Molecular Diagnosis in Hematology

Dan Jones

Diagnostik molekuler, termasuk DNA-dan pengujian berbasis RNA dan genomik,

memainkan peran yang semakin penting dalam diagnosis dan pemantauan pasien.

Ledakan luar biasa pengetahuan tentang patogenesis molekul baik jinak dan

neoplastik kondisi hematologi selama 20 tahun terakhir sekarang telah

diterjemahkan ke dalam tes laboratorium rutin kompleksitas tinggi. Demikian tes

diagnostik molekuler klinis, termasuk DNA canggih sequencing, microarray, dan

polymerase chain yang sangat sensitif reaction (PCR) tes, sekarang berdampak

diagnosis, subklasifikasi, penyakit sisa minimal (MRD) prediksi pemantauan, hasil,

dan pemilihan terapi. Dalam bab ini, kita meninjau dasar teknik-teknik molekuler

dan mendiskusikan penggunaannya di hematologi saat ini dan di masa depan.

Suatu Tinjauan Dari Molekuler biologi

DNA, bahan kromosom dalam inti sel, ditranskripsi oleh polimerase untuk

membentuk spesies RNA dengan fungsi yang berbeda. Ini termasuk messenger

RNA (mRNA) yang dihasilkan dari masing-masingyang ~20,000 protein coding

gen, microRNAs (Mirs) ditranskripsi dari ~500 gen pengatur Mir, dan ribosom dan

mentransfer RNA yang merupakan komponen dari ribosom dan protein mesin

biosintesis. mRNA kemudian diterjemahkan menjadi protein oleh ribosom dan

kemudian biasanya terdegradasi dengan cepat karena tindakan Mirs dan nucleases

seluler. Himpunan mRNA dan gen Mir yang bisa dituangkan dalam setiap sel

tertentu diatur oleh faktor transkripsi faktor pertumbuhan-responsif, sel kompleks

penambah-jenis tertentu, dan keadaan epigenetik dari Gen sekitarnya DNA serta

protein histon perancah mereka. Modulasi epigenetik DNA dan histon terjadi

umumnya melalui metilasi dan asetilasi dan diatur secara dinamis selama

perkembangan sel hematopoietik dan selama pengembangan dari leukemia dan

lymphomas.1,2 Acquired (somatik) cacat dalam satu atau lebih dari proses ini

mendasari perkembangan kondisi hematologi (Tabel 4.1).Selain itu, mewarisi gen

cacat atau populasi normal variasi dalam fungsi sel ini menyebabkan

kecenderungan untuk perkembangan selanjutnya hematologi conditions.11,12

Dengan peningkatan pemahaman tentang mekanisme dasar yang mendasari

penyakit, terapi yang menargetkan jenis molekul penyimpangan dalam kondisi

hematologi semakin menjadi maju (Tabel 4.2).

Ekstraksi Asam nukleat: Merupakan Titik Awal Pemeriksaan Molekuler

Karena mutasi dan perubahan dalam DNA penyebab penyakit gen biasanya

menyebabkan penyimpangan terdeteksi pada RNA dan protein tingkat, berbagai

analit yang tersedia untuk mendiagnosa kondisi yang paling. DNA adalah analit

yang paling stabil dan dapat dengan mudah diekstraksi dari sel segar, sel-sel beku,

dan formalin-fixed parafin-embedded (FFPE) jaringan. Oleh karena itu, DNA

adalah awal yang disukai bahan untuk sebagian besar tes PCR dan digunakan untuk

sekuensing DNA, untuk deteksi mutasi dengan PCR, dan microarray genom. DNA

stabil pada suhu kamar selama beberapa hari, selama berbulan-bulan untuk tahun

ketika didinginkan, dan pada dasarnya tanpa batas saat beku. Satu pengecualian
untuk pelestarian stabil DNA adalah dekalsifikasi trephines sumsum tulang di mana

pengobatan asam biasanya fragmen DNA, sering sehingga tidak cocok untuk PCR

dan microarray. DNA dapat diekstraksi dari sel dengan berbagai metode, dengan

langkah pertama biasanya menjadi gangguan sel menggunakan kuat protease,

seperti proteinase K, bersama dengan deterjen untuk membantu melarutkan

membran sel. Sebuah enzim RNase juga dapat digunakan selama langkah ini untuk

menurunkan mRNA campur hadir. DNA kemudian dapat selektif diisolasi dari

campuran ini menggunakan kolom kromatografi, ekstraksi organik protein diikuti

oleh alkohol curah hujan, atau dengan pengikatan DNA untuk substrat padat seperti

