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La introducción de métodos de biología molecular en los the simultaneous single tube amplification of different target
laboratorios de microbiología clínica supone un gran apoyo a sequences, allowing the simultaneous detection and
la hora de obtener diagnósticos sensibles y específicos en el identification of various genes of interest. In the present
menor espacio de tiempo posible. Estos métodos no article, the most relevant applications of multiplex PCR for
sustituyen, sino que complementan los ya usados métodos clinical microbiology are summarized.
microbiológicos tradicionales. El análisis integrado de todos
ellos está llevando a resultados más fiables y eficaces. De Key words: Multiplex PCR. Molecular diagnosis.
entre todas las técnicas moleculares utilizadas, la reacción en Amplification.
cadena de la polimerasa (PCR) ha adquirido un gran valor
diagnóstico, permitiendo la detección de agentes etiológicos,
y de sus genotipos de virulencia y resistencia, con gran Introducción
sensibilidad y rapidez. Desde hace algunos años, ha tomado
Durante la última década, el siempre perseguido
gran interés el desarrollo de las denominadas PCR múltiples, diagnóstico rápido, sensible y fiable de los agentes causales
reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en de las enfermedades infecciosas ha empezado a
un único tubo diferentes secuencias diana, permitiendo la experimentar una revolucionaria transformación. La
detección e identificación simultánea de distintos genes de aplicación de técnicas microbiológicas convencionales, que
interés. En el presente trabajo, se recogen las aplicaciones requieren el crecimiento de los microorganismos para su
más relevantes de la PCR múltiple en la microbiología clínica. posterior análisis fenotípico y bioquímico, ha pasado a ser
complementada con la aplicación de métodos moleculares
Palabras clave: PCR múltiple. Diagnóstico molecular. de diagnóstico. En la actualidad, de entre tales metodologías,
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más
Amplificación.
sensible y la que se aplica más satisfactoriamente en
microbiología clínica. En particular, en el caso de patógenos
que son difíciles de crecer in vitro o que presentan
Multiplex PCR in clinical microbiology crecimiento lento, así como en el de todas aquellas
infecciones clínicamente atribuibles a diferentes agentes, la
PCR ha aportado un gran valor diagnóstico. En esta
The introduction of molecular biology methods in clinical
revisión, para evitar una exposición demasiado compleja,
microbiology laboratories brings important insights to sólo se van a considerar las PCR múltiples desarrolladas
obtain sensitive and specific diagnoses as fast as possible. para el diagnóstico de bacterias y no se incluirá el
These methods are not intended for replacement but for diagnóstico de hongos, virus y parásitos. A partir de 1990 se
complement of the already applied microbiologic methods. han desarrollado múltiples protocolos que permiten
The integrated analyses of all of them is bringing to the most identificar de forma específica y rápida bacterias de
feasible and efficient results. Within the molecular diagnóstico difícil hasta ahora, como Mycobacterium spp.,
techniques applied, polymerase chain reaction (PCR) has Chlamydia spp., etc., así como detectar la presencia de genes
acquired a great diagnostic value, permitting the de relevancia clínica, como los que codifican resistencia a
antibióticos o los que confieren mayor virulencia a los
identification of etiologic agents and the fast and sensitive
organismos que los portan1-3. Una vez optimizadas tales
detection of their virulence and resistance genotypes. Since
aplicaciones individuales de la PCR y comprobada su
some years ago, the development of the so called multiplex utilidad clínica, durante los últimos años ha cobrado gran
PCRs has gained deep interest. Those are reactions that get interés el desarrollo de las denominadas PCR múltiples,
reacciones que consiguen detectar de forma simultánea y en
un único tubo diferentes secuencias diana, permitiendo la
detección e identificación simultánea de distintos genes de
Correspondencia: Dr. S. Méndez-Álvarez. interés.
