago Ixcuintla, ha realizado estudios
enfocndose en el aspecto fitosanitario del cultivo. Temas como nutricin, fenologa,
mejoramiento gentico y manejo postcosecha han sido poco explorados (INIFAP,
2015).

12
El guanbano tiene un hbito de crecimiento erecto, con una alta relacin en altura
a dimetro, aunque tiende a ser baja de ramificacin y tupidas, con un repunte de
extremidades. Es pequeo, delgado, rboles perennes, de 4 a 9 m de altura cuando
est completamente maduro. Fue domesticado en las tierras bajas de Amrica del
Sur como planta de jardn (Pinto, Cordeiro, & Ferreira, 2005). Los tallos son
redondeados, rugosos y de color caf obscuro. Las hojas tienen peciolos cortos, y
son ovada-oblongas a cilndricas, de 14 a 16 cm de longitud y de 5 a 7 cm de ancho,
debido a las similitudes de la planta y forma de las hojas, la guanbana y la
guanbana de montaa (A. montana.) son a menudo confundidas. Las flores de
guanbana son ms grandes que las otras cuatro especies mencionadas, pueden
ser de 3.2 a 3.8 cm de longitud, la guanbana produce frutos ovados, cnicos o en
forma acorazonada, que son de color verde oscuro, cambian ligeramente a verde
claro cuando estn maduros. La cscara es delgada, el fruto es carnoso, sus
protuberancias son consideras popularmente como espinosas. La guanbana
tiene grandes frutos, pesan de 0.9 a 10 kg, y un peso promedio de 4 kg. La pulpa
es blanca, algodonosa, fibrosa y el jugo se asemeja al de la chirimoya. El sabor es
ms cido y menos dulce que el de chirimoya (Lon, 2005, pg. 445).

1.1. IMPORTANCIA ECONMICA DEL FRUTO

El valor econmico est relacionado principalmente por el uso alimenticio ya que


son frutas de pulpa dulce o agridulce y de alto valor nutritivo, adems de ser muy
atractivos y exticos. Son fuentes importantes de carbohidratos, minerales y
vitaminas, particularmente la guanbana es uno de los frutos cultivados con la
mayor superficie en Mxico y sus propiedades nutricionales se caracterizan por la
aportacin de caloras, carbohidratos, fibra, grasa, protena, cido ascrbico, calcio,
fsforo, hierro y vitaminas, segn estudios realizados de la pulpa sobre el contenido
nutricional.

Tambin se puede medir la importancia econmica por su aplicacin medicinal,


ornamental, como insecticidas biolgicos, extraccin de esencias y aceites, para
cercos vivos, lea, madera para elaboracin de herramientas de trabajo y otros
usos. El consumo de la pulpa tambin puede ser como productos elaborados en
13
jugos, helados, paletas, licores de inigualable sabor, dulces, gelatinas, nctar y
jaleas. La corteza, hojas y races de algunas especies se utilizan en medicamentos
populares. La industria farmacutica ha encontrado antifngicos, bacteriostticos,
citostticos y especialmente la capacidad de algunos componentes qumicos de las
hojas y corteza. Un gran nmero de compuestos qumicos, entre ellos flavonoides,
alcaloides y acetogeninas, se han extrado de las semillas y muchas otras partes de
estas plantas. Los flavonoides y alcaloides han demostrado propiedades
antibacterianas, y se han utilizado para los tratamientos mdicos, tales como
enfermedades de la piel, parsitos intestinales y la inflamacin del ojo (Morton,
1987).

De acuerdo con datos estadsticos de produccin de la (SAGARPA, 2015) para el


caso de la guanbana se sembraron 2,340 hectreas, cosechndose 2,230
hectreas con una produccin de 17,796 toneladas de fruta. Destacan en su
produccin los estados de Nayarit, Colima, Guerrero y Michoacn, principalmente.
El estado de Nayarit, segn el Sistema Producto Guanbana de Nayarit seala que
actualmente figura como uno de los principales productores de esta fruta. Destina
una superficie aproximada de 2,029 hectreas con una produccin de 14,365.20
toneladas anuales. En el periodo 2000-2007, la superficie nacional de produccin,
se increment en un 41.5 %, siendo el estado de Nayarit el de mayor importancia
con un 75 % de produccin a nivel nacional.