manik-manik kaca. RNA jauh lebih labil daripada DNA dan dapat dengan cepat

terdegradasi dalam darah dan sumsum tulang sampel diproses dan dalam jaringan

FFPE. Namun, RNA masih substrat yang disukai untuk mendeteksi transkrip fusi

yang terjadi pada neoplasma hematologi (misalnya, BCR-ABL1) dan ketika

analisis mRNA atau mir ekspresi diperlukan. Sebagian RNA mulai menurunkan

dalam waktu dua sampai tiga hari darah atau sumsum tulang koleksi bahkan jika

diproses sampel didinginkan; RNA harus disimpan dibekukan setelah diekstrak

dari sel. RNA dapat diisolasi dari sel-sel menggunakan metode yang sama dengan

yang dijelaskan untuk ekstraksi DNA atas. Perawatan harus diambil selama

ekstraksi untuk menetralisir enzim RNA-merendahkan hadir dalam lingkungan dan

dalam sel itu sendiri. Bagi kebanyakan molekul tes, RNA selanjutnya diubah

menjadi DNA komplementer (cDNA) dengan menggunakan reverse transcriptase

sebagai langkah pertama dalam protokol.

Tabel 2.1 Gangguan Hematologi akibat cacat di sistem molekuler seluler
Tabel 2.2 Bagian yang teraktifasi pada Tumor Hematolimfoid

Isolasi Mirs sering membutuhkan metode ekstraksi dimodifikasi, tetapi mereka juga

dapat diukur dengan menggunakan reverse transcriptase (RT) PCR dan mungkin

lebih stabil daripada mRNA. Baru-baru ini, tes klinis telah mulai menilai seluler
negara epigenetik melalui deteksi DNA alkohol, yang biasanya dianalisis setelah

sitosin alkohol memiliki telah diubah mengikuti deaminasi dengan perlakuan

bisulfit. Kelainan pada ekspresi protein umumnya dinilai dengan menggunakan

imunohistokimia pada jaringan tetap, atau blotting atau immunoassays pada sampel

segar. Sebuah pandangan yang lebih lengkap dari genom dapat diperoleh dengan

menggunakan karyotyping konvensional kromosom di sampel segar, atau

fluoresensi dalam hibridisasi in situ (FISH) dan microarray DNA genomik pada

bahan segar dan tetap.

Polymerase Chain Reaction: Teknik molekuler yang sangat diperlukan

Dari aplikasi pertama genetika bakteri pada awal 1980-an, PCR telah menjadi

teknik utama untuk memperkuat gen sehingga mereka dapat menjadi ukuran untuk

mencari insersi patogen atau penghapusan; sequencing untuk mencari mutasi

pasangan basa; dan diberi label dengan radioaktivitas, fluorochromes, atau gugus

kromogenik untuk digunakan sebagai probe dalam bercak dan microarray

sebaliknya. Teknik PCR melibatkan berurutan amplifikasi oleh siklus berulang

denaturasi DNA, reannealing, dan polymerase perpanjangan target DNA

menggunakan mengapit oligonukleotida (Gambar. 4.1A).

Pada siklus awal PCR, yang target secara eksponensial diperkuat sebelum secara

bertahap plateauing saat jumlah besar produk ini cenderung mendukung

reannealing dari untai ganda template daripada primer mengikat / ekstensi.

Untuk mendeteksi produk yang telah diperkuat oleh PCR, yang Reaksi biasanya

habis pada agarosa padat atau polyacrylamide substrat atau gel. Amplikon PCR ini

dapat dideteksi oleh laser menggunakan elektroforesis kapiler jika salah satu dari

primer telah label dengan fluorochrome (Gambar. 4.1B),

atau dengan gel elektroforesis slab diikuti oleh pos-pewarnaan dengan pewarna

DNA-binding (misalnya, etidium bromida) yang dapat divisualisasikan dengan

sinar ultraviolet (lihat Gambar. 4.2, Langkah 1). Seperti dijelaskan di atas, jika RNA

yang akan dianalisis dengan PCR, pertama-tama diubah menjadi cDNA dalam

teknik yang dikenal sebagai RT-PCR. ika probe neon ditambahkan ke dalam reaksi,

real-time atau PCR kuantitatif (qPCR) dapat dilakukan untuk menghitung jumlah

dari RNA atau DNA target hadir dalam sampel awal. Sebuah umum Desain qPCR

adalah pendek, probe-gen tertentu yang TaqMan memiliki fluorophore reporter di

perusahaan akhir 5 ?? dan molekul pemadam pada akhir 3 ?? . Probe hybridizes

target amplikon selama langkah anil setiap siklus PCR dan kemudian dihidrolisis

oleh aktivitas exonuclease 5 ?? Taq polymerase selama DNA ekstensi. Ketika

probe TaqMan dihidrolisis, reporter

fluorophore terlepas dari molekul pemadam yang berdekatan dan berfluoresensi

dalam jumlah yang proporsional dengan tingkat PCR amplifikasi produk.

