Makalah Ulasan Jurnal

High Expression of a Human Lactoferrin

in Transgenic Tobacco Cell Cultures *)

Disusun Oleh:
Reza Abdul Kodir
NPM 260120140011

Magister Ilmu Farmasi

Fakultas Farmasi
Universitas Padjadjaran
2014
 Kata Pengantar

Aplikasi bioteknologi dalam bidang Farmasi memiliki kemajuan pesat di

bawah tuntutan global akan solusi berbagai permasalahan kesehatan. Protein
rekombinan menjadi salah satu produk bioteknologi dalam bidang Farmasi yang
memiliki wilayah aplikasi luas. Beragam protein rekombinan yang sudah
dikembangkan diantaranya human albumin, human insulin, human lactoferrin,
dan sebagainya.
Lactoferrin (LF) atau dikenal juga dengan sebutan lactotransferrin (LTF),
adalah suatu protein multifungsi dari keluarga protein transferin. Lactoferrin
terdapat pada beragam cairan yang disekresikan oleh tubuh seperti susu, saliva, air
mata, dan sekresi nasal. Lactoferrin dapat diperoleh dengan pemurnian susu atau
diproduksi secara rekombinan.
Uraian di atas adalah penghantar untuk menyusun naskah ulasan mengenai
salah satu penelitian lactoferrin sebagai protein rekombinan. Sebagai produk
rekombinan, lactoferrin berperan penting dalam terapi kondisi medis tertentu,
sehingga dalam hal ini menjadi lactoferrin menjadi protein terapetik. Ulasan ini
dapat memberikan wawasan bagi para pembaca untuk mengenal lactoferrin
sebagai salah satu agen terapi yang didapat dari serangkaian proses bioteknologi
protein rekombinan.
Sebagaimana tak ada gading yang tak retak, maka tak ada tulisan yang tak
menuai kritisi, sehingga isi ulasan yang masih jauh dari sempurna ini akan selalu
membutuhkan masukan, saran dan kritisi, dari semua pihak yang membaca.
Bandung, Desember 2014

Reza A. Kodir
NPM. 260120140011

1
 Daftar Isi
Hal

Kata Pengantar ..................................................................................................... 1

Daftar Isi ................................................................................................................ 2
Pendahuluan .......................................................................................................... 3
Lactoferrin ................................................................................................................................... 3
Struktur dan Karakter.................................................................................................................. 3
SWPA2 (sweetpotato peroxidase anionic 2) ................................................................................ 4

Bahan dan Metode ................................................................................................ 5

Konstruksi vektor ekspresi tumbuhan ......................................................................................... 5
Transformasi sel tembakau ......................................................................................................... 5
Ekstraksi protein dan determinasi kandungan hLF ................................................................... 5
Analisis Southern dan Northern blot .......................................................................................... 6
Analisis Western blot ................................................................................................................... 6
Assay aktivitas antibakteri ........................................................................................................... 6

Hasil dan Pembahasan.......................................................................................... 6

Transformation and cell line selection ........................................................................................ 1
Molecular analysis of hLf high-yielding cell lines ....................... Error! Bookmark not defined.
High expression of hLf in suspension cultures............................. Error! Bookmark not defined.
Antibacterial activity of hLf producing cell lines .......................... Error! Bookmark not defined.

Kesimpulan ............................................................................................................ 1
Pustaka Utama ...................................................................................................... 1
Pustaka Tambahan ............................................................................................... 1

