Huella de ADN

Se llevó a cabo la huella de ADN para confirmar que iPSC CGD paciente-específicas y no
afectados eran de origen idénticas a los respectivos fibroblastos dérmicos pacientes. ADN
genómico total se extrajo de las cinco muestras y se amplificó con 11 marcadores de
microsatélites: D3S1358, la SVA, D16S539, D2S1338, amelogenina, D8S1179, D21S11,
D18S51, D19S433, TH01, y FGA y se analizaron en un 377 detector de secuencia software
usando Genotipo ABI.

La validación de las mutaciones conocidas de pacientes con CGD en iPSCs

Para validar las mutaciones en IPSC-CGD1 y IPSC-CGD2 encuentran en el ADN de sangre
periférica del paciente, se utilizó PCR para amplificar los cebadores. Los productos del PCR
se subclonaron en TOPO XL y se secuenciaron en ABI.
Cebadores utilizados por PCR antes de la subclonación y secuenciación para observar la
mutación:
IPSC-CGD1: ATGAGGTGTTCAGAGTGGTGACAG y CCATGCCCAGCTCGCAT
IPSC-CGD2: GTCATACTGGTGGAGGGAAAGC y GCTCCAACCTGCCCTTCC
IPSC-CGD3: TTCTGTCAGGTTTGCCATGT y GCCTCCTTGTCTTTTGTGTTC

La inmunocitoquímica
Las células se fijaron en 4% (peso / vol) de paraformaldehído durante 20 minutos. En la
etapa de bloqueo se llevó a cabo mediante incubación en 1% (peso / volumen) de
albúmina de suero bovino (BSA) o suero de cabra. Las células se incubaron con
anticuerpos primarios durante 1 hora y anticuerpos secundarios durante 30-60 minutos.
Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio son anti-OCT-4, clon 7F9.2, anti-SSEA-
4, clon MC813-70, anti- TRA-1-60, anti-CD31, anti-β-III-tubulina, anti-α-fetoproteína (AFP),
y anti-IgG de ratón-isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado. Los núcleos se
contratiñeron con 10 mg / ml de Hoechst. El campo brillante y las imágenes fluorescentes
se obtuvieron utilizando un microscopio Zeiss y el software AxioVision.

La tinción de fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina (AP) tinción se llevó a cabo usando el kit de detección de AP. Las
imágenes de campo brillante se obtuvieron utilizando un microscopio Zeiss y software
AxioVision.

Análisis del cariotipo CGD iPSC específica del paciente y no afectados

Cariotipos se determinaron mediante Procedimiento Estándar de bandeo G.
La formación de teratomas
Para evaluar el desarrollo de desarrollo teratomas, se inyectaron hiPSC por vía subcutánea
en el flanco derecho de ratones adultos con SCID. Y un control fue inyectado con hESC por
vía subcutánea en ratones adultos con SCID, ambos se mantuvieron 6-12 semanas. Luego
los ratones fueron sacrificados, se disecaron sus tejidos, fijados en Bouin y en contraste de
hematoxilina y eosina. Se examinaron usando microscopía óptica de campo brillante.

La secuenciación de bisulfito de la Oct4 y NANOG Promotores

El ADN genómico se aisló de hiPSCs CGD paciente-específicos y no afectados,
desnaturalizado, y realizando una reacción con bisulfito de sodio usando el kit de bisulfito
EpiTect. Se utilizó como molde para amplificar regiones de los Oct4 y NANOG.
Se utilizó los siguientes cebadores:
OCT4: CCTAAACTCCCCTTCAAAATCTA y GGATGTTATTAAGATGAAGATAG NANOG:
TTAGGTTGGTTTTAAATTTT y AACCCACCCTTATAAATTCTCAA
Los productos de PCR resultantes se subclonaron en TOPO.

Medición de la telomerasa Actividad

Telomérica protocolo de amplificación de repeticiones (TRAP) reacciones se llevaron a
utilizar el Telo TAGGG ensayo de PCR telomerasa inmunoabsorción ligado a enzimas
(ELISA).

