ESTUDO DIRIGIDO- Prof. Dr.

Maximiliano Zierer

INTRODUÇÃO A BIOLOGIA MOLECULAR - MEDICINA

Aluno(a):_________________________________________________ Data: / /2014

1- (0,2 pontos) Explique os eventos que ocorrem em cada uma das três etapas da
TRANSCRIÇÃO: iniciação, alongamento e terminação.

2- (0,1 ponto) Explique as três etapas do processamento pós-transcripcional, e dê pelo

menos dois exemplos da importância deste processo.

3- (0,2 pontos) Explique os eventos que ocorrem em cada uma das três etapas da
TRADUÇÃO: iniciação, alongamento e terminação.

4- (0,1 ponto) Explique todas as etapas enzimáticas da síntese de uma molécula de cDNA
de fita dupla.

5- (0,1 ponto) Explique as diferentes etapas na preparação de um Southern Blot, um

Northern Blot e um Western Blot, bem como quais são as aplicações de cada um desses
métodos.

6- (0,1 ponto) Explique as diferenças e as aplicações dos seguintes métodos de PCR:

Degenerate-PCR, Multiplex-PCR, Nested-PCR, In Situ-PCR e RT-PCR.

7- (0,1 ponto) Explique as diferentes etapas na preparação de um RFLP e de um RAPD,

bem como quais são as aplicações de cada um desses métodos.

8- (0,1 ponto) Explique as diferenças metodológicas entre o sequenciamento de DNA de

Maxam-Gilbert e o método de Sanger.

DESENVOLVA E JUSTIFIQUE TODAS AS SUAS RESPOSTAS!

1- A transcrição, a síntese do RNA a partir de um DNA-molde, é feita pela RNA-polimerase. A
transcrição pode ser dividida em três etapas: iniciação, alongamento e terminação. O início da
transcrição envolve a ligação da holoenzima RNA-polimerase em uma região do DNA (região
promotora) que determina a especificidade da transcrição de um determinado gene. Essa
primeira etapa do ciclo de transcrição (iniciação) pode ser dividida em três etapas definidas.
Primeiramente há a ligação inicial da polimerase a um promotor, formando um complexo
fechado. Nessa etapa ainda não há a separação da fita dupla do DNA e a enzima está ligada a
uma face da hélice. Na segunda etapa da iniciação, o complexo fechado sofre uma transição
para complexo aberto, em que as fitas de DNA são separadas, nas regiões próximas ao sítio
de iniciação, formando a bolha de transcrição. A abertura da hélice de DNA libera a fita molde,
que serve de molde para a RNA polimerase. Os dois primeiros ribonucleotídeos são trazidos
para o sítio ativo, e ligados entre si. A partir desse momento, a enzima começa seu
deslocamento ao longo da fita molde, abrindo a hélice de DNA na frente, e permitindo sua
religação atrás. Quando a enzima liga os primeiros 10 pares de bases é o momento da
transição para a fase de alongamento. Ao contrário da DNA-polimerase, a RNA-polimerase não
necessita de um iniciador. Na fase de alongamento, o DNA de fita dupla entra na parte
dianteira da enzima, quando a fenda catalítica se abre, as fitas são separadas e seguem
trajetos diferentes, através da enzima, até saírem por seus respectivos canais e restaurarem a
dupla hélice atrás da polimerase. Os ribonucleotídeos entram no sítio ativo através de seu
canal próprio e são adicionados à cadeia crescente de RNA. Além disso, a RNA-polimerase
tem a função de revisão, checando o seu trabalho para evitar erros. A transcrição é terminada
por sinais na sequencia de RNA (terminadores), que determinam a dissociação da polimerase
de alongamento do molde de DNA e liberam a cadeia de RNA produzida.