2
Pendahuluan
Lactoferrin
Lactoferrin (LF) ada protein terikat-besi non-haem yang berasal dari
keluarga protein transferin bersama dengan serum transferrin, ovotransferrin,
melanotransferrin dan sebagainya. Fungsi utama keluarga ini adalah sebagai
penghantar besi di dalam serum darah (González-Chávez et al., 2009). LF
diproduksi oleh epitel mukosa pada mamalia termasuk manusia. Glikoprotein ini
ditemukan pada cairan sekresi seperti air mata, saliva, cairan vagina, semen,
sekresi nasal dan bronkial, empedu, cairan saluran cerna, urin, dan paling tinggi
pada susu dan kolostrum (González-Chávez et al., 2009). LF juga merupakan
protein dengan kandungan tertinggi kedua setelah kasein pada susu (González-
Chávez et al., 2009).
Karakteristik muatan total yang positif dan sebaran LF pada berbagai
jaringan menjadikannya memiliki banyak fungsi secara fisiologis. Diantara fungsi
LF secara fisiologis adalah sebagai regulasi penyerapan zat besi di usus, respon
imun, antioksidan, anti-karsinogen, anti-inflamasi, dan proteksi terhadap infeksi
mikroba. Mengingat fungsi fisiologisnya yang penting, LF sangat berpotensi
untuk dikembangkan sebagai produk nutrasetikal dan pengembangan berjalan ke
arah memproduksi LF secara in vitro untuk memenuhi kebutuhan akan protein ini.
Produksi LF saat ini dapat dilakukan dengan isolasi dari susu atau dengan
memproduksi LF rekombinan (rLF). rLF diproduksi pada sistem ekspresi bakteri,
fungi, dan virus. Upaya pengembangan sistem ekspresi rLF juga merambah
menggunakan organisme seperti tumbuhan dan hewan.

Struktur dan Karakter

LF (Gambar 1.) adalah protein terglikosilasi dengan bobot molekul 80 kDa
yang terdiri dari sekitar 700 residu asam amino. LF terdiri dari dua lobus lipatan
protein, yaitu lobus N dan C. Masing-masing lobus memegang ion logam (Fe2+
dan Fe3+). Dikarenakan reversibilitas ikatannya dengan ion logam, LF dapat
berada dalam keadaan tak terikat besi (apo-LF) atau terikat besi (holo-LF). Apo-
LF memiliki konformasi molekul terbuka, sementara holo-LF memiliki
konformasi tertutup dan lebih tahan terhadap aktivitas proteolitik (González-
Chávez et al., 2009).
Struktur utama LF terdiri dari residu asam amino sistein yang menghasilkan
terbentuknya banyak jembatan disulfida (sulfhidril) sistin. Residu asparagin pada
kedua lobus menyediakan area molekul yang memiliki potensi besar untuk
berlangsungnya proses glikosilasi (González-Chávez et al., 2009).

3
 Gambar 1. Struktur Transferrin (Moore et al., 1997 dalam Choi et al., 2003)

SWPA2 (sweetpotato peroxidase anionic 2)

Gambar 2. Struktur vektor ekspresi SWPA2pro::ER-hLf/pCGN1578 untuk transformasi pada

tembakau (Choi et al., 2003).

Promoter SWPA2 (Gambar 2.) adalah promoter peroksidase terinduksi

cekaman oksidatif (oxidative cekamans-inducible peroxidase – POD) yang
diisolasi dari tumbuhan ubi jalar (sweetpotato - Ipomoea batatas). Genom klon
POD terdiri dari 1824 bp, dua intron, dan 1073 daerah koding. SWPA2 telah
diketahui mengkode POD anionik yang terekspresikan secara kuat dengan adanya
cekaman. SWPA2 dalam temuan ini diantisipasi dapat menjadi dasar
pengembangan tanaman transgenik yang tahan terhadap cekaman dan dapat
dijadikan sebagai galur sel yang digunakan untuk mengekspresikan berbagai