La zona de cultivo ocupada por la guanbana Nayarita se encuentra situada en los


municipios de Compostela, entre Las Varas y la Peita de Jaltemba y San Blas en
la zona costera. Su extensin representa unas 2,400 hectreas, en posesin de un
nmero aproximado de unos 300 productores. Esta superficie permite ubicar a la
guanbana como la principal especie de la familia Annonacea que se cultiva en
Mxico. El propsito del cultivo es para la obtencin de frutos para consumo en
fresco o pulpa procesada en aguas frescas, elaboracin de helados, paletas, licores
y mermeladas para el mercado nacional. Actualmente, la pulpa de la fruta mexicana
se exporta a EE.UU. y los productores del Estado de Nayarit la venden en fresco a
tiendas de autoservicio a nivel local.

14
II. MARCO TERICO

La guanbana es una especie de distribucin tropical en altitudes de 0 a 900 metros


sobre el nivel del mar. Debido a lo anterior se distribuye mundialmente en las
siguientes regiones: El Caribe principalmente: (Bermudas, Bahamas, Cuba,
Repblica Dominicana, St. Vincent, Granada) Centroamrica (sur de Mxico, Costa
Rica) Sudamrica (Colombia, Venezuela, Brasil), El sureste de China, Vietnam,
Australia, Nueva Zelanda, frica y en las islas del Pacfico, entre otros. En el estado
de la Florida (E.U.A.) hay pequeos cultivos comerciales (Vidal y Nieto, 1997).
En el interior de la Repblica se distribuye en reas de clima clido en zonas
costeras de Veracruz, Tabasco, Quintana Roo, Nayarit, Colima, Michoacn,
Oaxaca, Guerrero, Yucatn y Chiapas, estados con mayorpotencial que el que
actualmente cultivan.

FIGURA 1. Distribucin potencial de la guanbana (A. muricata L.) en Mxico.

15
En el mundo biolgico existe una interaccin continua entre los patgenos
potenciales y sus antagonistas, de forma tal que estos ltimos contribuyen para que
en la mayora de los casos no desarrollen la enfermedad. En las plantas, los
microorganismos estn en un equilibrio dinmico en su superficie en condiciones
naturales (Fernandez & Vega, 2001).

Cuando las poblaciones de organismos se encuentran reducidas debido a las


acciones naturales de sus depredadores, parsitos, antagonistas y enfermedades,
el proceso se conoce como control natural, pero cuando se utiliza para el control
de plagas es llamado control biolgico o biocontrol (Hajek, 2004). En patologa
vegetal el trmino es aplicado para el uso de antagonistas microbianos que
suprimen enfermedades, as como el uso de huspedes patgenos especficos para
el control de malezas (Pal & McSpadden, 2006).

El antagonismo microbiano est dado por la inhibicin, deterioro o muerte de alguna


especie de microorganismos por la accin de otra; o una relacin entre dos
poblaciones en la cual una de ellas causa efectos deletreos o negativos a la otra.

Debido a que las prdidas por pudricin afectan alrededor del 30% de la produccin
de la fruta en post cosecha se busca implementar una estrategia biolgica para
controlar dichas plagas con el uso de microrganismos que tengan la capacidad de
inhibir o retardar el crecimiento de fitopatgenos. El uso de bacterias del gnero
Pseudomonas, es una opcin prometedora en esta experimentacin para el control
biolgico de fitopatgenos. Este grupo de bacterias es un importante colonizador de
la rizsfera de plantas, adems de presentar actividad antagnica hacia diversos
fitopatgenos y ser promotoras del crecimiento (Bangera & Tomashow, 1996).

Una estrategia empleada desde hace mucho tiempo para contender contra las
enfermedades vegetales y frutales es el uso de compuestos qumicos como
plaguicidas sin embargo, se ha comprobado que estos tienen diversas
consecuencias negativas en el ambiente, as como en la salud humana (Kah &
Brown, 2006).

16
2.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE FITOPATGENOS.

Los hongos son organismos eucariontes que se desarrollan bajo condiciones de


humedad con actividad de agua (aw) mayora 0.7 y a temperatura de 25CEstos
organismos, son de nutricin hetertrofa, que descomponen materia orgnica por
medio de enzimas, absorbiendo las sustancias nutritivas (Hernandez, Rives,
Caballero, & Heydrich, 2004). Se tienen referencias que entre las principales
especies fitopatgenas que afectan a las anonas (o guanbana), se encuentran
algunas del gnero Aspergillus y Rhizopus. La posicin taxonmica de estas
especies, se tomaron del National Center for Biotechnology Information
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/) y su morfologa se
describe en la Tabla 1 y se muestra en la figura 1.