2- Após o processo da transcrição o RNA recém-produzido passa por uma série de

modificações antes de ser traduzido às proteínas. A primeira etapa do processo de modificação
pós-transcricional é o capeamento do mRNA. O capeamento do transcrito primário ocorre na
sua terminação 5’. Esse processo consiste na adição de uma 7-metil-guanosina através de
uma ligação trifosfato à extremidade 5’ do mRNA. A segunda etapa do processo de
modificação pós-transcricional consiste na adição de uma cauda Poli-A. Após a RNA-
polimerase transcrever o códon de terminação para a tradução da proteína, ela passa uma
sequencia chamada de sinal de poliadenilação. Um complexo enzimático se liga ao sinal de
poliadenilação e cliva o transcrito primário cerca de 10 a 20 nucleotídeos à frente, para a
formação da terminação 3’. Após essa clivagem, uma cauda poli-A que pode ter acima de 200
nucleotídeos de comprimento é adicionada à terminação 3’. A terceira etapa do processo de
modificação pós-transcricional consiste na remoção dos íntrons. Quase todos os íntrons iniciam
com um GU 5’ e terminam com um AG 3’. As ribonucleoproteínas nucleares se ligam ao
íntrons, causando a formação de uma alça; A clivagem ocorre na terminação do primeiro éxon,
entre os resíduos AG da terminação 3’ do éxon e o resíduo GU da terminação 3’ do íntrons. A
segunda clivagem ocorre na terminação 3’ do íntrons após a sequência AG. Os éxons são
conectados uns aos outros. O íntrons, com formato semelhante a um laço, é liberado e
degradado a nucleotídeos.

3- A tradução é o processo através do qual a informação genética contida na sequência de

nucleotídeos no mRNA é usada para originar as sequências lineares de aminoácidos nas
proteínas. A tradução pode ser dividida em três etapas: iniciação, alongamento e terminação.
Para a tradução iniciar com sucesso, três eventos devem ocorrer. Primeiro, o ribossomo
precisa ser recrutado para o mRNA, processo que acontece, nos procariontes, pela ligação, por
pontes de hidrogênio, entre a sequência do mRNA e a sequência do rRNA, e nos eucariontes
pela interação com a extremidade 5’ do mRNA que sofreu o processo de capeamento.
Segundo um tRNA carregado precisa ser posicionado no sítio P do ribossomo. Terceiro o
ribossomo precisa ser posicionado exatamente sobre o códon de iniciação. Tanto em
procariotos como em eucariotos o processo da iniciação há a participação de diversas
proteínas, chamadas de fatores de iniciação, que ajudam que o complexo de inciação se
forme. A iniciação da tradução consiste na etapa em que o ribossomo, já formado pelas duas
subunidades, a maior e a menor, encontrasse sobre o códon de iniciação e o tRNA inicial
carregado encontrasse no sítio P. O alongamento é a fase na qual os tRNAs carregados
chegam pelo sítio A do ribossomo, pareiam o seu anticódon com o códon do mRNA e assim, a
ligação peptídica entre a sequência de aminoácidos que se encontra unida ao tRNA, que se
encontra no sítio P e o aminoácido que entrou no ribossomo e se encontra no sítio A se forma.
Quando essa ligação se forma a sequencia de aminoácido é liberada do tRNA do sítio P para o
tRNA do sítio A, e assim o tRNA que antes encontrava-se no sítio P pode migrar para o sítio E,
e o tRNA que entrou no sítio A pode passar para o sítio P, dando espaço para que um novo
tRNA carregado entre pelo sítio A do ribossomo e dê continuidade para o processo de
alongamento. A terminação da tradução é mediada por uma série de proteínas denominadas
fatores de terminação, em resposta a códons de terminação. Quando o ribossomo chega a um
códon de terminação, geralmente 5’ AUG 3’, os fatores de terminação agem, impedindo que
haja a entrada de mais tRNAs carregados no sítio A do ribossomo, favorecendo o
desacoplamento das unidades ribossomais menor e maior, e assim a liberação do mRNA e da
nova sequência de aminoácidos (proteína) que sai pelo sítio E do ribossomo.

4- A primeira etapa para o processo de síntese de uma molécula de cDNA de fita dupla é o
isolamento do mRNA, que geralmente é feito por uma cromatografia por afinidade, em colunas
contendo oligo-dT, que vão atrais a cauda poli-A do mRNA. Depois do isolamento do mRNA, a
síntese da primeira cadeia do cDNA ocorre pela utilização do mRNA como molde, pela enzima
transcriptase reversa. A transcriptase reversa é capaz de catalisar a polimerização de DNA a
partir de RNA, porém necessita de um primer com a extremidade 3’ OH livre para iniciar o
processo. No processo de síntese de cDNA, utiliza-se como primer uma pequena sequência de
desoxitiminas que se hibridiza na cauda poli-A do mRNA. Após a ação da transcriptase reversa
uma fita do cDNA de cadeia dupla já foi formada, e esta encontra-se pareada com a fita de
mRNA, a fita de mRNA sofre a ação da RNAse A que digere essa fita, fragmentando-a em
pedaços. Os pedaços resultantes dessa fragmentação servem de primers para a DNA
polimerase que sintetiza a segunda fita de cDNA e retira esses fragmentos de mRNA,
substituindo-os por DNA. Após a síntese da segunda fita de cDNA, entra em cena a T4
polimerase que é utilizada para remover nucleotídeos extras nas extremidades 3’ do cDNA
recém-produzido, geralmente resquícios da cauda poli-A do mRNA.