Unidad de Investigación. Hospital Universitario
Nuestra Señora de la Candelaria. En la actualidad, las posibles aportaciones de la PCR
Ctra. Del Rosario, s/n. 38010 Santa Cruz de Tenerife. España. múltiple a la microbiología clínica son tantas y tan variadas
Correo electrónico: smenalv@gobiernodecanarias.org
que sería demasiado extenso introducirlas todas en una
Manuscrito recibido el 25-9-2003; aceptado el 5-12-2003. misma revisión del tema, por lo que en este capítulo no se
Financiado en parte por el *Fondo de Investigación Sanitaria (Contrato FIS
ha intentado más que reflejar cómo la aplicación de esta
99/3060) y por la **Consejería de Educación del Gobierno Autónomo de Canarias. tecnología puede ser de gran ayuda en la detección e
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Méndez-Álvarez S y Pérez-Roth E. La PCR múltiple en microbiología clínica
los cebadores y el programa de temperaturas utilizado, es septicemia o infecciones del tracto urinario. Las cepas de
necesario tener en cuenta varias premisas: a) escoger o E. coli que causan patología intestinal pueden ser agrupadas
diseñar oligonucleótidos que no interaccionen entre sí, es en distintos fenotipos: enterotoxigénicas (ETEC),
decir, que no formen oligómeros; b) que tengan temperaturas enteropatogénicas (EPEC), enteroinvasivas (EIEC),
de anillamiento similares; c) que cada pareja amplifique una enterohemorrágicas (EHEC) y enteroagregativas (EaggEC).
única secuencia diana, y d) que generen amplicones de De especial relevancia clínica son las cepas portadoras de la
tamaño suficientemente diferente como para poder ser información genética necesaria para la producción de
separados y diferenciados tras la amplificación. En cuanto a toxinas Shiga (cepas STEC), de hemolisina entérica, del
la calidad y cantidad de ADN molde, por supuesto debemos factor de adhesión “intimina”, del factor 1 necrótico citotóxico
intentar partir de la concentración menor posible y con (CNF1), o de diferentes factores de virulencia como sistemas
ausencia de sustancias inhibidoras que puedan interferir en de captación de hierro (p. ej., aerobactina o enterobactina) o
la reacción. Para ello, los protocolos de purificación variarán diversos antígenos flagelares, fimbrilares o de superficie. La
en función del tipo de muestra clínica de partida. detección rápida y precisa de estas variantes génicas de
Durante los últimos años, se han publicado numerosos E. coli es fundamental para evitar el riesgo asociado a
trabajos en los que se describen nuevos protocolos para la tratamientos tardíos y para prevenir la posible existencia
extracción de ADN en cantidad y calidad adecuadas para la de brotes o epidemias comunitarios o nosocomiales.
PCR o para la realización de reacciones de amplificación Durante la última década, se ha prestado gran atención
sensibles y específicas directamente a partir de muestras al desarrollo de métodos inmunológicos y moleculares
clínicas. Por supuesto, por su rapidez y sencillez, esta última rápidos, sensibles y específicos para la detección e identi-
opción es la más deseable, aunque también la más difícil de ficación de cepas patógenas de E. coli. Con este objetivo, en el
lograr. Afortunadamente, disponemos ya de métodos que año 2002 se publicaron tres nuevos protocolos de PCR
permiten la detección directa de microorganismos a partir múltiple que permiten la detección simultánea de
de: colonia de cultivo, cultivos líquidos, sangre, suero, orina, numerosos genes de relevancia clínica como son aquellos que
líquido pleural, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, codifican toxinas Shiga, la hemolisina entérica, la intimina,
lavado broncoalveolar, aspirados nasofaríngeos y traqueales, el serotipo de superficie O157 y el serotipo flagelar
aspirado transtorácico, aspirado de nódulo linfático, H7 (tabla 1)6-8. Estos protocolos no sólo posibilitan la
aspirado de médula ósea, muestras serosas de oído, tejido detección de los genes de virulencia y toxicidad más
pulmonar fijado, biopsias de piel, cerebral, hepática, ósea, importantes asociados a E. coli, sino que además permiten
pulmonar, de bazo, de tejido vertebral, etc.2-5 diferenciar las variedades más patógenas (p. ej., los serotipos
Por otro lado, también ha de tenerse en cuenta que, en los O157:H7). Asimismo, en el año 2003 otros dos nuevos
casos en que se detectan genes que codifican toxinas u otros protocolos de PCR múltiple aportan importantes avances en
factores de virulencia, la presencia del gen no implica que la la detección de cepas EPEC, STEC, EIEC, ETEC y EaggEC.