El uso de plaguicidas qumicos para el control de enfermedades y plagas en los


cultivos, han daado al ecosistema, por lo que actualmente se buscan opciones
biolgicas que permitan disminuir su uso. Es por ello que se recurre a la
caracterizacin de microorganismos aislados del suelo o sus metabolitos, para
proponerlos como alternativas de control. Se sabe que las bacterias pueden
desempear una accin antagonista en contra del crecimiento fngico, entre ellas
se han descrito varias de las especies de Pseudomonas.

2.2 BACTERIAS CON EFECTO ANTAGNICO.

Dentro de los grupos bacterianos ms estudiados con capacidad de producir


reguladores de crecimiento vegetal, se encuentran las bacterias de los gneros
Pseudomonas y Burkholderia. Estos grupos tienen, la capacidad de producir
metabolitos con efecto antagnico y represivo del crecimiento de patgenos en la
rizsfera (Trigos, Ramirez, & Salinas, 2008).

17
Tabla 1. Posicin taxonmica de los diferentes fitopatgenos

Taxonoma Nomenclatura Descripcin macroscpica Descripcin microscpica

Reino Fungi La colonia en Agar PDA es de color Hifas hialinas septadas y lisas, presencia de
Phylum Ascomycota amarillo pardusco en pleno mtula en la cual se adhieren las fialides, las
Clase Euascomycetes crecimiento, despus de una conidias surgen de las fialides formando cadenas
Orden Eurotiales semana la colonia se aprecia de una no ramificadas y se encuentran adheridas a estas
Familia Aspergillaceae coloracin negruzca debido a que dndole a las cabezas conoidales forma globosa.
Gnero Aspergillus complet su desarrollo, de
Especie Niger crecimiento circular y de bordes
color claro.
Reino Fungi Colonias de crecimiento rpido Hongo filamentoso que presenta esporangiforos
Divisin Eumycota cubren prcticamente toda la sin ramificar de color pardo oscuro que nacen de
Sub-divisin Zygomycotina superficie de la placa en tres das, de un nudo de rizoides bien desarrollados.
Clase Zygomycetes aspecto consistente, con denso Esporangios esfricos negros con columela y sin
Orden Mucorales micelio areo, algodonosas, al orientacin definida. Esporangiosporas negras. El
Familia Rhizopodaceae principio blancas, despus gris esporangio, esfrico, de paredes tambin oscuras
Gnero Rhizopus oscuras. Se reconoce fcilmente por que contiene los esporos. Una evaginacin de la
sus rizoides numerosos y pardos y capa interna del esporangiforo, llamado columela
sus esporangios negros. se observa en el interior del esporangio.

Reino: Fungi Descripcin Descripcin microscpica: Conidiforo caf, de


Phylum: Ascomycota macroscpica: Colonias de pared rugosa. Vesculas esfricas, de pared
Clase: Eurotiomycetes crecimiento restringido, planas, delgada, hialina, biseriada. Las
Orden Eurotiales granulares, de color amarillo- metulas__recubren toda la vescula. Conidias
Familia Trichocomaceae naranja, caf o crema. esfricas, de pared delgada, finamente rugosa.
Gnero Aspergillus
Especie Ochraceus

18
A B

C D

E F

FIGURA 2. Izquierda: Imagen macroscpica (A, C y E) y microscpica 40x (B, D


y F) con coloracin azul de lactofenol de A. niger (A y B), Rhizopus spp., (C y D)
y A. ochraceus (E y F).

19
Por otra parte, las Pseudomonas presentan un crecimiento rpido as como la
posibilidad de ser analizadas y manipuladas por un conjunto de tcnicas genticas.
En conjunto, todas estas caractersticas las coloca como bacterias putativas para el
control biolgico contra fitopatgenos (Madigan & Martiniko, 2005).

Adems, existen diversas investigaciones que mencionan la produccin de


metabolitos antimicrobianos a partir de Pseudomonas spp. como un mecanismo
para el control biolgico de hongos fitopatgenos, por lo que el hallazgo de una cepa
con dichas caractersticas podra proponerse como un producto biolgico con fines
fitosanitarios.