Aislamiento de monocitos de sangre

Se obtuvo sangre humana adulta, de donantes anónimos a través del Servicio Nacional de
Banco de Sangre del Reino Unido y fue arrojado resultados negativos para el VIH-1, la
hepatitis B / C, y sífilis. Células mononucleares de sangre periférica se aislaron por Ficoll-
Hypaque en centrifugación a partir de capas leucocitarias heparinizados. Los monocitos se
aislaron por selección CD14+ utilizando perlas magnéticas anti-CD14. Los monocitos se
colocaron en placas como para los monocitos iPS, para la diferenciación de los
macrófagos.

Ensayo de Nitro azul tetrazolio

Los monocitos se cultivaron durante la noche en placas de 96 pocillos. Para la visualización
de especies reactivas de oxígeno (ROS), 100 l de nitro azul tetrazolio (NBT, Sigma-Aldrich)
1 mg / ml en HBSS con Ca / Mg y de PMA 1 g. Los macrófagos se analizaron después de 8
días de diferenciación. Las células se incubaron a 37 ° C durante 1 hora y se fijaron en PBS,
que contiene 2% de formaldehído. El ensayo se documentó usando un microscopio
inverso Leica DM-IL equipado con una cámara digital DFC480

Ensayo de NBT y dihidrorodamina de granulocitos de sangre

Ambos ensayos se realizaron de acuerdo con protocolos estándar.

RESULTADOS

Derivación y Caracterización de CGD específica para cada paciente Líneas IPSC

Caracterización in vitro de líneas iPSC humanas derivadas de pacientes CGD y controles no

afectados.

(A): Imágenes de iPSC mostrando morfología de células madre embrionarias humanas

(alto núcleo a relación de citoplasma), altos niveles de actividad de fosfatasa alcalina y
expresión de marcadores de pluripotencia OCT4 (verde), SSEA-4 (verde) y TRA-1 -60
(verde para iPS CGD1.1 y rojo para los demás).

(B): Análisis cariotípico de cuatro líneas iPSC derivadas de pacientes CGD y controles no
afectados. Todos muestran cariotipo 46XY normal.

(C): Confirmación de la mutación de las líneas iPSC derivadas de los pacientes CGD.

IPS-CGD1.1 e iPS-CGD1.2: deleción p47phox / dinucleótido en exón2

IPS-CGD2: gp91 phox mutación con actividad residual

IPS - CGD3: delección del exón 1-3 de la codificación gp91 phox con mutación sin actividad
residual
Caracterización molecular de las líneas iPSC humanas derivadas de pacientes CGD y
controles no afectados.

(A): Análisis cuantitativo por RT-PCR Para la expresión de SOX2 total y endógen y sugiere
que exógeno SOX2 ya no se expresa. Los datos se presentan como media 6 SEM, n ¼ 3. El
valor para H9 se estableció en 1 y todos los demás valores fueron calculados con respecto
a eso . La única excepción fue la iPSC-CGD1.1 (que es más alto), los niveles de expresión de
Sox2 son similares a los encontrados en la línea de células madre representante H9.

(B): Análisis de bisulfito de los promotores NANOG y OCT4 que muestran un patrón de
metilación similar al humano de células madre embrionarias (hESC) H9. Los resultados
muestran círculos llenos indican los dinucleótidos CpG metilados.

(C): Análisis de la actividad de la telomerasa de las líneas CGC-iPSC y fibroblastos utilizados

para su derivación por lo que las IPSC tienen niveles similares de actividad de la
telomerasa a células madre H9. Los datos se presentan como media 6 SEM, n ¼ 3.
(D): Capacidad de diferenciación in vitro de las líneas iPS-CGD. Las Imágenes
Inmunofluorescente que muestran las células de marcaje de tinción de anticuerpos
presentes en tres capas germinales.

 TUJ1: clase neuronal IIIb-tubulina (ectodermo)

 Afetoproteína(Endodermo)
 CD31 (mesodermo).

(E): Diferenciación in vivo de la línea HESC H9 (panel superior), iPS - CGD1.1 (panel central)
e iPSCGD1.2 (Panel inferior) que muestra manchas de teratomas que contienen células
pertenecientes a las tres capas germinales (ectodermo: epitelio neural; Mesodermo:
nódulo de cartílago; Endodermo: intestino primitivo).