Dengan demikian, sebagai probe terikat untuk template dan Wartawan yang dirilis

oleh ekstensi polimerase, yang terdeteksi fluoresensi meningkat secara

eksponensial.

Di qPCR, jumlah sasaran yang hadir awal dalam PCR hasil perhitungan program

komputer dengan mengamati siklus PCR yang fluoresensi Sinyal pertama menjadi

terdeteksi. Siklus threshold (Ct) dapat kemudian dapat digunakan untuk kuantisasi

absolut atau relatif. untuk mutlak kuantisasi, yang diamati Ct dikonversi menjadi

jumlah target copy dengan memplot pada kurva standar (log Ct vs memulai copy

Jumlah) dibangun dari sampel dengan dikenal copy sasaran nomor (Gambar. 4.1C).

Untuk relatif kuantisasi, menargetkan jumlah disajikan relatif terhadap kontrol

normalizer co-diperkuat (misalnya, gen housekeeping sangat dinyatakan seperti

ACTB [b-Aktin] atau ABL1). Kuantitas tersebut kemudian direpresentasikan

sebagai rasio relatif paling umumnya delta-Ct perhitungan: [kuantitas relatif] = 2-

(Ct gen Target - Ct gen referensi).

Bentuk khusus qPCR digunakan untuk mendeteksi basa tunggal perubahan

pasangan di DNA adalah alel spesifik (AS) -PCR. metode ini membandingkan

tingkat amplifikasi probe PCR atau primer yang mengakui satu alel terhadap sinyal

dari probe yang mengakui hanya alel lainnya. Protokol yang sama ini juga dapat

digunakan untuk sensitif mendeteksi tingkat urutan bermutasi di neoplasms.19

Metode ini secara rutin dapat mendeteksi keberadaan mutasi turun 0,1% dari

template dalam sampel (Gambar. 4.1D).

DNA Sequencing: The Teknik Mengemudi Revolusi Genomic

Gambar 4.1. Polymerase chain reaction (PCR). A. A tiga tahap PCR

konvensional, dengan denaturasi, annealing, dan langkah-langkah

penyuluhan. Komponen khas

PCR diilustrasikan termasuk template DNA (misalnya, gen target), nukleotida

berlabel (dNTP), polimerase DNA untuk menyalin template dan maju (F) dan

sebaliknya (R) primer DNA, salah satunya adalah fluorescent berlabel (*).

Produk B. Fluorescent dari PCR atas kemudian terdeteksi oleh elektroforesis

kapiler. Tampil adalah melacak dengan 167 pasangan basa produk gen NPM1

biasanya berukuran dan salinan normal dengan 4 basis pasangan penyisipan

(171b) karakteristik leukemia myeloid akut. C. kuantitatif PCR menggunakan

metode TaqMan dengan empat sampel yang menunjukkan jumlah yang

berbeda dari gen target seperti yang ditunjukkan oleh Cts mulai 23-39 siklus

(Anak panah). Sebuah grafik yang menunjukkan pengenceran 10 kali lipat

dari sampel referensi diplot di bawah ini, yang digunakan untuk mengubah

Ct dalam sampel pasien dalam jumlah copy. D. Desain dari TaqMan qPCR

assay untuk mendeteksi mutasi JAK2 V617F, dengan identik F dan R primer

tapi dua probe neon yang berbeda; yang merah mendeteksi normal Urutan

JAK2 ("G" pada posisi itu), dan probe hijau mengakui bermutasi "T" urutan.

Hitam 3 'bagian pada probe merupakan pewarna pemadam.

Urutan DNA dari gen yang dibangun dari kombinasi empat nukleotida, adenin (A),

sitosin (C), guanin (G), dan timin (T), dan varian mereka epigenetically

dimodifikasi, terutama 5-methylcytosine. Sequencing DNA untuk menentukan

dasar komposisi genom pertama kali secara rutin diterapkan pada akhir 1970 namun

tetap teknik yang sulit dan mahal sampai beberapa tahun terakhir. Teknik emas

standar akurat tapi mahal untuk menentukan Komposisi basa DNA, yang

dikembangkan oleh Frederic Sanger, adalah disebut dideoxy pemutusan rantai

method.20 Setelah awal PCR langkah untuk memperkuat gen yang diinginkan,

metode ini bergantung pada kedua asimetris langkah PCR yang berhenti di ekstensi

PCR secara acak diperkenalkan pada setiap posisi dalam produk dengan

menambahkan fluorescent berlabel varian rantai mengakhiri dari A, C, G, dan T

nukleotida, masing-masing nukleotida mengakhiri dicap dengan warna yang

berbeda (hijau, biru, hitam, dan merah). Kisaran Molekul DNA masing-masing

berakhir pada posisi yang berbeda kemudian dipisahkan dengan ukuran

menggunakan elektroforesis dan urutan dibaca dengan deteksi laser nukleotida

parah berlabel (Gambar. 4.2).