Los mecanismos de accin de estas bacterias en contra de fitopatgenos son


diversos. Investigaciones han mostrado que varias especies de Pseudomonas
producen antibiticos como pirrolnitrina, 2,4-diacetilfloroglucinol, piocianina y el
cido fenacn-1-carboxlico, adems de los siderforos y bacteriocinas (Santoyo,
Valencia Cantero, & Orozco, 2010). La sntesis de estos metabolitos secundarios
participa en el biocontrol de diversos fitopatgenos. Particularmente, a la sntesis de
siderforos por Pseudomonas fluorescentes se les ha atribuido un enorme inters
por participar en la promocin del crecimiento vegetal y suprimir el crecimiento de
patgenos de raz (Kloepper, Leong, & Teintze, 1980). Se ha propuesto que tales
compuestos pueden secuestrar el hierro del ambiente rizosfrico, impidiendo que
sea disponible para los patgenos.

Los siderforos son molculas de bajo peso molecular, sintetizadas por bacterias y
algunos hongos como respuesta a la condicin de estrs generada por la baja
disponibilidad de hierro; son consideradas como agentes quelantes de alta afinidad
y su funcin es tomar el hierro del ambiente y volverlo mineral, dejndolo disponible
para la clula. Las investigaciones en este campo empezaron alrededor de cinco
dcadas atrs y el inters ha aumentado con el descubrimiento de que la mayora
de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos sintetizan al menos un
siderforo (Winkelmann, 1991).

20
Por lo anterior, la caracterizacin y seleccin de cepas autctonas de estos gneros,
que muestran efecto antagnico ante patgenos que atacan a cultivos de
importancia econmica, pueden ser tiles en sus potencialidades como agentes de
control biolgico con fines fitosanitarios.

Las caractersticas de las bacterias del gnero Pseudomonas las ubican


taxonmicamente en:
Reino: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Gnero: Pseudomonas.

Estas bacterias son bacilos gramnegativos aerobios con un o ms flagelos


polares. Las Pseudomonas fluorescentes producen catalasa y oxidasa, as como
amoniaco a partir de la arginina, y puede utilizar citrato como nica fuente de
carbono. Cuando se cultivan en medios adecuados produce piocianina, un
pigmento azulado no fluorescente. Muchas cepas producen tambin el pigmento
verde fluorescente, llamado pioverdina. Las especies de inters para este
trabajo, se describen en la Tabla 2.

21
Tabla 2. Caractersticas de las especies de Pseudomonas con importancia antagonista.
Caractersticas de las especies de Pseudomononas
P. aeruginosa Microorganismo comn en el medio ambiente y puede encontrarse en las heces, el suelo, el agua y las
aguas residuales. Puede proliferar en ambientes acuticos, as como en la superficie de materias
orgnicas propicias en contacto con el agua. P. aeruginosa es una fuente conocida de infecciones
intrahospitalarias y puede producir complicaciones graves. Se han aislado en gran variedad de
ambientes hmedos, como fregaderos, baos de agua, sistemas de distribucin de agua caliente,
duchas y baeras de hidromasaje. (9)

P. fluorescens Poseen varios flagelos polares. Son conocidas por su capacidad de estimular el crecimiento de las
plantas que viven en contacto con ellas (10). Especie: fluorescens Migula.

Son saprofticas y se pueden encontrar en ecosistemas acuticos y en el suelo. No forman esporas y


el rango de temperatura ms favorable para su desarrollo es de 25 a 30C, aunque puede crecer desde
5 a 42C. Requiere un pH neutro y no crece en condiciones cidas (pH 4,5).

Sus flagelos polares hacen posible su movimiento activo en lquido. Su pigmento fluorescente
(fluorescena) la hace reaccionar frente a la luz ultravioleta, aunque algunas veces no fluoresce cuando
el cultivo es reciente o despus de varios cultivos de laboratorio.

Brevundimonas Bacilo Gramnegativo previamente asignado al gnero Pseudomonas. Su nombre se deriva de las
palabras latinas brevis (corto), unda (onda) y minutus (pequeo), y de la palabra griega monas (unidad),
el cual permite recordarla como una pequea bacteria con un flagelo con longitud de onda corta.
diminuta
Las especies de Brevundimonas spp son no fermentadoras de lactosa, aerbicas, no esporuladas y
o mviles; son microorganismos ambientales con distribucin mundial aislados del agua, el suelo, las
plantas y ocasionalmente de especmenes clnicos.
En la industria se usan distintas cepas de B. diminuta para purificar desechos industriales y disminuir
Pseudomonas diminuta
as, por ejemplo, los nitratos y estrgenos liberados al agua o los niveles de CO 2 liberados a la
atmsfera y responsables del llamado efecto invernadero (9).

