Imunogenisitas Virus Seperti Partikel Membentuk DNA Baculoviral Vaksin melawan Pandemi

Influenza H1N1

Abstrak

Wabah influenza H1N1 pada tahun 2009, yang merupakan pandemi influenza pertama abad ke-21,
ditransmisikan ke lebih dari satu juta individu dan menewaskan 18.449 orang. Status saat ini di
banyak negara adalah menyiapkan vaksin influenza menggunakan vaksin bunuh diri berbasis sel atau
berbasis telur. Namun, platform vaksin influenza tradisional memiliki beberapa keterbatasan. Untuk
mengatasi keterbatasan tersebut, banyak peneliti telah mencoba berbagai pendekatan untuk
mengembangkan platform produksi alternatif. Salah satu pendekatan alternatif, kami melaporkan
efikasi vaksinasi HA dengan vaksin DNA baculoviral (AcHERV-HA). Namun, respon imun yang didapat
oleh vaksin AcHERV-HA, yang hanya menargetkan antigen HA, lebih rendah daripada vaksin yang
dibunuh komersial. Untuk mengatasi keterbatasan vaksin ini, kami membangun vaksin DNA bentuk-
DNA endogen yang berbasis manusia endogenous, vaksin berbasis baculovirus, virus-like-particle
(VLP) (disebut AcHERV-VLP) melawan pandemi influenza A / California / 04/2009 (pH1N1). Tikus
BALB / c yang diimunisasi dengan AcHERV-VLP (1 × 107 FFU AcHERV-VLP, i.m.) dan dibandingkan
dengan tikus yang diimunisasi dengan vaksin yang dibunuh atau tikus yang diimunisasi dengan
AcHERV-HA. Akibatnya, imunisasi AcHERV-VLP menghasilkan respons imun humoral yang lebih besar
dan menunjukkan aktivitas penetralisir dengan strain H1 intrasubgroup (PR8), produksi antibodi
penetralisir, sekresi interferon-tinggi dalam splenocytes, dan penurunan virus yang menumpuk di
paru-paru setelah Tantangan dengan dosis mematikan virus influenza. Sebagai kesimpulan, vaksin
DNA baculovirus pembentuk VLP bisa menjadi kandidat vaksin potensial yang mampu mengantarkan
DNA secara efisien ke vaksin dan VLP membentuk DNA yang memunculkan kekebalan
imunogenisitas lebih kuat daripada vaksin bunuh diri berbasis telur.

pengantar

Virus Influenza A adalah ancaman kesehatan masyarakat yang menonjol yang telah meninggalkan
jejak jejaknya dalam sejarah [1, 2]. Contoh terbaru, wabah influenza H1N1 pada tahun 2009 (sH1N1),
merupakan pandemi influenza pertama abad ke-21, yang disebut influenza A / CA / 4/2009 (pH1N1)
[3, 4]. Kasus pertama dilaporkan terjadi di Meksiko dan Amerika Serikat pada bulan April, dan pada
bulan Juni, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah mengumumkan sebuah pandemi tingkat 6 [5].
Menurut WHO "Global Alert and Response" pada tahun 2010, pandemi ini menginfeksi lebih dari
satu juta individu dan membawa 18.449 nyawa [6]. Meskipun demikian, diyakini secara luas bahwa
vaksinasi influenza penting dalam mengendalikan penyebaran pH1N1 [7].

Saat ini, vaksin influenza berlisensi berbasis telur atau berbasis sel, dengan yang pertama merupakan
mayoritas pasar vaksin [8]. Namun, vaksin influenza berbasis telur tradisional memiliki beberapa
keterbatasan, termasuk kerentanan rantai pasokan, perlunya memilih strain a priori, reaksi alergi
terhadap protein telur dalam vaksin, dan proses produksi yang seringkali timeconsum-semua
masalah penting yang perlu ditangani. [9]. Untuk mengatasi keterbatasan ini, banyak peneliti telah
mencoba berbagai pendekatan untuk mengembangkan platform produksi alternatif [10-14]. Salah
satu pendekatan alternatif tersebut adalah baculovirus, yang tidak meniru atau memaksakan
sitotoksisitas yang nyata pada sel mamalia, sehingga meminimalkan kemungkinan efek samping [15,
16].
Baculovirus memiliki kapasitas kloning sebesar 38 kb, memungkinkan mereka untuk mengakomodasi
satu sisipan besar atau beberapa gen yang mencakup elemen peraturan [17]. Atribut ini telah
memicu minat dalam mengeksplorasi baculoviruses sebagai vektor untuk sistem ekspresi protein
rekombinan dan terapi gen [18-20]. Terlepas dari keuntungan baculovirus, mengatasi keefektifan
yang lebih rendah dibandingkan vaksin konvensional tetap menjadi tantangan [21]. Kami
sebelumnya melaporkan bahwa vektor baculovirus yang tidak dapat direplikasi yang mengandung
DNA pengkodean antigen dapat berfungsi sebagai sistem pengiriman nano, dan memperbaiki
pengiriman gen eksogen ke sel manusia dengan menggabungkan glikoprotein amplop retrovirus
endogen manusia (HERV-W) pada rekombinan baculovirus [ 21-23].

Partikel mirip virus (VLPs) mewakili sebuah platform vaksin yang canggih dengan peningkatan
imunogenisitas [24]. VLP terbentuk oleh protein virus struktural, yang memiliki kecenderungan
inheren untuk merakit sendiri dan meniru morfologi patogen [25]. Berbeda dengan virus hidup, VLP
tidak infektif dan tidak bereplikasi, karena pada dasarnya tidak memiliki bahan paTogenetik [24].
Selain itu, VLP telah dikenal untuk meningkatkan imunogenisitas dengan menghadirkan epitop
antigenik dalam konformasi yang benar, menghasilkan respon kekebalan humoral dan seluler yang
kuat [24, 26, 27]. Dengan kelebihan ini, VLPs telah banyak digunakan untuk pengembangan vaksin
dan aplikasi biomedis lainnya [28].