Gambar 4.2 DNA Sequencing

Gambar 4.2. DNA Sequencing. Langkah-langkah dalam terminasi rantai

dideoksi metode (Sanger) meliputi: Langkah 1: Standard polymerase chain

reaction (PCR) untuk menghasilkan sejumlah besar genespecific sebuah

Template, terdeteksi oleh slab elektroforesis diikuti oleh etidium bromida

pewarnaan gel. Langkah 2: Searah (atau asimetris) PCR menggunakan

template dari pertama PCR bersama dengan baik primer maju atau mundur

dalam reaksi yang mengandung nukleotida yang normal dicampur dengan

rantai mengakhiri basis A, C, G, dan T. Langkah 3: Rentang produk dari

asimetris PCR yang berakhir pada setiap kemungkinan dasar dalam

amplikon PCR kemudian dipisahkan oleh kapiler elektroforesis dan terdeteksi

oleh laser mengakui fluorochrome / nukleotida hadir pada akhir produk.

Base-panggilan dilakukan dengan menggunakan software yang menormalkan

ketinggian puncak ke menghasilkan elektroforegram digambarkan.

Generasi baru dari teknologi sequencing yang jauh lebih cepat dan lebih murah

untuk melakukan saat mengganti Sanger Metode dan biasanya menggunakan

sequencing-by-sintesis pendekatan. Sebagai setiap nukleotida ditambahkan ke

rantai berkembang DNA oleh polimerase, penggabungan terdeteksi oleh pelepasan

produk atau properties.21,22 bahan kimia atau elektrokimia

Metode Blotting dan Array

Sebuah metode alternatif untuk menyelidiki urutan DNA padat

fase hibridisasi, di mana enzimatis dicerna Total

DNA genomik atau RNA dari sel (atau produk PCR tertentu) yang Ukuran-

dipisahkan menggunakan slab gel elektroforesis dan kemudian produk ditransfer di

tempat dari gel ke nilon atau nitroselulosa membran. Membran ini hibridisasi

dengan label Probe DNA yang dapat mendeteksi target gen. Pengikatan probe yang

kemudian divisualisasikan menggunakan autoradiografi atau deteksi kolorimetri.

Dalam aplikasi Selatan blot, sebelum elektroforesis DNA genomik dicerna dengan

satu atau lebih pembatasan endonuklease yang dipotong (s) dalam gen (s) dari

bunga, sehingga setiap gangguan gen (oleh penyisipan, penghapusan, atau

rekombinasi) terdeteksi oleh alternately- pola pita berukuran berikut elektroforesis

dan menyelidik (Gambar. 4.3).

Gambar 4.3 Hibridisasi blot. Langkah-langkah di Southern blot adalah ilustrasi

untuk referensi dan sampel pasien.

Southern blot adalah teknik padat karya yang biasanya membutuhkan beberapa

hari. Untuk alasan ini, saat ini kepala sekolah penggunaan blot Southern hematologi
yang mendeteksi penghapusan atau amplifikasi gen besar dan daerah kontrol

penambah mereka, seperti gen globin dalam thalassemia. Dalam aplikasi ini, ukuran

area kromosom yang akan diselidiki dan dengan demikian jumlah nukleotida DNA

yang akan dianalisis biasanya terlalu besar untuk dengan mudah direntang oleh

DNA PCR dan PCR berbasis sequencing. Sebuah aplikasi blotting terkait adalah

hibridisasi terbalik, di mana Urutan DNA dari tumor atau DNA yang normal pasien

yang PCRamplified dan kemudian diberi label dan hibridisasi terhadap array probe

yang telah terlihat pada membran atau matriks lainnya. Aplikasi ini banyak

digunakan untuk mendeteksi strain tertentu dari virus tertentu hadir dalam sampel

tetapi dalam hematologi yang sebagian besar digunakan untuk aplikasi sitogenetik

microarray skala besar.