22
III. JUSTIFICACIN

El trabajo de investigacin surge de la necesidad de reducir prdidas post cosecha


en el estado de Nayarit, siendo este el principal productor de Guanbana en el pas,
este dao causado por hongos fitopatgenos buscando una solucin por la
inhibicin del crecimiento de estos hongos por la accin antagnica de los
metabolitos secundarios de varias especies del gnero Pseudomonas.

IV. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto inhibitorio del crecimiento in vitro de los hongos Aspergillus nger,
Aspergillus ochraceus y Rhizopus spp., producido por los metabolitos secundarios
de Pseudomonas spp.

V. OBJETIVOS SECUNDARIOS

Identificacin de los hongos involucrados en la pudricin del fruto.


Identificacin de las bacterias Pseudomonas productoras de metabolitos
secundarios.
Identificar las bacterias Pseudomonas capaces de inhibir el crecimiento de
hongos fitopatgenos.

23
VI. METODOLOGA

6.1. CEPAS BACTERIANAS

Se utilizaron cepas de las especies aeruginosa, fluorescens y diminuta, del gnero


Pseudomonas, las cuales fueron aisladas en el laboratorio de Inocuidad Alimentaria
en la Universidad autnoma de Nayarit, tomadas de frutos de guanbana en
madurez fisiolgica obtenidos del Tonino en Compostela Nayarit por (Vzquez
Pulido, 2015), las cepas fueron inoculadas en caldo Soya Tripticasena y agar
Cetrimida e incubadas a 37C/24 h, previo a cada experimento, cada experimento
llevado a cabo con las cepas de Pseudomonas, se utiliz a una concentracin de
0.5 de la escala de McFarland.

6.2. HONGOS FITOPATGENOS

Se utilizaron los hongos fitopatgenos Rhizopus spp., A. niger y A. ochraceus los


cuales fueron aislados de frutos de guanbana en post cosecha por (Lpez
Castaeda, 2015) en el Laboratorio de Inocuidad Alimentaria en la unidad
acadmica de ciencias qumico biolgicas y farmacuticas de la Universidad
Autnoma de Nayarit. Cada una de las cepas fngicas se resembraron por
separado, en medio PDA (Papa Dextrosa Agar-Bioxon) y se incubaron a
temperatura ambiente por 7 das. Posteriormente se realiz una tincin con azul de
lactofenol para observar sus caractersticas microscpicas de acuerdo a la
bibliografa y se confirmaron los gneros de Rhizopus spp., A. niger, y A. ochraceus.
Posteriormente, previo a cada ensayo realizado, se resembraron cada una de las
cepas fngicas por separado, en medio PDA y se incubaron por 7 das.

24
6.3. PRUEBAS DE CONFRONTACIN DUAL

Experimento A Mtodo Dual. La actividad antifngica se realiz por el mtodo de


bioensayo dual en PDA. Cada cepa bacteriana se sembr en placas de Petri de 100
mm x 15 mm con medio PDA y, en el centro de estas placas, se hizo un orificio de
5 mm de dimetro en el cual se inocul el hongo fitopatgeno de 7 das de
crecimiento a confrontar, el cual fue inoculado en el orificio para evitar que las
esporas se dispersaran sobre el medio, se confrontaron cada hongo fitopatgeno
con cada bacteria antagonista. Como testigos se sembraron las cepas de
antagonistas y de hongos fitopatgenos en forma individual para ver su crecimiento
normal y comparar con los resultados de enfrentamiento, se confrontaron una
especie de cada bacteria frente a un hongo fitopatgeno por duplicado. Las placas
Petri se incubaron a 30C durante siete das. Se registr el crecimiento radial
mediante la medicin lineal del dimetro de crecimiento del hongo a partir del punto
de inoculacin. Se determin el rea de inhibicin con el equipo de medicin Vernier
o pie de rey, con los datos anteriores se calcul el porcentaje de inhibicin de los
hongos fitopatgenos y se tom como testigo la superficie de crecimiento de cada
hongo fitopatgeno sin confrontacin, de acuerdo a la siguiente ecuacin:

Porcentaje de Inhibicin = (rea de crecimiento del fitopatgeno con antagonista) (100)


rea de crecimiento del fitopatgeno sin antagonista

Experimento B Tringulo equiltero.