Sebelumnya, kami memastikan keefektifan vaksin influenza yang dikembangkan untuk pengiriman
DNA gen HA pH1N1 menggunakan vektor baculoviral yang tidak dapat direplikasi (AcHERV-HA).
Namun, vaksin AcHERV-HA hanya menimbulkan respons kekebalan terhadap protein HA.
Monovalensi semacam itu dapat membatasi tingkat perlindungan terhadap virus influenza heterolog
[21]. Di sini, kami membangun sebuah baculovirus yang membawa gen pH1N1 HA, NA, dan M1 yang
mampu merakit VLPs dalam sel mamalia. Efikasi vaksin baculovirus pembentuk VLP-AcrelV-VLP-diuji
pada tikus BALB / c.

Bahan dan metode

1. Pernyataan Etika

Penelitian ini dilakukan sesuai ketat dengan Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan
Laboratorium dari National Institutes of Health. Prosedur peternakan dan eksperimental disetujui
oleh Komite Perawatan dan Perawatan Kelembagaan Kelembagaan Universitas Konkuk (persetujuan
IACUC No .: KU14082). Splenektomi dan pneumonektomi dilakukan pada lubang pembedahan steril.
Untuk meminimalkan penderitaan, tikus diberi obat tidur dengan campuran anestesi tiletamin dan
xylazine (masing-masing 50 dan 5 mg / kg berat badan).

2. Sel dan Virus

Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) sel serangga (Invitrogen, Amerika Serikat, Carlsbad, CA, Katalog No.
11496-015) dipertahankan pada suhu 27 ° C pada media Sf-900 (Invitrogen) ditambah dengan
antibiotik / antimikotik 1% (Gibco-BRL, CA, USA). HEK 293T cells (American Type Culture Collection
[ATCC], Manassas, VA, USA, No. Katalog CRL-3216) dikultur dalam media Eagle Eagle yang
dimodifikasi Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) ditambah dengan serum janin bovine 10% (FBS; Gibco-
BRL) dan 1% penisilin-streptomisin. Sel induk ginjal Madin-Darby (MDCK) (ATCC, No. katalog PTA-
6500) ditanam di media esensial minimum Eagle (MEM; Gibco-BRL) yang mengandung 10% FBS dan
1% penisilin dan streptomisin. Sel-sel dijaga dalam atmosfir CO2 5% yang dilembabkan pada suhu 37
° C. Tipe virus influenza beradaptasi tikus A / CA / 04/2009 (ma-pH1N1) diberikan oleh Institut Vaksin
Internasional (IVI, Seoul, Republik Korea). Virus influenza tipe A / PR / 8/1934 (H1N1) diberikan oleh
Centers for Disease Control and Prevention (CDC, Osong, Republik Korea). Virus tersebut diperkuat
dalam telur embrio berumur 10 hari. Setelah diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 3 hari dan
dinginkan pada suhu 4 ° C selama 12 jam, cairan allantoic dipanen, diiradiasi, dan disimpan pada
suhu -80 ° C sampai digunakan.

3. Hewan

Tikus betina betina / c (17,4 ± 0,9 g), berusia 4-5 minggu (n = 48, n mengacu pada jumlah hewan,
laporan VAF tikus menunjukkan bahwa tikus bebas dari patogen virus, bakteri dan parasit yang
diketahui) dibeli dari Orient-Bio (Seungnam, Kyonggi-do, Republik Korea) dan bertempat di kandang
filter atas, dengan air dan makanan disediakan ad libitum.

Tikus dipelihara di fasilitas Bio-safety Level 2 dengan siklus siang hari 12 jam terbalik dengan lampu
menyala pada pukul 20.30 malam di suhu (22 ± 1 ° C) dan kelembaban (55 ± 5%) ruang kontrol.
Semua kandang berisi serutan kayu dan tempat tidur.

4. Pembangunan Baculovirus rekombinan

Vektor baculoviral rekombinan yang mengekspresikan HERV env (pFastBac1-HERV) sebelumnya

dibuat dengan memasukkan gen envelope sintetis yang diotokodifikasi sintetis dari tipe HERV tipe
(Gen- Bank Accession Number NM014590; GenScript, USA) ke dalam pFastBac1 (Invitrogen) [29].

rangkaian Panjang protein HA dan NA secara keseluruhan dari influenza A / CA / 04/2009 (pH1N1)
sebelumnya dibangun dengan pelepasan polymerase chain reaction (PCR) - dari virus cDNA pH1N1
dan dimasukkan ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega, AS ) dan dioptimalkan dengan urutan
nukleotida [21]. Urutan protein M1 dari H5N2 influenza A / ayam / Vietnam / OIE-2215/2012 berasal
dari NCBI GenBank (nomor akses BAP71888.1). Gen kodon dioptimalkan untuk ekspresi optimal
pada sel mamalia dan disintesis secara biokimia (Gen-Script, AS). Panjang gen HA, NA, dan M1 secara
individual diklon ke dalam pcDNA3.1 (-) plasmid di bawah kendali promotor cytomegalovirus
(Activavirus). Gen HA, NA dan M1, dari promoter CMV sampai ke podium pertumbuhan sapi (BGH)
poli A, diamplifikasi dengan PCR dan diklon ke plasmid pFastBac1-HERV. Primer untuk PCR
ditunjukkan pada Tabel S1.