Aplikasi molekuler diagnostik dalam Hematologi

Diagnosis jenis tertentu limfoid dan myeloid keganasan dibahas di tempat lain

dalam buku ini, tetapi di sini kita meringkas umumnya bagaimana teknik molekuler

yang digunakan untuk membantu dalam diagnosis mereka. Skema saat diagnosis

hematologi neoplasma adalah Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) Klasifikasi

dari Hematologi dan limfoid Neoplasms.23 Klasifikasi ini menggabungkan

morfologi dan fitur immunophenotypic tapi juga semakin bergantung pada

pengujian molekuler dan sitogenetik untuk diagnosis definitif.

Diagnosis Molekuler pada Keganasan Myeloid

Keganasan myeloid dapat dibagi menjadi myeloproliferative Neoplasma (MPNS),

di mana mutasi pathogenetic tidak signifikan mengganggu pematangan sel

melainkan mendorong pertumbuhan, dan leukemia myeloid akut (AML) dan

myelodysplastic syndrome (MDS), di mana terjadi gangguan pematangan.

MPNS menunjukkan berbagai translokasi kromosom berulang, seperti fusi BCR-

ABL1 pada leukemia myelogenous kronis (CML) yang dapat dideteksi oleh RT-

PCR maupun oleh FISH.24 Dalam CML, tingkat fusi transkrip BCR-ABL1

terdeteksi oleh realtime sebuah Metode RT-PCR sekarang digunakan untuk

memantau jalannya CML Terapi dengan imatinib dan obat-obatan lainnya, dan

memicu perubahan dalam pengobatan di cases.25 resistan terhadap obat Mengingat

pentingnya Tes ini untuk manajemen klinis, kemajuan yang signifikan telah dibuat

dalam standardisasi baik protocol26,27 PCR dan referensi bahan yang digunakan

untuk mengkalibrasi assay.28 BCR-ABL1 PCR Mutasi pada JAK2 tyrosine kinase

adalah yang paling umum terdeteksi penanda patogenetik untuk sekelompok MPNS

yang mencakup polisitemia vera, thrombocythemia penting, dan primer

myelofibrosis.29 Deteksi yang paling umum mutasi JAK2 (V617F) dapat dilakukan

dengan AS-PCR, menyediakan sangat sensitif Metode tentu saja penyakit

pemantauan MPNS JAK2-bermutasi (Gambar. 4.1D)

Dalam AML dan MDS, karyotypic temuan bersama dengan hematologi parameter

tetap penentu prinsip diagnostik klasifikasi dan hasil prediksi, seperti yang

dikodifikasikan dalam klasifikasi WHO dan International prognosis Scoring

System (IPSS) untuk MDS.23,30,31,32 Beberapa translokasi kromosom yang

terjadi pada AML, seperti inv (16) / t (16; 16) dalam myelomonocytic akut leukemia

dan t (15; 17) dalam leukemia promyelocytic akut, yang terbaik dipantau oleh RT-

PCR.33,34 Namun, karakteristik mutasi, seperti duplikasi NPM1 terlihat pada

subset normal diploid kariotipe AML, dapat dideteksi dengan PCR ukuran tes

(Gambar. 4.1B) .35 mutasi lain memberikan informasi prognostik yang penting

di AML, termasuk mengaktifkan sisipan / duplikasi di Flt3 tirosin reseptor kinase

(RTK), yang dapat dideteksi oleh PCR ukuran tes; dan mutasi di KIT RTK, yang

dapat terdeteksi oleh sekuensing DNA (Gambar. 4.4a, B).

Gambar 4.4. Deteksi mutasi pada leukemia myeloid akut (AML). A. Flt3

Duplikasi terdeteksi oleh PCR diikuti oleh kapiler analisis fragmen

elektroforesis. B. KIT mutasi (D816V) di AML diilustrasikan oleh puncak

ganda (kotak) dalam elektroforegram rendah hadir di kedua maju dan

mundur urutan, yang bertentangan dengan tipe liar puncak tunggal mencatat

dalam referensi urutan unmutated atas. Metode ini rantai dideoksi pemutusan

DNA sequencing, seperti pada Gambar 4.3. Gambar milik Dr Zhong Zhang.

Set gen, termasuk TET2, IDH1, IHD2, KRAS, NRAS, EZH2, dan ASXL1, yang

bermutasi di MPNS serta AML dan MDS, membuat umum Panel molekul berguna

untuk diagnosis dan stratifikasi risiko di semua neoplasms myeloid.

Diagnostik molekuler Limfoma dan Ekspansi limfoid jinak

Neoplasma limfoid adalah jenis tumor pertama yang memiliki skema diagnostik

standar berdasarkan pematangan limfosit tahap, dimulai pada tahun 1960-an.