El segundo experimento se realiz en medio PDA y se utilizaron las cepas de
Pseudomonas, las que se inocularon en orificios separados formando un tringulo
equiltero (Figura 2). En el centro del tringulo se coloc un orificio de 0.5 mm de
dimetro de un cultivo de 7 das de crecimiento del hongo fitopatgeno para
observar el comportamiento de la accin de las bacterias antagonistas. La actividad
inhibitoria de las tres cepas se determin por el instrumento de medicin Vernier
durante los 7 das de confrontacin, a ausencia o disminucin del crecimiento
25
micelial por el efecto inhibitorio de metabolitos secundarios producidos por P.
diminuta, P. fluorescens y P. aeruginosa

FIGURA 3. Mtodo del tringulo equiltero para antagonismo de


bacterias Pseudomonas frente a hongos fitopatgenos aislados de
guanbana.

26
VII. RESULTADOS Y DISCUSIN

Los resultados que obtuvimos de la evaluacin del enfrentamiento entre los hongos
fitopatgenos aislados y las bacterias antagonistas del gnero Pseudomonas,
mediante dos mtodos (experimentos A y B), se muestran a continuacin.

Efecto antagonista de cepas de Pseudomonas frente a hongos


fitopatgenos mediante el mtodo Dual en el experimento A por el
mtodo Dual.

Como se muestra en la Tabla 3, el mayor porcentaje de inhibicin lo present


P.aeruginosa y P.fluorescens frente a los tres fitopatgenos probados.

Tabla 3. PD, PA, PF y su control correspondiente, frente a A. ochraceus , A. niger y


Rhizopus spp; (0 = Inhibicin del hongo sin crecimiento; % = porcentaje de inhibicin
calculado respecto al control).

Especie No. de cepa Das (cm) Porcentaje


Fngica * de
inhibicin
4 5 6 7 %
PD 29 2.1 2.8 3.3 3.6 50%
A.ochraceus PA 29 0 0 0 0 100%
PF 29 0 0 0 0 100%
C 29 4 5.1 6.3 7.2
PD 2 1.9 2.8 3.6 3.8 46%
A.niger PA 2 2.2 2.7 2.9 3.7 48%
PF 2 1.5 1.7 1.8 2.2 69%
C2 2.7 4 4.8 7
PD 19 4 5.3 5.9 6.1 19%
Rhizopus spp PA 19 0 0 0 0 100%
PF 19 0 0 0 0 100%
C 19 4.9 6.2 6.8 7.5
*PD; P. diminuta
PA; P. aeruginosa
PF; P. fluorescens

Estos resultados concuerdan con otros trabajos donde se reporta que P.fluorescens
inhibe a patgenos de plantas Colletotrichum lindemuthianum (76%), Colletotrichum
gloesporioides (72%) y Phytophthora cinnamom. (70%), (Santoyo, Valencia
27
Cantero, & Orozco, 2010). No as con P.diminuta que mostr diferente actividad,
para el patgeno A.ochraceus se obtuvo una inhibicin del 50%, el crecimiento del
micelio de A.niger fue inhibido en un 46% y para Rhizopus spp solo el 19%.
Pudiendo deberse a la gran variedad de compuestos con efectos antimicrobianos
que sintetizan las bacterias Pseudomonas.

Tabla 4. Inhibicin del crecimiento de los hongos A.ochraceus, A. niger y Rhizoppus spp.,
por las cepas P.diminuta, P.aeruginosa y P.fluorescens % de inhibicin se obtuvo respecto
al control. Las mediciones del dimetro del micelio se realizaron a los 7 das a 25C.

Especie No. de Porcentaje


Fngica cepa* de inhibicin
PD 29 50%
A. ochraceus PA 29 100%
PF 29 100%
C 29
PD 2 46%
PA 2 48%
A. niger
PF 2 69%
C2
PD 19 19%
Rhizopus spp PA 19 100%
PF 19 100%
C 19
PD: P.diminuta, PA: P.aeruginosa, PF: P.fluorescens.

El crecimiento micelial de los hongos fitopatgenos frente a P. diminuta se observ


a partir del tercer da de incubacin, a diferencia del control pudiendo inferir que el
fitopatgeno puede adaptarse a los metabolitos secundarios producidos por
P.diminuta, y afectando su tasa y velocidad de crecimiento, siendo menor para
A.niger, seguida de A.ochraceus y mostrando una adaptacin mayor de Rhizopus
spp., como se muestra en la Figura 4.

28
Pseudomonas diminuta vs Hongos fitopatgenos
8
7
Centimetros (Cm.)

6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7
Das
PdvsA.och Control PdvsRhizop
Control PdvsA.niger Control

FIGURA 4 Enfrentamiento in vitro entre P. diminuta y hongos fitopatgenos.