Baculovirus rekombinan diproduksi dengan menggunakan sistem ekspresi baculovirus Bac-to-Bac

menurut manual pabrik pembuat (Invitrogen). Skema untuk membangun rekombinan baculovirus,
AcHERV-HA dan AcHERV-VLP, ditunjukkan pada Gambar 1. Setelah dilakukan propagasi pada sel Sf9,
baculovirus rekombinan yang diperkuat dalam supernatan dimuat di atas sukrosa 30%, dan
dimurnikan dengan ultrasentrifugasi pada 40.000 rpm pada suhu 4 ° C selama 1 jam di rotor 50.2Ti
(Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA). Pelet virus ditangguhkan kembali dalam larutan buffer fosfat
(PBS) dan disimpan pada suhu -80 ° C sampai digunakan.

5. Karakterisasi Ekspresi Baculovirus pada Sel Mamalia

Pembuatan vaksin vektor baculoviral rekombinan dikonfirmasi dengan mengisolasi DNA genom virus
dari baculovirus rekombinan, yang dipanen dari sel Sf9 yang terinfeksi menggunakan kit virus RNA
Nukleospin (Macherey-Nagel, Düren, Jerman), dan memperkuat gen HERV, HA, NA, dan M1 dengan
PCR menggunakan primer yang ditunjukkan pada Tabel S1. Kuantifikasi baculovirus rekombinan
dilakukan dari DNA baculovirus rekombinan dengan menggunakan Kit Titrasi qPCR BacPAK ™ (Takara
& Clontech, Mountain View, CA, AS), dan jumlah salinan PCR terukur per mililiter (/ ml) diubah
menjadi unit pembentuk fokus (FFU ) / ml menurut manual pabrik.

Ekspresi baculovirus pada sel mamalia diuji dengan menginfeksi sel 293T dengan baculovirus pada
kelipatan infeksi (MOI) 10. Tujuh puluh dua jam setelah infeksi, penyumbatan barat dilakukan
dengan menggunakan antibodi primer anti-pH1 tikus (1: 100 pengenceran, diangkat di laboratorium
kami dari tikus yang bertahan melawan tantangan ma-pH1N1). Antibodi anti-β-aktin (1: 2.000
pengenceran; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AS) digunakan sebagai kontrol pemuatan
protein.

Untuk analisis imunofluoresensi, monolayer sel 293T terinfeksi dengan baculovirus pada MOI 10
selama 72 jam. Selanjutnya, sel-sel diobati dengan antibodi primer anti-pH1N1 tikus (pengenceran 1:
100) selama 2 jam, dan diinkubasi dengan antibodi IgG antibodi anti-tikus kambing yang dikuatkan
dengan fluorescein (FITC) dikeringkan 1: 200; Bioteknologi Santa Cruz, ). Gambar sel bernoda
kekebalan diperoleh dengan menggunakan mikroskop terbalik (Eclipse Ti-U; Nikon, Jepang).

6. Mikroskopi Elektron

Pembentukan VLP influenza pada sel mamalia diverifikasi dengan memanen VLP dari supernatan
media pertumbuhan dan lisat sel 293T yang terinfeksi baculovirus, dan memusatkan perhatian dan
sebagian memurnikannya menggunakan gradien langkah sukrosa 20% (b / v) pada larutan buffered
phosphine (PBS). VLP yang dimurnikan diadsorpsi dengan flotasi ke kotak tembaga formular / karbon
dilapisi 300 mesh yang baru habis dan dibiarkan mengering sepenuhnya (Ted pella, Redding, CA,
USA).

Kisi-kisi tersebut dibilas dengan buffer yang terdiri dari 20 mM Tris (pH 7,4) dan 120 mM KCl,
diwarnai secara negatif dengan 1% uranyl acetate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS), dan kemudian
dikeringkan dengan aspirasi. VLP divisualisasikan pada mikroskop elektron transmisi JEM-1010 (JEOL
Ltd., Tokyo, Jepang) yang beroperasi pada suhu 80 kV, dan ditangkap secara digital dengan kamera
CCD Erlangshen ES1000W (Gatan Inc., Pleasanton, CA, USA).

7. Imunisasi dan Tantangan Tikus

Tikus betina perempuan BALB / c berumur lima minggu dibagi menjadi empat kelompok imunisasi (n
= 12 tikus / kelompok): (1) kontrol PBS (100 μl), (2) vaksin terbunuh (vaksin terbunuh 2,0 μg), (3)
AcHERV-HA (1 × 107 FFU / 50 μl) dan (4) AcHERV-VLP (1 × 107 FFU / 50 μl). Semua tikus menerima
dua dosis imunisasi pada interval 2 minggu dengan injeksi intramuskular (hari 0 dan 14, anggota
belakang), sampel serum dikumpulkan pada hari 0, 7 dan 21 setelah imunisasi pertama (hari 0).
Sampel serum diperoleh dengan sentrifugasi darah utuh yang dikumpulkan dari vena jugularis
eksternal kanan. Selain itu, dua tikus per kelompok (n = 2 / kelompok) dibius dan dikorbankan
dengan usaha untuk meminimalkan penderitaan mereka, kemudian limpa mereka dilepas pada hari
ke 28.
Dua minggu setelah imunisasi terakhir, tikus acak (n = 10 / kelompok) dipindahkan ke fasilitas tingkat
BSL 2, dimana mereka diberi obat penenang (campuran tiletamin dan xylazine; 50 dan 5 mg / kg
berat badan) Ditantang secara intranasal dengan ma-pH1N1 pada 20 kali dosis 50% mematikan
(20LD50) dan dipantau selama 14 hari berturut-turut. Empat hari setelah infeksi, subset tikus (n = 2 /
kelompok) dikorbankan dan paru-paru mereka dikumpulkan (untuk analisis penumpahan virus) dan
juga diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H & E). Percobaan ini dilakukan dengan mengikuti
jadwal percobaan yang dirancang (S1 Fig).