Standar saat ini untuk diagnosis pada hematopatologi, WHO Klasifikasi

Hematologi dan Limfoid Neoplasma merupakan evolusi dan integrasi dari

sebelumnya upaya sebagian besar terpisah morfologi dan genetika molekuler.

Prinsip umum klasifikasi dalam skema WHO dan pendahulunya adalah untuk

memetakan neoplasma ke tahap pematangan mitra biasa yang mereka paling

resemble. Meskipun Model sederhana ini tidak memperhitungkan semua diamati

Keheterogenan di limfoma, telah sangat berhasil dalam menempatkan entitas tumor

dalam dipahami dan mudah diingat kerangka kerja untuk diagnosis. Oleh karena

itu, kita meringkas di bawah ini bagaimana perubahan genetik terdeteksi oleh

diagnostik molekuler berkorelasi dengan kelompok morfologi sel B-matang dan

dewasa dan neoplasma sel T.

Mendefinisikan kelainan Molekuler Keganasan limfoid

Dalam limfoma leukemia / lymphoblast limfoid akut garis keturunan sel-B

(ALL / LBL), perubahan diagnostik termasuk kromosom fusi yang dapat dideteksi

oleh RT-PCR, IKAN, atau dengan ungkapan microarray.40 Dalam silsilah T-sel

SEMUA / LBL, diagnostik molekuler Peristiwa termasuk mutasi pada gene41

NOTCH1 dan gen aktivasi gen pengatur Hox melalui kromosom yang penyusunan

ulang yang mendekatkan target onkogen sebelah Reseptor sel-T (TCR) penambah,
yang secara selektif mendorong menyimpang ekspresi dalam klon sel-T. Perubahan

ekspresi gen disebabkan oleh aktivasi onkogen juga dapat dideteksi dengan RNA

microarray ekspresi.

xtapose berbagai onkogen yang berbeda sebelah immunoglobulin gen (Ig) enhancer

(biasanya) adalah peristiwa penting penyalaan dan dapat dideteksi dengan PCR atau

FISH.43 Dalam limfoma folikular, Limfoma Burkitt, limfoma zona marginal, dan

sel mantel limfoma, ini onkogen Ig-penambah didorong biasanya meliputi Bcl2,

MYC, MALT1, dan cyclin D1 / CCND1, masing-masing (Tabel 4.3).

Varian molekul limfoma ini yang tidak ini klasik translokasi sering mengaktifkan

gen homolog, misalnya aktivasi dari Cyclin D3 / CCND3 dalam varian limfoma sel

mantel.
Dalam matang limfoma sel-T, kromosom timbal balik translokasi jauh kurang

umum, terjadi umumnya hanya di limfoma sel klasik anaplastik besar dan

prolymphocytic T-sel leukemia. Dalam dua neoplasma ini, PCR, IKAN, atau

imunohistokimia untuk mendeteksi protein abnormal diungkapkan (ALK dan

TCL1, masing-masing) yang modalities.45 diagnostik Baru-baru ini, translokasi

lain yang mempengaruhi jalur sinyal telah identified.46 Namun, dalam neoplasma

T-sel lainnya, ketidakstabilan gen mengakibatkan beberapa kromosom perubahan

dan gen mutasi, mirip dengan yang terlihat pada AML miskin berisiko, yang sering

terlihat. Ini Temuan menunjukkan bahwa array genom mungkin berguna diagnostik

tes untuk ini tumor yang jarang.

Menggunakan Polymerase Chain Reaction untuk Mendeteksi Klonalitas Sel B

dan sel T

Salah satu masalah diagnostik penting lainnya dalam hematologi yang

membedakan ekspansi limfoid jinak, seperti yang terlihat pada penyakit autoimun

dan infeksi, dari proliferasi klonal terkait dengan limfoid leukemia dan limfoma.

Metodologi inti dalam membuat perbedaan ini adalah aliran multiparameter

cytometry, yang dapat menentukan bahkan halus muncul ekspansi klonal. Namun,

PCR analisis reseptor sel-B (BCR) dan TCR memiliki penting Peran pendukung,

spesimen jaringan terutama ketika tetap, yang tidak bisa digunakan untuk aliran

cytometry, adalah satu-satunya contoh yang tersedia.

Sel B timbul sebagai prekursor dalam sumsum tulang yang disebut limfoblas atau

hematogones dan kemudian bermigrasi ke dalam darah perifer selama-hidup bentuk

naif, sebuah proses yang sebagian besar diselesaikan dalam masa kecil. Pematangan

lebih lanjut dari sel B tergantung pada pengakuan dari antigen yang tepat yang

mengikat antibodi spesifik molekul, juga dikenal sebagai BCR, terdiri dari

immunoglobulin rantai berat (IGH @) dan salah satu dari dua jenis light

immunoglobulin rantai (IGK @ atau IGL @). Demikian pula, sel T prekursor

muncul di sumsum tulang dan bermigrasi ke timus awal pengembangan, di mana

mereka mengatur ulang TCR mereka untuk menghasilkan clonotypic unik TCR

dalam setiap sel T prekursor dan semua turunannya.