proteína esté siendo producida, por lo que la PCR múltiple En el primero de estos protocolos, Cerna et al9 utilizaron la
debería aplicarse, siempre que sea posible, en conjunción con detección simultánea de tres genes codificados en plásmidos
métodos bioquímicos y/o inmunológicos. No obstante, que confieren la denominada Adherencia de Agregación (AA)
tampoco se debe dejar de considerar la gran utilidad que a las variantes enteroagregativas. En la segunda de estas
puede tener una detección precoz de información genética PCR múltiples, Toma et al10 optimizaron un ensayo que
que puede ser peligrosa si llega a ser expresada, ya que permite la identificación y clasificación simultánea de los
permite la ejecución de medidas preventivas, tanto de distintos tipos de E. coli causales de diarrea mediante la
tratamiento como de control. Por último, es conveniente detección de genes específicos de cepas enteropatogénicas, de
recordar que, tal y como se ha mencionado antes, la PCR es cepas productoras de toxinas Shiga, de variantes
una técnica que, por su aparente simplicidad y su alta enterotoxigénicas, de cepas enteroinvasivas y de variedades
sensibilidad, es muy susceptible de errores de ejecución y de enteroagregativas (tabla 1). Estos protocolos para
contaminaciones, por lo que la introducción de la PCR diferenciar tipos patógenos pueden, además, ser
múltiple en los laboratorios de microbiología clínica requiere complementados con otros protocolos de PCR múltiple que
una formación especializada previa del personal que ejecute permiten subtipificar las variantes toxigénicas (p. ej.,
los análisis. subtipos de Shiga toxin 2), o variantes virulentas (p. ej.,
distintos operones para adhesinas)11-13.
phylococcus spp., enterobacterias, P. aeruginosa, agente infeccioso. Con tal fin, se han optimizado distintos
Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferi, protocolos de PCR múltiple.
Leptospira interrogans, algunas de las cuales causar cuadros En el año 2003, se han desarrollado dos nuevos protocolos
clínicamente no distinguibles de las meningitis asépticas y para la determinación de serogrupos y serotipos de
encefalitis producidas por virus. Los métodos de diagnóstico S. pneumoniae que pueden tener gran utilidad en los
tradicionales, dependientes en gran medida de cultivo, para laboratorios de diagnóstico. A nivel mundial, S. pneumoniae
la identificación del agente causal de la meningitis suelen es uno de los principales agentes causales de mortalidad y
requerir un período de tiempo igual o superior a 36 h. morbilidad asociadas a neumonía en niños y ancianos. La
Además, se ha observado la existencia de un cierto grado de capacidad de los neumococos de producir enfermedad está
discrepancia entre el número de casos clínicamente directamente relacionada con la producción de cápsula,
sospechosos de meningitis bacteriana y de septicemia y el recubrimiento polisacarídico que confiere resistencia a la
número de casos confirmados por cultivo. Con el objetivo de fagocitosis y facilita la evasión del sistema inmunitario. Se
solucionar estos problemas, se ha trabajado mucho en la
han identificado al menos 90 tipos capsulares
puesta a punto de métodos moleculares no dependientes de
inmunológicamente diferentes, pero la mayoría de los
cultivo y, durante los últimos años, se ha obtenido resultados
cuadros infecciosos están producidos por un reducido
muy satisfactorios con el uso de distintos protocolos de PCR
número de serotipos. Los métodos recientemente descritos
múltiple. Dado que constituyen un amplio número de
por Brito et al39 y Lawrence et al40 permiten determinar
métodos, y sería largo y poco clarificador mencionarlos todos,
a continuación se introducen simplemente aquellos mediante PCR múltiple los serotipos y serogrupos más
protocolos que, en su conjunto, permiten descartar un mayor relevantes, de manera que, si bien no sustituyen
número de agentes causales. completamente los métodos serológicos, sí reducen
En el año 2001, Corless et al36 desarrollaron un protocolo drásticamente el número de cepas que tienen que ser
de detección múltiple que permite la identificación analizadas inmunológicamente para poder clasificarlas con
simultánea de N. meningitidis, H. influenzae y fines clinicoepidemiológicos.
S. pneumoniae a partir de distintos tipos de muestras Las infecciones causadas por distintas especies del género
clínicas, concretamente, líquido cefalorraquídeo (LCR), Streptococcus (p. ej., S. pneumoniae, S. pyogenes y
plasma, suero y sangre. La aplicación de este protocolo a un Streptococcus del grupo viridans) pueden ser muy
amplio conjunto de muestras, previamente catalogadas complicadas de erradicar cuando son producidas por cepas
como negativas en virtud de la ausencia de crecimiento el multirresistentes a antibióticos. Por tal motivo, en los
cultivo, permitió detectar alguna de esas tres bacterias. Si últimos años también se han optimizado distintos protocolos
bien éste no es un protocolo de PCR convencional sino de de PCR múltiple para la detección de distintos genes de
PCR en tiempo real, su gran aplicabilidad clínica para el resistencia a macrólidos, codificando bien bombas de
diagnóstico preciso de las afecciones que se discuten en este expulsión activa (genes mef), bien metilasas que modifican la
apartado nos hace creer necesario el mencionarlo. Un año diana del antibiótico (genes erm)41,42.