En la Figura 5 se muestra el crecimiento micelial de A. niger frente a P. diminuta


durante los siete das de incubacin, siendo en el sptimo da de estudio donde se
observa un marcado halo de inhibicin de crecimiento del fitopatgeno frente a la
bacteria.

FIGURA 5 Enfrentamiento in vitro por 7 das P. diminuta


frente A. nger.

29
En la evaluacion in vitro de P.fluorescens frente a los hongos fitopatgenos, se
obtuvo un 100% de inhibicion frente a los hongos Rhizopus spp. y A. ochraceus
durante los 7 dias de enfrentamiento, A. niger mostr un 46% de inhibicion durante
los primeros 7 dias respecto a su control ( Figura 6 ) observando que el crecimiento
micelial tamben inicia despus del tercer da de incubacin, y despes del claro
crecimiento micelial del da cuarto, este se vuelve muy lento hasta el ltimo da de
incubacin.
En la Figura 7 se muestra la completa inhibicin micelial de Rhizopus spp frente a
P. fluorescens, durante los das de incubacin. Observando que Rhizopus no tuvo
contacto con la bacteria, pudiendo sugerir que P. fluorescens presenta algunos
antibiticos difusivos, como lo reportan (Valencia-Cantero, 2005) frente a Fusarium
oxysporum.

Pseudomonas fluorescens vs Hongos Fitopatgenos


8
7
Centimetros (cm.)

6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7
Das
PfvsA.och Control PfvsRhizop Control PfvsA.niger Control

FIGURA 6 Enfrentamiento in vitro entre P. fluorescens y hongos fitopatgenos.

30
FIGURA 7. Enfrentamiento de P. fluorescens frente a Rhizopus spp
junto a su control de 7 das.

El crecimiento micelial de A.niger frente a P.aeruginosa es constante a partir del


cuarto da, como se muestra en la Figura 8, a diferencia de A.ochraceus y Rhizopus
spp., que su crecimiento es totalmente inhibido, debido posiblemente a la presencia
de metabolitos secundarios producidos por esta bacteria. Tambin se ha reportado
que presentan una completa inhibicin del crecimiento micelial Alternaria solani y
Cladosporium fulvu aislados de jitomate, frente a P. aeruginosa (Villa, Frias, &
Gonzalez, 2005).

31
Pseudomonas aeruginosa vs Hongos fitopatgenos
8
7
Centimetros (cm.)

6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7
Das
PavsA.och Control PavsRhizop

FIGURA 8 Enfrentamiento in vitro entre P. aeruginosa y hongos fitopatgenos.

Se muestra en la figura 9, el antagonismo que presenta P. aeruginosa frente a


A.ocharecus durante los siete das de incubacin, mostrando en este estudio, que
las tres especies de Pseudomonas estudiadas muestran inhibicin del crecimiento
micelial de los hongos fitoptogenos aislados de fruto de guanbana en
postcosecha. Mostrando mayor actividad antagonista P.fluorescens y P.aeruginosa.

FIGURA 9. Inhibicin de A. ochraceus por metabolitos de


P. aeruginosa durante 7 das.

32
EFECTO ANTAGONISTA DE CEPAS DE PSEUDOMONAS FRENTE
A HONGOS FITOPATGENOS MEDIANTE EL MTODO B DEL
TRINGULO EQUILTERO.

Este segundo mtodo tambin se realiz por duplicado y los resultados fueron los
siguientes; Se observ que P. fluorescens present mayor efecto antagnico en el
crecimiento micelial de A.niger, seguido de P. diminuta y P. aeruginosa. El efecto
antagnico se muestra en la Figura 6.

FIGURA 10. Representacin in vitro del antagonismo de


Pseudomonas frente a A. niger.

Se present el mismo efecto de antagonismo con Rhizopus spp., donde


P.fluorescens muestra una mayor rea de inhibicin frente al hongo, inhibiendo su
crecimiento y formacin de micelio, figura 7. Observando que P.aeruginosa
presenta mayor actividad frente a este fitopatgeno, seguido de P.diminuta.

FIGURA 11. Representacin in vitro del antagonismo de


Pseudomonas frente a Rhizopus spp.