4
protein farmastikal (Kim et al., 2003). Sel tembakau transgenik dalam penelitian
Choi et al. (2003) menggunakan promoter SWPA2 sebagai pengontrol ekspresi
gen hLF.
Choi et al. (2003) memaparkan tentang salah satu pengembangan sistem
ekspresi rLF pada tumbuhan. Tumbuhan yang digunakan dalam penelitian Choi et
al. (2003) adalah tumbuhan tembakau (Nicotiana tabacum). Galur sel transgenik
N. tabacum dalam penelitian Choi et al., (2003) telah dikembangkan sebagai
sistem ekspresi LF manusia dan dikendalikan oleh promoter peroksidase
terinduksi cekaman oksidatif (oxidative cekamans-inducible peroxidase/SWPA2).
Analisis Western blot dilakukan untuk menunjukkan keberadaan LF manusia pada
sel tembakau. Akumulasi LF manusia yang dipantau menggunakan ELISA
meningkat secara proporsional seiring dengan pertumbuhan sel tumbuhan dan
mencapai maksimal pada fase stasioner dari pertumbuhan tembakau. Selain
mendeteksi keberadaan LF manusia pada tembakau, Choi et al. (2003) juga
melakukan pengujian antimikroba terhadap protein yang diisolasi. Dari uji ini,
diketahui bahwa protein hasil ekstraksi tersebut memiliki aktivitas antibakteri.

Bahan dan Metode

Ada beberapa tahapan yang dilakukan Choi et al. (2003) dalam penelitian ini,
yaitu:
Konstruksi vektor ekspresi tumbuhan
Vektor ekspresi yang digunakan berupa plasmid biner dengan sisipan genom
promoter POD/SWPA2 dan hLF. Plasmid rekombinan yang dibangun diberi nama
SWPA2pro::ER-hLF/pCGN1578 (Gambar 2.) yang menunjukkan nama promoter
dan gen yang hendak diekspresikan.
Transformasi sel tembakau
Transformasi bertujuan memindahkan plasmid/vektor ekspresi kepada sel
ekspresi, dalam hal ini memindahkan plasmid dari Agrobacterium tumefaciens
kepada sel kultur tembakau. Kultur sel tembakau di dalam media MS diseleksi
berdasarkan resistensi antibiotik.
Ekstraksi protein dan penetapan kandungan hLF
Protein rhLF hasil produksi pada kultur sel tembakau diekstraksi dan ditetapkan
kadarnya.

5
Analisis Southern dan Northern blot
Analisis ini dilakukan untuk menganalisa DNA dan RNA transformasi pada sel
tembakau.
Analisis Western blot
Analisis ini dilakukan untuk menganalisa protein hasil transformasi seperti yang
sudah diuraikan sebelumnya.
Assay aktivitas antibakteri
Penelitian ini dilanjutkan hingga pengujian aktivitas antibakteri sebagai
mekanisme verifikasi keberhasilan produksi rhLF pada sel tembakau. Aktivitas
antibakteri yang ditunjukkan menandakan rhLF yang dihasilkan berupa rhLF
fungsional sebagaimana hLF yang diproduksi pada sel manusia.

Hasil dan Pembahasan

Gambar 4. Immunodeteksi rhLF. (A) analisis

Gambar 3. Transformasi sel tembakau yang
mengkode rhLF. (A) Southern blot galur sel
transgenik (T1–T6) dan kontrol (C). (B)
Northern blot galur sel transgenik.
Western blot. M: jalur marker, C: jalur kontrol
protein protein dari sel non-transformasi, T1–
T6: jalur protein dari sel transgenik, P: LF
komersil (100 ng). (B) pewarnaan Coomassie
P: LF komersil (1 µg).

6
 Gambar 5. Perubahan pertumbuhan sel (A)
kandungan rhLF (B) pada suspensi kultur tiga
galur sel transgenik. T1, T2, dan T5
merepresentasikan galur sel transgenik..

Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri rhLF terhadap tiga strain bakteri: S. typhymurium, S. aureus,
dan E. coli
Cell growth (%)
Strains Control Lactoferrin (commercial) Transgenic
cell extract (500 g ml-1) cell extract
Salmonella typhymurium 100 ± 2.3 22.3 ± 1.2 87.7 ± 1.6
Staphylococcus aureus 100 ± 1.7 45.8 ± 1.5 79.9 ± 2.6
Escherichia coli (DH5) 100 ± 0.9 1.5 ± 0.5 51.8 ± 1.9
Data represent the average the three experiments

Pemilihan transformasi dan galur sel

Tampila sel transgenik dan kontrol pada penelitian ini tidak menunjukkan
perbedaan. Berdasarkan analisa ELISA, didapatkan rentang kandungan rhLF pada
sel transgenik berkisar antara 0,7% hingga 2,7% dari total protein terlarut. Enam
galur sel transgenik (T1 hingga T6) menghasilkan rhLF dalam kadar tinggi dan
diipilih untuk analisa selanjutnya. Hal ini menunjukkan transformasi berhasil.