Tantangan dosis 20LD50 jelas menghasilkan penyakit parah yang ditandai dengan meringkuk,
mengacak bulu, lesu, anoreksia yang menyebabkan penurunan berat badan, dan kematian. Karena
itu, tikus dipantau dua kali sehari. Dalam kasus ini tikus menunjukkan gejala infeksi yang khas dan
penurunan berat badan yang cepat 15-20 persen dalam beberapa hari; dianggap mati Selanjutnya,
tikus menunjukkan penurunan berat badan lebih dari 15-20%, dilakukan dengan euthanasia secara
manusiawi menggunakan karbon dioksida dalam kondisi campuran anestesi tiletamin dan xylazine
sesuai pedoman NC3Rs ARRIVE untuk euthanasia hewan.

8. Uji Serologis

Uji immunosorbent enzyme-linked (ELISA) dilakukan untuk menilai kadar IgG spesifik anti-pH1N1
pada sera tikus. Singkatnya, sampel darah dikumpulkan dari tikus dan sera diperoleh. Sembilan
puluh enam sumur dilapisi semalam dengan 8 unit hemaglutinasi (HAU) dari pH1N1 yang tidak aktif
dengan menggunakan metode standar, seperti yang dijelaskan sebelumnya [30, 31]. Absorbansi
pada 450 nm (A450) diukur dengan menggunakan pembaca piring ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA). Hasil dinyatakan sebagai timbal balik dari pengenceran akhir yang terdeteksi. Uji hemaglutinasi
inhibisi (HAI) dilakukan dengan menginkubasi 4 HAU virus influenza pH1N1 dengan 2 kali lipat
pengencer panas-inaktivasi sera di piring V-bottom 96-well dan menggunakan 1% eritrosit ayam.
Titer HAI disajikan sebagai timbal balik dari pengenceran serum tertinggi yang benar-benar
menghambat hemaglutinasi.

9. Uji Netralisasi

Uji netralisasi mikro standar telah dimodifikasi dari prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya [30,
32]. Secara singkat, sampel serum dilisensikan panas selama 30 menit pada suhu 56 ° C, dan
kemudian pengenceran seri 2 kali disiapkan dalam volume 50 μl serum SUBS bebas (pengencer V)
pada piring immunoassay. Serat yang diencerkan dicampur dengan volume pengencer V yang sama
yang mengandung influenza

virus pada 100 kali dosis kultur jaringan median infektif (TCID50). Setelah inkubasi 2 jam, campuran
dipindahkan ke seluk beluk sel MDCK yang tumbuh pada 96-kultur jaringan sumur. Setelah sumur
kontrol virus menunjukkan efek cytopathic virus yang diinduksi (CPE; 48 jam), kapasitas penetral
sampel serum individu dinilai dengan menentukan ada tidaknya CPE, dan pewarnaan dengan larutan
kristal kristal 1% (formaldehida 1% dan 10% metanol) selama 15 menit. Titer antibodi penetralisir
dinyatakan sebagai timbal balik dari pengenceran serum tertinggi yang benar-benar menghambat
CPE yang disebabkan virus.

10. ELISPOT Assay

Produksi interferon-γ (IFN-γ) dari splenocytes tikus yang diimunisasi dideteksi dengan kit ELISPOT
(BD Biosciences, AS, San Jose, CA), seperti yang dijelaskan oleh themanufacturer. Secara singkat, 96
lempeng membran dilapisi dengan 0,2 μg mouse IFN-γ menangkap antibodi dan diblokir dengan FBS
10% pada suhu 37 ° C. Splenocytes (1 × 106 sel) dalam 100 μl RPMI-1640medium diterapkan pada
masing-masing sumur dan distimulasi dengan virus influenza influenza influenza yang tidak aktif
selama 24 jam tambahan pada suhu 37 ° C. Pelat kemudian dicuci dan diolah dengan 20 ng Antibodi
antibodi IFN-bi biotinilasi selama 2 jam. Streptavidin-alkaline phosphatase kemudian ditambahkan
ke dalam sumur, dan warna dikembangkan menggunakan pereaksi substrat AEC (BD Biosciences).
Jumlah titik dihitung dengan menggunakan pembaca ELISPOT (AID ElispotReader ver.4; AID GmbH,
Straßberg, Jerman).

11. Titrasi Virus di Paru-paru Tikus uji

Empat hari setelah percobaan, tikus (n = 2 / kelompok) dikorbankan dan jaringan paru-paru mereka
dikumpulkan dalam 3 ml PBS yang mengandung gentlami 2%. Mengumpulkan paru-paru
dihomogenkan selama kurang lebih 2 menit dengan menggunakan homogenizer jaringan tangan
(Produk Biospec, Bartlesville, OK, AS) dan disentrifugasi untuk menghilangkan kotoran. Supernatan
tersebut dilarutkan 10 kali lipat dan diencerkan ke monolana sel MDCK di 96 sumur kultur jaringan
dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 ° C. Titer virus dihitung dengan menggunakan rumus
Reed-Muench dan dinyatakan sebagai log10 TCID50 per mililiter.

12. Analisis Statistik

Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad 6.0 (GraphPad
Software, Inc. La Jolla, CA, AS), dan data disajikan sebagai mean ± standard error of mean (SEM) atau
sebagai persentase. Untuk analisis signifikansi perbedaan, kami menggunakan analisis varians one-
way (ANOVA) atau uji t-test dua ekor. Nilai P sama dengan atau kurang dari 0,05 dianggap signifikan
secara statistik.