5- O Southern Blot é um método que serve para verificar se uma sequência de DNA qualquer
está presente ou não em uma amostra de DNA analisada. Primeiramente para que seja
realizado o método é preciso que a amostra de DNA tenha sido preparada para uma
eletroforese, e a eletroforese em gel de agarose precisa ser realizada. Após a eletroforese a
amostra é tratada com uma solução alcalina para que ocorra a desnaturação da dupla fita do
DNA, separando assim as suas fitas. Após o processo de desnaturação, a amostra é
transferida para uma membrana, geralmente por pressão. Após a transferência para uma
membrana, a membrana é aquecida ou exposta à radiação ultravioleta, para que a amostra
fixe-se bem à membrana. Depois que a amostra fixou-se à membrana, a membrana é então
tratando com uma sonda, que é uma molécula de DNA isolada cuja sequência é conhecida, e é
complementar ou idêntica a aquela sequência que se deseja verificar a presença na amostra.
Essa sonda é marcada para que permita ser detectada a sua presença, normalmente a
marcação é feita através de átomos radioativos que são incorporados à estrutura molecular da
sonda. A sonda então pareia-se com a sequência que se quer determinar, ou não se pareia,
caso ela não exista na amostra. A membrana é lavada para que a sonda que não se hibridizou
seja retirada, e então a presença ou não da sequência procurada é revelada por uma auto-
radiografia em um filme de raio X, O Northern Blot serve para estudar o perfil de expressão de
mRNA, e o método é bastante semelhante com o Southern Blot, a diferença é que no Nothern
Blot, não há a necessidade de desnaturar a amostra, e a sonda utilizada é uma sequencia de
RNA marcada, e não uma sequência de DNA marcada. O Western blot usa o mesmo princípio
do Southern blot e do Northern blot, mas é aplicado a proteínas, que são separadas utilizando-
se eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio, e não
eletroforese em gel de agarose, além disso, para a identificação de proteínas alvo, são
utilizados anticorpos específicos que se hibridizam à proteína alvo.

6- A degenerate-PCR utiliza-se de uma mistura de primers degenerados, isto é, primers com

pequenas variações entre si na sequência oligonucleotídica, esta técnica é utilizada para
pesquisar novos genes, famílias de genes e também empregada em estudos evolutivos e
evolucionários. A Multiplex-PCR, é diferente porque utiliza város primers para amplificar
diferentes fragmentos de uma mesma amostra, essa técnica é utilizada para identificar
indivíduo, testes de paternidade, identificação de vírus e patógenos e em estudos de doenças
genéticas. A Nested-PCR consiste na utilização de dois pares de primers para amplificar um
mesmo fragmento, diferentemente da Multiplex-PCR, ou seja, é como se fossem duas PCRs
em sequência, o que contribui para aumentar a especificidade da amplificação, é uma técnica
utilizada para diagnóstico laboratorial, para a detecção de vírus e de patógenos. In Situ PCR
ocorre dentro da célula, por isso o seu nome, em uma lâmina, podendo assim ser realizada em
células ou tecidos fixados anteriormente para análise, essa técnica é utilizada para a detecção
de bactérias ou vírus nos tecidos e células, tendo grande aplicação em diagnósticos. A RT-
PCR (real time PCR), ou ainda, PCR em tempo real, é uma técnica que utiliza sondas
fluorescentes que permitem a quantificação dos produtos da PCR no exato momento em que
estão sendo produzidos. Sua metodologia permite que os processos de amplificação, detecção
e quantificação de DNA sejam realizados em uma única etapa, o que acelera a obtenção de
resultados e diminuindo o risco de contaminação da amostra e dando maior precisão, essa
técnica é utilizada na análise de expressão gênica, identificação de alelos em DNA genômico,
análise de sequencias virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes, análise
de patógenos em alimentos e análise de produtos transgênicos , entre outros.