antes, en 2000, Chesky et al37 desarrollaron un método que Distintos estudios han mostrado la aplicabilidad de la
es destacable por la cantidad y diversidad de agentes PCR múltiple en la identificación precisa del agente causal
infecciosos que permite detectar simultáneamente. En de la neumonía cuando se sospecha que se trate de
concreto, a partir de muestras de LCR permitió identificar C. pneumoniae, C. psittaci o M. pneumoniae43. Además, otra
L. monocytogenes, Mycobacterium spp., citomegalovirus, aportación derivada de estos métodos ha sido la optimización
enterovirus, virus de Epstein-Barr, virus del herpes simple, de la detección de secuencias de interés a partir de muestras
herpesvirus humano tipo 6, virus JC, virus de la clínicas como esputos, exudados faríngeos, aspirados
varicela-zóster y Toxoplasma gondii. nasofaríngeos y traqueales, lavados broncoalveolares,
aspirados transtorácicos, tejidos pulmonares fijados y
biopsias pulmonares.
Neumonía
Entrados ya en el siglo XXI, las afecciones respiratorias
continúan siendo un problema de salud mundial tanto en Patógenos del oído medio
niños como en adultos. El problema es tan relevante que las
En pacientes con otitis media la identificación de los
enfermedades respiratorias han sustituido a las afecciones
agentes causales a partir de muestras clínicas empleando
diarreicas como la causa mayor de muerte en niños menores
de 5 años en todo el mundo. Uno de los patógenos más métodos tradicionales es difícil, laborioso y lento. Por ese
importantes implicados en esta situación es S. pneumoniae, motivo, en la última década fueron optimizados distintos
pero no es el único. Distintos agentes bacterianos pueden protocolos de PCR para la detección individual de los agentes
desencadenar neumonía, siendo los más relevantes entre más habituales. La utilidad clínica de estos métodos quedó
ellos Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, reducida por la laboriosidad de aplicar una detección para
Mycoplasma pneumoniae, K. pneumoniae38. A todos ellos se cada posible bacteria. Sin embargo, Hendolin et al44
unen, además, diversos grupos de virus que pueden causar desarrollaron una PCR múltiple que podría tener una mayor
complicaciones respiratorias similares. Una vez más, la utilidad en el diagnóstico rutinario, ya que permite detectar
multiplicidad de posibles agentes causales y la gran e identificar simultáneamente a partir de muestras serosas
similitud de sintomatologías clínicas, han hecho necesaria la los patógenos más frecuentemente aislados a partir de
búsqueda de nuevos métodos de diagnóstico que permitan muestras del oído medio: S. pneumoniae, H. influenzae,
la identificación sensible, eficaz y lo más rápida posible del Moraxella catarrhalis y Alloiococcus otitidis.
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Méndez-Álvarez S y Pérez-Roth E. La PCR múltiple en microbiología clínica
Conclusiones y perspectivas 9. Cerna JF, Nataro JP, Estrada-García T. Multiplex PCR for detection of three
plasmid-borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains. J Clin
Microbiol 2003;41:2138-40.
Durante las últimas décadas del siglo XX, cuando se 10. Toma C, Lu Y, Higa N, Nakasone N, Chinen I, Baschkier A, et al. Multiplex
planteaban los posibles problemas de salud pública para el PCR assay for identification of human diarrheagenic Escherichia coli. J Clin
siglo venidero, enfermedades como el cáncer, el sida o los Microbiol 2003;41:2669-71.
11. Le Bouguénec C, Lalioui L, Du Merle L, Jouve M, Courcoux P, Bouzari S, et al.
accidentes cardiovasculares aparecían como los grandes Characterization of AfaE adhesins produced by extraintestinal and intestinal
problemas contra los que luchar. Por su parte, los éxitos human Escherichia coli isolates: PCR assays for detection of Afa adhesins that
terapéuticos obtenidos contra las enfermedades infecciosas do or do not recognize Dr Blood group antigens. J Clin Microbiol
después de mitad de siglo gracias al uso de antibióticos, 2001;39:1738-45.