Hasil Ekspresi Baculovirus Rekombinan In Vitro Untuk mengekspresikan HA, NA dan M1 secara
efisien dari baculovirus pada sel mamalia, kami membuat sebuah baculovirus yang dikodekan
dengan HERV yang mengekspres gen HA, NA, dan M1 di bawah kendali promotor 5'V CMV dalam
DNA bacmid ( Gambar 1). Penyisipan gen yang benar pada rekombinan baculovirus dikonfirmasi
dengan amplifikasi PCR dari DNA genom baculoviral (Gambar 2A). Sf9 yang melahirkan virus
baculovirus yang mengandung gen HA atau gen pembentuk VLP (AcHERV-HA atau AcHERV-VLP),
ditransduksi menjadi sel 293T. Ekspresi protein HA pada sel 293T yang terinfeksi virus terdeteksi
oleh blotting barat (Gambar 2B). Ekspresi protein pada sel 293T yang terinfeksi baculovirus
dikonfirmasi lebih lanjut dengan pewarnaan imunofluoresensi menggunakan antibodi poliklonal
tikus terhadap pH1N1 dan antibodi anti tikus yang dikuatkan dengan fluorescein isothiocyanate
(FITC) (Gambar 2C). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa protein berhasil diekspresikan
pada sel 293T yang terinfeksi baculovirus. Pembentukan VLP influenza pada sel mamalia
dikonfirmasi dengan membandingkan AcrelV-VLP bernoda negatif dengan pH1N1 tipe liar
menggunakan mikroskop elektron transmisi, yang mengungkapkan sebagian besar partikel tertutup
yang sejajar dengan diameter 100-150 nm (Gambar 2D).

Respons Kekebalan Humoral pada Tikus

Untuk mengetahui keimogenisitas AcHERV-VLP, kami mengumpulkan sampel tikus yang diimunisasi
(10/12, sepuluh sampel yang dipilih secara acak dari masing-masing kelompok) dan menganalisis
titer IgG spesifik pH1N1 oleh ELISA. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3A, IgG spesifik pH1N1
diproduksi di semua kelompok vaksinasi setelah imunisasi pertama dan ditingkatkan ~ 2,5-3 kali lipat
setelah imunisasi kedua. Sebuah analisis komparatif menunjukkan bahwa titer IgG 1,2 kali lipat lebih
tinggi pada tikus yang diimunisasi AcrelV-VLP daripada tikus yang diimunisasi AcHERV-HA, dan
sebanding dengan tikus yang diimunisasi dengan vaksin terbunuh.

Gambar 2. Karakterisasi baculovirus rekombinan (rBV; AcHERV-HA dan AcHERV-VLP) dan ekspresinya
dalam sel mamalia. (A) Deteksi PCR gen HERV, HA, NA, dan M1 dalam DNA baculovirus yang
dibangun. Jalur 1: kontrol untuk PCR; jalur 2: DNA Baculovirus AcHERV-HA; jalur 3: DNA baculovirus
AcHERV-VLP. (B) Analisis blot Barat ekspresi protein HA pada rekombinan baculovirus (rBV) yang
terinfeksi 293T sel. Mock, sel terinfeksi AcMNPV; AcHERV-HA, sel yang terinfeksi AcHERV-HA;
AcHERV-VLP, sel yang terinfeksi dengan AcHERV-VLP. (C) Mikrograf immunofluoresensi sel 293T yang
terinfeksi-rBV. Tujuh puluh dua jam setelah infeksi, sel-sel diinkubasi dengan antibodi tikus terhadap
pH1N1, diikuti dengan inkubasi dengan antibodi IgG anti-tikus berkokok FITC. Mock, sel terinfeksi
AcMNPV; AcHERV-HA, sel yang terinfeksi AcHERV-HA; AcHERV-VLP, sel yang terinfeksi dengan
AcHERV-VLP; Gabung, gabung gambarnya. (D) Mikroskopi elektron transmisi dari VLP bernoda
negatif dan diwasmi dari sel 293T yang terinfeksi -BBB. Tujuh puluh dua jam setelah infeksi, VLP
dipanen dari 293T sel, dipekatkan, dan dimurnikan sebagian menggunakan ultrasentrifugasi gradien
gradien 20%. Untuk mikroskop elektron, VLP diwarnai dengan 1% uranyl asetat. Bilangan batang,
100 nm (x 100.000) atau 200 nm (× 120.000). Virus tipe 1 terinfeksi virus influenza A / California /
04/2009; AcHERV-HA, VLP yang dimurnikan dari sel 293T yang terinfeksi AcrelV-HA; AcHERV-VLP,
VLP yang dimurnikan dari sel 293T yang terinfeksi AcrelV-VLP.

Untuk menguji reaktivitas silang sera dari tikus yang diimunisasi, kami melakukan uji HAI
menggunakan strain H1 homolog (pH1N1) dan strain H1 intrasubgroup (PR8). Semua kelompok
imunisasi vaksin (kecuali kontrol PBS) menunjukkan titer antibodi HAI> 1:32 terhadap pH1N1
homolog; Seperti yang diharapkan, imunisasi dengan AcrelV-VLP meningkatkan respons antibodi HAI
(~ 3.9 kali lipat) dibandingkan dengan imunisasi dengan AcHERV-HA (Gambar 3B). Menariknya,
hanya tikus yang diimunisasi oleh AcHERV-VLP yang menunjukkan respon HAI tinggi (> 1:32)
terhadap strain H1 intrasubgroup (Gambar 3B).

Untuk lebih mengkonfirmasi hasil ini, kami menentukan titer penetral sera tikus yang diimunisasi
(8/12, delapan sampel yang dipilih secara acak dari masing-masing kelompok) terhadap pH1N1 dan
PR8. Serupa dengan tanggapan HAI, titer netralisasi pada sera sekitar 4 kali lipat dan 5 kali lipat lebih
tinggi pada tikus yang diimunisasi dengan AcHERV-VLP daripada tikus yang diimunisasi dengan
AcHERV-HA terhadap virus pH1N1 dan virus PR8 (Gambar 3C).

Data ini menunjukkan bahwa imunisasi AcHERV-VLP menghasilkan respon imun humoral yang kuat
dan menunjukkan bahwa antibodi yang dihasilkan memiliki potensi penetralisir yang lebih besar
terhadap strain H1 lainnya.