Dasar-sel B dan tekad Klonalitas T-sel dengan PCR adalah bahwa karena ekspansi

limfoid klonal muncul dari satu sel pendiri, semua sel dalam ekspansi yang akan

berbagi BCR yang sama atau TCR, yang memiliki ukuran tertentu berikut PCR.

Struktur dari TCR atau BCR dalam limfosit prekursor ditentukan oleh proses VDJ

rekombinasi yang terjadi pada DNA selama pematangan limfosit. Karena variasi

dalam ukuran keanekaragaman (D) daerah antara variabel (V) dan bergabung (J)

segmen, semua sel dalam proliferasi sel-B klonal akan memiliki identik berukuran

IGH @ gen penataan ulang yang dapat dideteksi dengan PCR (Gambar. 4.5).
Gambar 4.5. Prinsip-sel B dan penilaian Klonalitas T-sel dengan polymerase

chain reaction (PCR). (Top) Skema representasi rantai berat immunoglobulin

(IGH @) lokus gen berikut penataan ulang dalam sel B; lokasi primer yang

digunakan dalam IGH @ PCR adalah ditunjukkan oleh forward (F) dan

reverse (R) panah dengan satu label dengan sebuah fluorochrome (*). Wilayah

variabel (V) segmen direpresentasikan dalam oranye, daerah

keanekaragaman (D) segmen diwakili dengan warna biru, dan bergabung (J)

segmen wilayah yang ditampilkan dalam warna pink. Sebuah template-

independent yang unik Urutan ditambahkan ke VD dan DJ persimpangan

pada setiap individu sel B prekursor selama IGH @ penataan ulang dalam

sumsum tulang. Proses yang sama yang melibatkan reseptor sel-T yang terjadi

dalam prekursor T sel dalam timus. (Tengah) Setelah PCR, populasi sel-B

monoklonal karakteristik limfoma sel-B menunjukkan dominan tunggal

"klonal" VDJ amplikon dari ukuran tertentu karena semua sel B yang

diturunkan dari sel prekursor umum. Poliklonal / reaktif ekspansi sel-B

menunjukkan amplikon VDJ dari berbagai ukuran yang berasal dari

berbagai berbeda Sel B dalam populasi. (Bawah) Kisaran VDJ amplikon

adalah divisualisasikan dengan menjalankan IGH @ PCR pada elektroforesis

kapiler. Itu puncak yang terdeteksi menggunakan produk PCR fluorochrome-

label berjalan di elektroforesis kapiler dengan tinggi puncak sebanding

dengan jumlah produk PCR dari berbagai ukuran tertentu. Puncak merah

merupakan ukuran internal yang standar; puncak biru dari IGH @ PCR.

Sebaliknya, campuran / poliklonal non-neoplastik Ekspansi sel-B akan memiliki

produk IGH @ PCR dari berbagai ukuran, memberikan distribusi normal produk

PCR. Proses yang sama terjadi pada sel T, dengan PCR untuk baik TCR-gamma

atau TCR-beta gen yang digunakan untuk menentukan adanya klonal, oligoclonal,

atau poliklonal Ekspansi sel-T. Protokol standar untuk IGH @, IGK @, @ TCRG,

TCRB @ PCR telah dikembangkan, 50,51 dan ini dapat dilakukan pada segar Sel

diisolasi dari darah atau sumsum tulang aspirasi atau dari tetap bagian jaringan.

Juga, mengingat sensitivitas indah dari PCR, sangat sampel kecil (seperti jumlah

menit cairan serebrospinal) dapat digunakan untuk mendeteksi Klonalitas dalam

sampel yang terbatas

Tes Minimal Residual pada Leukemia dan Lymfoma

Salah satu manfaat utama dari real-time PCR adalah bahwa itu adalah baik teknik

yang sangat sensitif dan kuantitatif untuk melacak penyakit residual. Jika uji PCR

dapat dirancang untuk selektif memperkuat penyimpangan molekul memulai dalam

leukemia atau limfoma, maka PCR sangat sensitif dan spesifik dapat dirancang

untuk melacak Tingkat penyakit selama pengobatan dan untuk memantau untuk

kambuh (Tabel 4.4).