7- O RFPD (Restriction Fragment Length Polymorphism) e o RAPD (Random Amplified

Polymorphic) DNA são métodos de biologia molecular que servem para analisar o polimorfismo
entre diferentes DNAs, nos capacitando a diferenciar diferentes amostras de DNA. O RFPD é
uma técnica que se baseia no fato do padrão formado pela eletroforese de fragmentos de DNA
formado por endonucleases de restrição apresentar diferenças de um indivíduo para outro, e
entre espécies diferentes. Isso porque a endonuclease de restrição fragmenta o DNA em certas
posições, que a rigor, são diferentes entre os indivíduos, dessa forma, os fragmentos formados
apresentam tamanhos diferentes, logo na corrida eletroforética, o padrão formado é diferente.
A realização da técnica se baseia nos seguintes passos: Isolamento do DNA de um indivíduo;
tratamento com enzimas de restrição (que vão fragmentar o DNA em certas regiões
particulares); Eletroforese em gel de agarose, que vai formar um padrão, que a rigor, é
diferente do padrão formado pelo DNA tratado com a mesma enzima de restrição de outro
indivíduo; transferência para uma membrana, de modo semelhante ao Southern Blot;
hibridização com sondas radioativas, para que se possa visualizar o padrão formado, na
próxima etapa; Autoradiograma, que consiste na sensibilização de filme radiográfico, ou seja,
visualização do padrão formado pela eletroforese. O RAPD já utiliza outro método para gerar
um padrão em que se possa analisar o polimorfismo. Essa técnica analisa o padrão formado
pela PCR (Polimerase Chain Reaction) utilizando-se pequenos iniciadores (primers) aleatórios.
É uma técnica mais rápida e mais simples que a RFLP, isso porque requer uma menor
quantidade de DNA, não envolve a utilização de sondas radioativas e não necessita de muita
mão-de-obra. Para sua realização é preciso que se extraia o DNA a ser analisado, realize-se a
amplificação do DNA, através de uma PCR utilizando um primer de DNA aleatório (assim as
regiões entre os primers são amplificadas, e como cada DNA diferente apresenta regiões
complementares aos primers diferentes, o tamanho das regiões amplificadas também é
diferente, o que pode ser percebido pela analise do padrão formado em uma eletroforese),
depois da amplificação, os fragmentos amplificados são separados por uma eletroforese em
gel de agarose, e depois o padrão formado é analisado. Como os fragmentos amplificados tem
diferentes tamanhos entre os indivíduos, diferentes indivíduos vão apresentar diferentes
padrões, o que permite diferenciar indivíduos. Entretanto, apesar de que os dois métodos são
utilizados para diferenciar indivíduos, o RFLP é mais utilizado para diferenciar indivíduos
humanos, sendo bastante utilizado na prática forense, e o RAPD é mais utilizado em espécies
vegetais, isso porque esta técnica não detecta muita variação na espécie humana e outros
animais.

8- As diferenças metodológicas entre os métodos de sequenciamento de DNA de Maxam-

Gilbert e o método de Sanger consistem no fato de que o primeiro método é essencialmente
químico e o segundo método é essencialmente enzimático. O método de Maxam-Gilbert
necessita da marcação de um nucleotídeo terminal com um átomo de P radioativo e reações
seletivas que destroem as ligações açúcar-base, reação com dimetil sulfato ataca somente as
purinas, enquanto que a reação com a hidrazina ataca somente as pirimidinas, e hidrólise
também seletiva da ligação fosfodiéster para cada nucleotídeo, o que produz fragmentos com
certas quantidades de bases, que são separados por eletroforese em gel e são expostos em
filme de raio-X, ao analisar o padrão, de acordo com o tamanho dos fragmentos (distância do
nucleotídeo terminal marcado) e devido a seletividade das reações de quebra da ligação
fosfodiéster é possível determinar a sequência de nucleotídeos do DNA original. Já o método
de Sander baseia-se na terminação aleatória da cadeia de DNA durante a síntese enzimática.
Para que a síntese enzimática seja terminada nesses pontos aleatórios, utiliza-se ddNTPs
(didesoxinucleotídeos) que são incapazes de estabelecer uma ligação fosfodiéster adequada
com o próximo dNTP a ser acrescentado na cadeia crescente de DNA, então a síntese
enzimática é parada. Essas moléculas são incorporadas ao DNA usando-se a DNA polimerase,
o que já diferencia completamente esses dois métodos de sequenciamento. Devido a essa
interrupção da síntese do DNA, são gerados vários fragmentos de DNA, que variam seu
tamanho de acordo com a posição com que o ddNTP foi adicionado à cadeia. Esses
fragmentos são separados por uma eletroforese em um gel, o que se assemelha ao método de
Maxam-Gilbert, e visualizados em um autoradiograma. O padrão formado pelos fragmentos
obtidos fornece a sequência do DNA.