IFN-γ Respons kekebalan pada tikus

Untuk mengetahui efek imunisasi terhadap produksi IFN-,, kami melakukan tes ELISPOT pada
splenosit yang diisolasi dari tikus (n = 2 / kelompok) 2 minggu setelah imunisasi akhir. Splenosit dari
tikus yang diimunisasi dengan vaksin yang dibunuh hanya mengeluarkan kadar dasar IFN-γ, serupa
dengan hasil yang diperoleh pada tikus yang disuntik dengan PBS (Gambar 4). Namun, splenosit dari
tikus yang diimunisasi dengan baculovirus (AcHERV-HA atau AcHERV-VLP) mengeluarkan 10 sampai
11 kali lebih banyak IFN-γ daripada tikus yang diimunisasi dengan vaksin terbunuh. Perbandingan
antara kelompok AcHERV-HA dan kelompok AcHERV-VLP menunjukkan perbedaan secara statistik (p
= 0,013), dan jumlah titik IFN-number pada kelompok AcHERV-HA adalah 12,8% lebih rendah dari
pada kelompok AcHERV-VLP, yang mengindikasikan imunisasi AcHERV-VLP memunculkan lebih
banyak produksi IFN-γ daripada imunisasi AcHERV-HA. Hasil ini mendukung kesimpulan bahwa
sistem baculovirus pembentuk VLP yang disandikan oleh HERV adalah kandidat vaksin influenza yang
kuat dengan potensi untuk meningkatkan respons kekebalan seluler serta respon imun humoral.

Perlindungan terhadap Tantangan Viral pH1N1 pada Tikus

Tikus (n = 10 / kelompok) ditantang secara intranal dengan dosis 20LD50 virus pH1N1 menular 3
minggu setelah imunisasi, dan penurunan berat badan dan kondisi kesehatan dipantau selama 14
hari berturut-turut. Semua tikus yang tertantang kehilangan berat badan dengan cepat selama 5 hari
pertama pasca infeksi (dpi), kecuali tikus pada kelompok PBS, kemudian mendapatkan kembali berat
badan yang hilang. Tikus yang diimunisasi dengan AcHERV-VLP hilang ~ 10% dari berat awal mereka,
sedangkan tikus pada kelompok AcHERV-HA menunjukkan penurunan berat badan 15%. Selanjutnya,
tikus dipantau memasuki fase pemulihan, AcHERV-VLP mulai pulih pada 7 dpi, sedangkan pemulihan
tertunda (11 dpi) pada kelompok AcHERV-HA (Gambar 5A).

Kelompok imunisasi AcHERV-VLP menunjukkan perlindungan menyeluruh terhadap tantangan virus

influenza hidup, sedangkan kelompok AcHERV-HA menunjukkan perlindungan 62,5%; seperti yang
diharapkan tidak ada perlindungan yang diamati pada kelompok PBS. Secara kolektif, hasil ini
menunjukkan bahwa AcHERV-VLP memberikan perlindungan yang lebih baik daripada AcHERV-HA,
karena peningkatan imunogenisitas pada respon imun humoral dan respons imun seluler (Gambar
5B).

Analisis Histologis paru-paru dari tikus yang diimunisasi setelah Viral

Tantangan Untuk menilai hubungan antara clearance virus dan lesi histologis di paru-paru, kami
mengorbankan sebagian tikus dari masing-masing kelompok (n = 2) pada tantangan hari ke 4, dan
kemudian menentukan titer virus gudang di paru-paru dan menilai kerusakan paru-paru . Titer virus
ditentukan dengan mengukur infeksi sel MDCK, yang dinyatakan sebagai log10 TCID50 / ml. Titer
virus pada tikus yang disuntikkan PBS adalah 104,73 ± 0,22, sedangkan pada tikus yang diimunisasi
dengan vaksin terbunuh atau AcHERV-HA masing-masing 103,99 ± 0,23 dan 104,08 ± 0,11, kira-kira
pengurangan 5 kali lipat dalam titer virus. Secara mencolok, titer virus tumpahan pada paru-paru
tikus dalam kelompok yang diimunisasi dengan AcHERV-VLP bahkan lebih rendah (103,47 ± 0,21) -
pengurangan keseluruhan titer virus mendekati 20 kali lipat (Tabel 1). Konsisten dengan hasil titer
virus, analisis histologis bagian paru-paru bernoda H & E menunjukkan bahwa tikus yang disuntik
dengan PBS saja mengalami infiltrasi parah di pembuluh darah, bronchioles dan alveoli; Bahkan tikus
yang diimunisasi dengan vaksin terbunuh atau AcHERV-HA menunjukkan infiltrasi interstisial /
alveolar dan kerusakan struktural di sekitar bronkiolus atau pembuluh (Gambar 6C dan 6D). Namun,
tikus yang diimunisasi dengan AcHERV-VLP memiliki infiltrasi interstisial dan alveolar yang lebih
sedikit, menunjukkan perlindungan terhadap struktur ini terhadap infeksi virus (Gambar 6E).

Diskusi

Tren terbaru dalam pengembangan vaksin influenza telah mengikuti dua jalur umum: pendekatan
vaksin universal yang menggunakan domain tangkapan untuk menginduksi antibodi penetralisir
spektrum luas, dan pendekatan spesifik yang menggunakan VLP [33, 34]. Selain keuntungan mereka
dari peningkatan keamanan dan respon kekebalan yang kuat, vaksin VLP dapat dengan mudah
mengganti gen HA atau NA untuk memungkinkan tanggapan dinamis dan cepat terhadap wabah
influenza baru [14, 35, 36]. Namun, konstruksi dan produksi VLP yang efisien merupakan hambatan
utama bagi komersialisasi [37].