Analisis molekuler terhadap galur sel yang menghasilkan rhLF dalam jumlah
tinggi
Analisis ini dilakukan untuk memastikan kestabilan hasil transformasi rhLF pada
sel tembakau. Analisa Southern blot pada T1 – T6 menunjukkan satu pita yang
berarti gen rhLF telah bergabung dengan baik di dalam genom sel tembakau. Pada
analisis Northern blot, T1, T2, T4, dan T5 menunjukkan ekspresi tertinggi
sementara T3 da nT6 menunjukkan ekspresi rhLF yang rendah. Protein rhLF
dianalisa menggunakan Western blot, seluruh galur menghasilkan protein dengan
bobot 80 kDa dan 40 kDa, kecuali T3 yang hanya menghasilkan protein dengan
bobot 80 kDa saja, sementara sel kontrol tidak menghasilkan protein dengan
bobot ini. Ekspresi rhLF pada lima galur sel diduga mengalami degradasi protein

1
dengan 40 kDa sebelum membentuk pelipatan yang sempurna menjadi protein
dengan bobot 80 kDa.

Tingginya ekspresi rhLF pada suspensi kultur sel

Tingkat produksi rhLF diukur pada galur sel dengan produksi rhLF yang tinggi.
Hasilnya menunjukkan pola kurva sigmoid. Pertumbuhan sel dan produksi rhLF
berbanding lurus, yaitu peningkatan jumlah sel seiring dengan peningkatan
produksi rhLF. Pola hasil ekspresi menunjukkan keberhasilan kinerja promoter
SWPA2 (Gambar 5.).

Aktivitas antibakteri sel yang memproduksi rhLF

Sebagaimana ditunjukkan pada tabel 1, rhLF pada sel tembakau
menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap ketiga strain bakteri, hal ini
dikonfirmasi dengan pembandingan menggunakan LF komersil.

Kesimpulan

Ada beberapa poin penting terkait dengan penelitian yang dilakukan Choi et
al. pada tahun 2003 ini, yaitu:

1. Produk terapetik seperti protein LF saat ini dapat diproduksi menggunakan

cell line yang berasal dari tumbuhan, misalnya tembakau.
2. Secara metodologis, penelitian diawali dengan desain molekuler terhadap
vektor dan primer, kloning dan amplifikasi dengan PCR, transformasi
menggunakan Agrobacterium pada sel tembakau, memastikan
keberhasilan transformasi dengan analisa Southern, Northern, dan Wester
blot, pengukuran dan penetapan kadar produk rekombinan, dan
memastikan protein rekombinan yang dihasilkan dapat bekerja dengan
baik yang dalam hal ini menggunakan uji aktivitas antibakteri rhLF..

Pustaka Utama

*) Sun-Mee Choi, Ok-SunLee, Suk-Yoon Kwon, Sang-Soo Kwak, Dae-Yeul Yu

& Haeng-Soon Lee. High expression of a human lactoferrin in transgenic
tobacco cell cultures. Biotechnology Letters 25: 213–218, 2003.

Pustaka Tambahan
González-Chávez, S. A., Arévalo-Gallegos, S., and Rascón-Cruz, Q.. Lactoferrin:
structure, function and applications. International Journal of
Antimicrobial Agents 33 (2009) 301.e1–301.e8

1
Kim, Kee-Yeun, Kwon, Suk-Yoon, Lee, Haeng-Soon, Hur, Yunkang, Bang, Jae-
Wook, and Kwak, Sang-Soo. A novel oxidative stress-inducible peroxidase
promoter from sweetpotato: molecular cloning and characterization in
transgenic tobacco plants and cultured cells. Plant Molecular Biology 51:
831–838, 2003