Kelompok sebagian besar banyak digunakan dari tes PCR ini mereka untuk

mendeteksi transkrip fusi di leukemia, termasuk BCR-ABL1

di CML, PML-RARA pada leukemia promyelocytic akut, dan MLL dan Fusi

ETV6-RUNX1 di leukemia limfoblastik.

tapi bukan tipe liar perubahan pasangan basa dapat digunakan ketika tertentu mutasi

titik mencirikan patogenesis molekul tumor, seperti mutasi JAK2 di MPNs55 dan

Flt3 dan NPM1 mutasi pada subset pendekatan AML.56,57 ini PCR MRD adalah

terbatas pada mutasi yang terjadi di awal perjalanan penyakit, karena mutasi yang

terjadi kemudian mungkin ada hanya subclones yang hilang atau berkembang di

bawah pengobatan. Dalam sequencing menggunakan platform generasi berikutnya

menunjukkan janji untuk lebih komprehensif Pendekatan untuk penggunaan mutasi

untuk analisis MRD.

Akhirnya, sangat kompleks,-leukemia tertentu MRD qPCR tes dapat dirancang

untuk sel B dan T-sel neoplasma yang mengandalkan dirancang primer berdasarkan

pada TCR tertentu atau BCR diungkapkan oleh pasien tumor.59 jenis-jenis tes, jika

dirancang dengan baik, memberikan yang paling

Metode sensitif tersedia untuk pelacakan-rendahnya tingkat residu ALL / LBL,

tetapi mengingat biaya mereka belum diterapkan secara luas.

Metode dan Pemeriksaan Diagnosis Molekuler pada 5 tahun mendatang

Metodologi diatas telah berevolusi relatif lambat, memberikan berlatih hematologi

waktu untuk mengintegrasikan metode ini ke dalam workups rutin. Namun,

sejumlah besar tinggi-throughput baru metodologi pengujian yang mungkin untuk

diterapkan di beberapa tahun ke depan, nukleotida polimorfisme terutama tunggal

array dan sequencing genom mengidentifikasi kedua germline dan mutasi somatik,
mungkin lebih sulit untuk mengintegrasikan ke dalam rutinitas praktek klinis.

Metodologi ini akan membutuhkan mengintegrasikan data yang kompleks untuk

menurunkan rencana pengobatan termasuk:

Menafsirkan panel sequencing bagaimana lanjutan akan digunakan untuk

berhubungan diagnosis seleksi pengobatan dan pemantauan molekul

strategi.

Integrasi diperoleh dan germline polimorfisme menjadi lebih pemahaman

kegagalan sumsum tulang

Menggabungkan analisis sel tunggal dengan menggunakan flow cytometry

dengan molekul profil untuk mengkarakterisasi sel induk normal dan

abnormal.

Pustaka Acuan:

2. Joshi D, Gosh K, Vundinti BR. MicroRNAs in hematological malignancies:

a novel approach to targeted therapy. Hematology 2012;17:170175.

19. Gibson NJ. The use of real-time PCR methods in DNA sequence variation

analysis. Clin Chim Acta 2006;363:3247.

24. Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, et al. The 2008 revision of the World Health

Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:

rationale and important changes. Blood 2009;114:937951.

25. Baccarani M, Castagnetti F, Gugliotta G, Palandri F, Soverini S. Response

definitions and European Leukemianet Management recommendations. Best Pract

Res Clin Haematol 2009;22:331341.

27. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. Standardized RT-PCR analysis

of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for

detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action:

investigation of minimal residual disease in acute leukemia.

Leukemia1999;13:19011928.

29. Goldin LR, Bjorkholm M, Kristinsson SY, Samuelsson J, Landgren O.

Germline and somatic JAK2 mutations and susceptibility to chronic

myeloproliferative neoplasms. Genome Med 2009;1:55.

31. Greenberg PL, Tuechler H, Schanz J, et al. Revised International Prognostic

Scoring System (IPSS-R) for myelodysplastic syndromes. Blood 2012;120: 2454

2465.

37. Schlegelberger B, Gohring G, Thol F, Heuser M. Update on cytogenetic and

molecular changes in myelodysplastic syndromes. Leuk Lymphoma 2012;53:525

536.

42. Ferrando AA, Neuberg DS, Staunton J, et al. Gene expression signatures define

novel oncogenic pathways in T cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell

2002;1:7587.
45. Herling M, Khoury JD, Washington LT, Duvic M, Keating MJ, Jones D. A

systematic approach to diagnosis of mature T-cell leukemias reveals heterogeneity

among WHO categories. Blood 2004;104:328335.

60. Harris TJ, McCormick F. The molecular pathology of cancer. Nat Rev Clin

Oncol 2010;7:251265.