12. Nakao H, Kimura K, Murakami H, Maruyama T, Takeda T. Subtyping of
hicieron pensar que las infecciones bacterianas serían un Shiga toxin 2 variants in human-derived Shiga toxin-producing Escherichia
problema, a lo sumo, menor. Sin embargo, la creciente coli strains isolated in Japan. FEMS Immunol Med Microbiol 2002;34: 289-97.
aparición y diseminación de estirpes bacterianas virulentas 13. Watt S, Lanotte P, Mereghetti L, Moulin-Schouleur M, Picard B, Quentin R.
y de mecanismos de resistencia frente a todos los antibióticos Escherichia coli strains from pregnant women and neonates: Intraspecies
genetic distribution and prevalence of virulence factors. J Clin Microbiol
disponibles han hecho incierta aquella predicción. Por el 2003;41:1929-35.
contrario, adentrados ya en el siglo XXI, tal y como ya 14. Pan TM, Liu YJ. Identification of Salmonella enteritiditis isolates by
indicaba la Organización Mundial de la Salud en polymerase chain reaction and multiplex polymerase chain reaction. J
1999 (Informe WHO/CDS/99.1), las enfermedades Microbiol Immunol Infect 2002;35:147-51.
15. Leal NC, De Almeida, AMP. Diagnosis of plague and identification of virulence
infecciosas son una de las cargas más pesadas para la markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR. Rev Inst Med Trop Sao Paulo
población, y muchas de estas infecciones son originadas o 1999;41:339-42.
complicadas por agentes bacterianos. 16. Granier SA, Leflon-Guibout V, Goldstein FW, Nicolas-Chanoine MH.
Por lo tanto, al igual que antes de 1950, la humanidad se Enterobacterial repetitive intergenic consensus 1R PCR assay for detection of
Roultella sp. Isolates among strains identified as Klebsiella oxytoca in the
encuentra en una situación en la que es prioritaria la clinical laboratory. J Clin Microbiol 2003;41:1740-2.
optimización de la lucha contra las enfermedades 17. Van der Zee A, Steer N, Thijssen E, Nelson J, Van’t Veen A, Buiting A. Use of
infecciosas. Como parte de este gran objetivo global, la multienzyme multiplex PCR amplified fragment length polymorphism typing
microbiología clínica necesita optimizar a nivel de in analysis of outbreaks of multiresistant Klebsiella pneumoniae in an intensive
care unit. J Clin Microbiol 2003;41:798-802.
especificidad, sensibilidad y rapidez, la detección de agentes 18. Pérez-Pérez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC
infecciosos y de sus genes de virulencia y de resistencia, lo betalactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin
cual permitirá ejecutar programas adecuados de prevención Microbiol 2002;40:2153-62.
y tratamiento de estas enfermedades. Para lograr este pro- 19. De Vos D, Lim A Jr, Pirnay JP, Struelens M, Vandevelde C, Duinslaeger L, et
al. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical
pósito, la constante optimización de la PCR múltiple se samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR
plantea como una gran alternativa que permitirá la based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL. J Clin
detección simultánea de un número cada vez mayor de Microbiol 1997;35:1295-99.
dianas, a partir de un número también creciente de tipos de 20. Ke D, Picard FJ, Martineau F, Menard C, Roy PH, Ouellette M, et al.
Development of a PCR assay for rapid detection of enterococci. J Clin Microbiol
muestras clínicas y necesitando una cantidad menor 1999;37:3497-503.
de ácido nucleico molde. Además, la reciente introducción de 21. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance
la PCR en tiempo real en el diagnóstico clínico, permitirá el genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci
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289-300. Molecular epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis:
Cualquier segmento de ADN o de ARN puede ser amplificado siempre que se conozcan las
secuencias de la región diana o, lo que es lo mismo, podemos amplificar siempre que quede
comprendido entre dos secuencias conocidas con las que podrán hibridar oligonucleótidos
complementarios que actuarán como cebadores para que la polimerasa pueda copiar las
hebras molde. Las características anteriores han hecho que PCR sea una prueba muy
usada para diagnostico bacteriológico y viral el problema es su costo y en Guatemala no
muchos laboratorios cuentan con esta tecnología
Bibliografía
Mendez-Alvarez, S., & Pere-Roth, E. (2014). ELSEVIER.ES. Obtenido de La PCR múltiple en
microbiología clínica: http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-
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