Gambar 3. Analisis serologis pada tikus yang diimunisasi dengan vaksin terbunuh dan baculovirus.
Sera dari tikus yang disuntikkan secara intramuskular dengan PBS, membunuh vaksin, AcHERV-HA,
atau AcHERV-VLP dikumpulkan dan dievaluasi untuk tanggapan kekebalan tubuh. (A) Titer antibodi
IgG antigen spesifik terhadap pH1N1 pada tikus sera (pada hari 0, 7 dan 21) ditentukan oleh ELISA.
A450 mengacu absorbansi pada 450 nm. (B) HAI terhadap strain pH1N1 atau strain PR8 pada sera
tikus pada hari ke 21. (C) Menetralisir titer melawan strain pH1N1 atau strain PR8 pada sera tikus
pada hari ke 21. Tes ELISA dan HAI dilakukan dengan menggunakan sepuluh sampel yang dipilih
secara acak dari setiap kelompok (10/12). Uji netralisasi dilakukan dengan menggunakan delapan
sampel yang dipilih secara acak dari masing-masing kelompok (8/12). Nilai dalam tanda kurung
menunjukkan jumlah tikus yang diuji / jumlah tikus yang diimunisasi pada masing-masing kelompok.
Semua percobaan dijalankan dalam rangkap tiga. Data yang ditampilkan adalah mean ± SEM untuk
sampel. Analisis statistik menunjukkan bahwa data signifikan dengan p <0,05 atau tidak signifikan
(uji ANOVA satu arah dan uji tapak dengan dua ekor): vaksin terbunuh dan kelompok HA AcrelV
dibandingkan dengan kelompok AcHERV VLP (pada hari ke 21).

Gambar 4. Produksi IFN-γ pada tikus yang diimunisasi dengan vaksin terbunuh dan baculovirus. Dua
minggu setelah imunisasi terakhir, splenosit dari tikus yang disuntikkan secara intramuskular dengan
PBS, membunuh vaksin, AcHERV-HA, atau AcHERV-VLP dikumpulkan dan dievaluasi untuk jumlah
bintik-bintik IFN-γ yang disekresikan dari sel T spesifik-pH1 pada splenocytes. Uji ELISPOT dilakukan
dengan menggunakan dua sampel yang dipilih secara acak dari masing-masing kelompok (2/12).
Nilai dalam tanda kurung menunjukkan jumlah tikus yang diuji / jumlah tikus yang diimunisasi pada
masing-masing kelompok. Semua percobaan dijalankan dalam rangkap tiga. Data yang ditampilkan
adalah jumlah aktual IFN-γ spot sebagai scatter dot dan mean value sebagai garis. Analisis statistik
menunjukkan bahwa data signifikan dengan uji p <0,05 (uji coba ANOVA dan two-tailed Student-t):
membunuh vaksin dan kelompok HA AcHERV dibandingkan dengan kelompok AcHERV VLP.

Gambar 5. Efek perlindungan imunisasi terhadap tantangan dengan dosis mematikan ma-pH1N1.
Bobot tubuh tikus secara intranasal ditantang dengan dosis 20LD50 ma-pH1N1 2 minggu setelah
imunisasi terakhir dipantau selama 14 hari berturut-turut. (A) Persen berat badan berubah setelah
mendapat tantangan dengan dosis 20LD50 ma-pH1N1. Perubahan berat badan (n = 10 tikus /
kelompok) dinyatakan sebagai nilai rata-rata untuk masing-masing kelompok. (B) Tingkat
kelangsungan hidup setelah mendapat tantangan dengan dosis 20LD50 ma-pH1N1. Analisis statistik
dilakukan antara kelompok AcHERV-HA dan kelompok AcHERV-VLP. Analisis statistik menunjukkan
bahwa data signifikan dengan uji p <0,05 (uji t berpendidikan dua ekor).
TABEL 1

Tikus ditantang secara intranas dengan virus LDL 14.50 setelah 14 hari setelah imunisasi terakhir.
Jaringan paru-paru dipanen 4 hari pasca tantangan, dan titer virus pada homogenat paru ditentukan
seperti yang dijelaskan pada Bagian 2.11.

Data disajikan sebagai sarana ± SD titer sampel. Jumlah tikus yang menumpahkan virus ditunjukkan
dalam tanda kurung (jumlah tikus yang menumpahkan virus / jumlah tikus yang diuji).

Sebelumnya, kami melaporkan khasiat vaksinasi HA dengan menggunakan HERV

vaksin DNA baculoviral encoated (AcHERV-HA) dan menunjukkan bahwa imunogenisitas dan
pengiriman gennya sangat baik [21]. Meskipun demikian, fakta vaksin yang hanya memberi gen HA
tidak dapat diharapkan untuk menghasilkan antibodi penetral spektrum spektrum luas telah
dipertanyakan.

Protein matriks (M) telah diteliti sebagai komponen pembentuk VLP yang penting, terutama bagian
M1 telah dilaporkan yang menginduksi berbagai reaktivitas silang dan dapat menggabungkan
protein HA subtipe atau protein NA yang berbeda, menghasilkan VLP influenza campuran, dan dapat
memberikan perlindungan. terhadap virus influenza dari subtipe yang berbeda [36, 38, 39]. Oleh
karena itu, kami di sini menyelidiki kombinasi kombinasi VLP campuran gen M1 dari strain H5 (A /
chicken / Vietnam / OIE-2215/2012) dengan gen HA dan NA panjang penuh dari strain H1 (A / CA /
04/2009) dan dibuat pembentuk gen, pembentuk gen, HERV encoated-baculovirus (AcHERV-VLP)
yang pada dasarnya membunuh dua burung dengan satu batu.