33
Se observ en los resultados un alto porcentaje de inhibicin del crecimiento micelial
de los hongos fitopatgenos, en especial por P. fluorescens, ya que en los
experimentos por el mtodo dual se present un 100% de inhibicin frente a los
hongos A. ochraceus, Rhizopus sp. y un 69% de inhibicin frente A. niger, el
porcentaje de inhibicin se obtuvo en base al crecimiento micelial de los controles
de los hongos fitopatgenos. Al igual P. aeruginosa mostr un 100% de inhibicin
frente a los hongos fitopatgenos A. ochraceus y Rhizopus spp, y un 48 % de
inhibicin frente A.niger (Figura 8), por P. diminuta el efecto inhibitorio fue menor,
se observ un 50% frente A.ochraceus, un 19% frente a Rhizopus spp y un 46%
frente A.niger (Figura 4). Estas especies de Pseudomonas producen ciertos
metabolitos secundarios antifngicos entre ellos siderforos, pioverdina los cuales
en condiciones estrictas forman parte de los mecanismos de control de las
enfermedades causadas por hongos y bacterias fitopatgenas por la competicin
con el in frrico donde forman quelatos con stos y causan inhibicin al patgeno
por no disponer de ste. En los resultados Rhizopus spp aislado de la guanbana
fue inhibido por los metabolitos de las bacterias P. aeruginosa y P. fluorescens, en
un menor porcentaje la inhibicin frente a Pseudomonas diminuta. El antagonismo
microbiano est dado por la inhibicin, deterioro o muerte de alguna especie de
microorganismos por la accin de otra; o una relacin entre dos poblaciones en la
cual una de ellas causa efectos deletreos o negativos a la otra. En la naturaleza
existe una interaccin continua entre los patgenos potenciales y sus antagonistas,
de forma tal que estos ltimos contribuyen a que en muchos casos no se desarrolle
la enfermedad (Perez, Coto, Echmendia, & Avila, 2015).

En la segunda tcnica de confrontacin (Fig. 10) de acuerdo con los resultados


cualitativos en el cual P. fluorescens es la especie en el cual tiene mayor rea de
inhibicin, es una de las especies con mayor produccin de pigmentos y metabolitos
que actan como antifngicos.
Las bacterias Pseudomonas del grupo fluorescens se consideran una opcin
prometedora en el control biolgico de fitopatgenos. Este grupo bacteriano es un
importante colonizador de la rizsfera de plantas. Actualmente existen diversas
cepas de P. fluorescens que han sido registradas, y algunas de ellas patentadas

34
para su uso en los cultivos agrcolas como agentes de control biolgico (Araya,
2003). Por ejemplo, la cepa ZUM80 suprime significativamente el crecimiento del
patgeno de frijol Colletotrichum lindemuthianum Briosi & Cavaray, y de los
patgenos de aguacate Colletotrichum gloeosporioides Penz y Phytophthora
cinnamomi (Tran & Ficke, 2007).

El gnero Pseudomonas produce compuestos extracelulares conocidos como


biosurfactantes, debido a la capacidad que tienen de crecer en presencia de
hidrocarburos, lo cual estimula la produccin de estas molculas. Investigaciones
realizadas (Trujillo, Diaz , & Hernandez, 2017), demostraron que los biosurfactantes
producidos por especies de Pseudomonas tienen actividad ltica sobre zoosporas
de los gneros Phytophthora y Pythium. No es fcil determinar con precisin los
mecanismos que intervienen en las interacciones entre los antagonistas y los
patgenos sobre la planta o en las heridas. En general, los antagonistas no tienen
un nico modo de accin y la multiplicidad de mecanismos de accin es una
caracterstica para seleccionarlos. Por lo que se ha tratado de aprovechar las
relaciones antagonistas entre las poblaciones microbianas, para controlar
patgenos vegetales debido al efecto antagnico.

35
VIII. CONCLUSIONES

De las tres cepas utilizadas en las pruebas de confrontacin por el mtodo dual se
logr evaluar el porcentaje de inhibicin frente a los hongos fitopatgenos aislados
de guanbana que producen daos en temporada de post cosecha, donde se
coincide en que existen diferentes mecanismos posibles por los que las
Pseudomonas suprimen y retrasan las enfermedades fungosas. Los mecanismos
ms importantes que incluyen la inhibicin de los patgenos por compuestos
antimicrobianos, la competencia por el hierro, la competicin por sitios de
colonizacin y por los nutrientes exudados por la raz, as como la induccin de
mecanismos de defensa en las plantas.
La inhibicin del patgeno por la produccin de metabolitos antimicrobianos o
queladores de hierro son los que estn considerados como los principales
mecanismos de biocontrol.

36
IX. BIBLIOGRAFA

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