Setelah, transduksi AcHERV-VLP pada sel mamalia (sel HEK 293T), VLP dimurnikan dan dikonfirmasi
dengan mikroskop elektron transmisi (Gambar 2D). Hasil ini menunjukkan bahwa baculovirus yang
dibangun mampu mengirimkan DNA pembentuk VLP ke sel HEK 293T dan VLP terbentuk langsung di
dalam sel. Dengan demikian, AcHERV-VLP memiliki keuntungan tambahan dalam proses produksi;
karena tidak ada pemurnian VLP tambahan.

Setelah studi imunogenisitas dan khasiat pada tikus, analisis serologis menunjukkan bahwa,
imunisasi AcrelV-VLP menimbulkan kekebalan imunogenisitas lebih kuat daripada AcHERV-HA dalam
respon imun humoral (Gambar 3). Selain itu, di antara sera yang diperoleh dari berbagai tikus yang
diimunisasi, hanya sera dari tikus yang diimunisasi dengan AcHERV-VLP yang menunjukkan
reaktivitas silang terhadap strain PR8 H1N1, yang memiliki homologi 81,6%, 61,5% dan 96,4%
dengan protein HA, NA dan M1 pH1N1, masing-masing (Gambar 3B dan 3C). Umumnya, VLP
memiliki struktur yang identik sebagai virus, dan berfungsi sebagai antigen mimik [24, 26]. Oleh
karena itu, keuntungan dari vaksin VLP telah dijelaskan secara konformasional

cara; terutama menyajikan epitop penetralisir yang lebih optimal daripada HA saja.

Selain itu, AcHERV-VLP mencakup protein M1 sebagai komponen VLP dan publikasi terbaru
menunjukkan bahwa protein M1 mengandung epitop virus influenza A yang sangat dilestarikan yang
menginduksi reaktivitas silang [37, 40]. Jadi, AcHERV-VLP menginduksi respons antibodi yang
ditingkatkan untuk H1 homolog dan H1 heterolog, sedangkan AcHERV-HA tidak bisa.
Khususnya, tidak ada reaktivitas silang yang diamati terhadap virus influenza tipe H3N2, H5N1, atau
B (data tidak ditunjukkan). Kurangnya korelasi antara VLP campuran gen H5 M1 dan aktivitas silang
yang luas mungkin menunjukkan bahwa kombinasi gen M1 dari strain H5 dengan gen HA dan NA
penuh dari strain H1 tidak sesuai untuk menginduksi respon imun humoral spektrum luas di
baculovirus kami. Sistem pengiriman DNA [39, 41]. Oleh karena itu, kami mencari kunci perluasan
spektrum penetral AcrelV-VLP yang disempurnakan adalah dimasukkannya gen imunogenik yang
sangat penting. Sebagai contoh, telah ditunjukkan bahwa penambahan domain ekstraselular protein
matriks 2 (M2e) dan beberapa gen HA lainnya dapat meningkatkan luas antibodi penetralisir [42-45].

Seleksi IFN-ing pada tikus yang diimunisasi menunjukkan bahwa, imunisasi AcHERV-VLP menginduksi
respons imun seluler IFN-yang lebih kuat pada splenocyte dibandingkan dengan imunisasi AcHERV-
HA, yang mengindikasikan bahwa baculovirus pembentuk VLP menghasilkan lebih banyak epitel sel T
dari protein NA dan M1, dan epitop tersebut memicu respons seluler yang lebih kuat daripada HA
hanya dengan merangsang virus flu yang terbunuh secara keseluruhan (Gambar 4.) [38]. Th1 yang
menstimulasi vaksin pembentuk DNA VLP mengandung epitop sel T utama pada komponen
pembentuk VLP. Tidak hanya HA tetapi juga protein influenza NA dan M1 telah melestarikan epitel
CD8 + sel T [46, 47]. Oleh karena itu, VLP membentuk AcHERV-VLP menghadirkan lebih banyak sel
epitop T ke sel kekebalan seluler daripada protein HA yang ditargetkan AcHERV-HA.

Bukti lebih lanjut untuk AcHERV-VLP sebagai vaksin yang efektif diberikan oleh pengamatan bahwa
tikus yang tertantang pulih lebih cepat dari infeksi dan menunjukkan berkurangnya penumpahan
virus di paru-paru (Gambar 5, Gambar 6 dan Tabel 1). Temuan ini memberikan dukungan untuk
gagasan bahwa imunisasi dengan AcHERV-VLP menunjukkan perlindungan yang lebih baik terhadap
virus pandemi influenza H1N1 dengan meningkatkan respons antibodi penetralisir dan mendorong
sekresi IFN-an yang disempurnakan [21].

Selain itu, vektor baculoviral yang mengandung gen struktural influenza pembentuk VLP memiliki
beberapa keuntungan tambahan, termasuk kemudahan manipulasi, kurangnya toksisitas, dan
produksi yang efektif biaya, tidak memerlukan pemurnian protein tambahan atau komponen
lainnya. Kesimpulannya, temuan kami menunjukkan bahwa vaksin AcHERV-VLP yang membentuk
VLP dapat dianggap sebagai kandidat vaksin DNA baru untuk digunakan melawan epidemi virus
influenza baru yang muncul.

Gambar 6. Lesi histologis pada bagian paru-paru dari tikus yang diimunisasi setelah mendapat
tantangan dengan pH1N1. Sebuah subset dari tikus (n = 2 tikus / kelompok) dari masing-masing
kelompok dikorbankan tantangan pasca 4 hari, dan paru-paru mereka diberi H & E untuk evaluasi
histologis. (A) Tikus BABL / c yang tidak terinfeksi; (B) tikus yang disuntik dengan PBS; (C) tikus yang
divaksinasi dengan vaksin terbunuh; (D) tikus yang divaksinasi dengan AcHERV-HA; (E) tikus
divaksinasi dengan AcHERV-VLP. Tanda panah menunjukkan infiltrasi sel inflamasi, termasuk infiltrasi
pada pembuluh darah, parenkim paru, dan septa alveolar. Bilah skala, 100 μm.