“EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS Y CUANTIFICACIÓN DE ADN

PLASMÍDICO DE Escherichia coli TRANSFORMADA, POR MEDIO DEL ENSAYO

DE MINIPREP Y LAS TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS Y
ESPECTROFOTOMETRÍA”
 ÍNDICE GENERAL

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 4

CAPÍTULO II. ANTECEDENTES ................................................................................................. 6
2.1. Medio de cultivo ................................................................................................................ 6
2.2. Cultivo de microorganismos .............................................................................................. 6
2.3. Vectores de clonación ....................................................................................................... 8
2.4. Métodos de clonación de plásmido ................................................................................. 10
2.5. Electroforesis .................................................................................................................. 13
2.6. Absorbancia .................................................................................................................... 14
2.7. Cuantificación de ADN ........................................................................................................ 13
CAPÍTULO III. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 16
CAPÍTULO IV. OBJETIVOS ...................................................................................................... 18
4.1. Objetivo general .............................................................................................................. 18
4.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 18
CAPÍTULO V. MATERIALES Y METODOLOGÍA ...................................................................... 19
5.1. Preparación de medio de cultivo sólido para el aislamiento selectivo de E. coli .............. 19
5.2. Siembra de E. coli transformada en medio LB agar ........................................................ 19
5.3. Preparación de soluciones para ensayo de Miniprep ...................................................... 20
5.4. Siembra de E. coli transformada en medio líquido para su crecimiento........................... 21
5.5. Extracción de ADN plasmídico a partir de cultivo de E. coli............................................ 21
5.6. Separación por electroforesis de ADN plasmídico bacteriano y su cuantificación por
espectrofotometría ................................................................................................................. 22
CAPÍTULO VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 24
6.1. Preparación de medio de cultivo sólido para el aislamiento selectivo de E. coli .............. 24
6.2. Siembra de E. coli transformada en medio LB agar ........................................................ 24
6.3. Preparación de soluciones para ensayo de Miniprep ...................................................... 25
6.4. Siembra de E. coli transformada en medio líquido para su crecimiento........................... 26
6.5. Extracción de ADN plasmídico a partir de cultivo de E. coli............................................ 27
6.6. Separación por electroforesis de ADN plasmídico bacteriano y su cuantificación por
espectrofotometría ................................................................................................................. 27
6.7. Discusión ........................................................................................................................ 32
CAPÍTULO VII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 39
FUENTES BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 40

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ÍNDICE DE ANEXOS ................................................................................................................ 43
ANEXOS ................................................................................................................................... 44
Preparación de medio de cultivo sólido para el aislamiento selectivo de E. coli ..................... 44
Siembra de E. coli transformada en medio LB agar ............................................................... 45
Preparación de medio de cultivo liquido caldo Lauril Sulfato de sodio .................................... 46
Siembra de E. coli transformada en medio líquido para su crecimiento.................................. 47
Extracción de ADN plasmídico a partir de cultivo de E. coli................................................... 47
Separación por electroforesis de ADN plasmídico bacteriano y su cuantificación por
espectrofotometría ................................................................................................................. 49

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 ................................................................................................................................... 25
Tabla 2 ................................................................................................................................... 29
Tabla 3 ................................................................................................................................... 29

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 .................................................................................................................................. 24
Figura 2 .................................................................................................................................. 25
Figura 3 .................................................................................................................................. 26
Figura 4 .................................................................................................................................. 26
Figura 5 .................................................................................................................................. 27
Figura 6 .................................................................................................................................. 28

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 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN

El estudio del ADN ha revolucionado, repercutiendo directamente a la célula, desde el año

1953, cuando Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hélice como estructura del ADN
se han obtenido innumerables avances en el campo de la biología molecular y se han
desarrollado muchas técnicas genéticas sofisticadas, beneficiando diversas áreas como la
ingeniería genética. Para poder estudiar esta molécula con detalle se precisa generalmente su
aislamiento de la célula, para ello es necesario un conjunto de materiales e instrumentos de
laboratorio complejos, proporcionando un acercamiento simple y sencillo a la técnica de
extracción de ADN. La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN
y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. 1

El DNA se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa, en el presente trabajo se empleó

DNA plasmídico. Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y de
pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas. 2

La electroforesis es usado para separar biomoléculas, en dependencia entre otros factores de

su carga y bajo la acción de un campo eléctrico, fue empleado por primera vez por Tiselius en el
año 1937; Raymond y Weintraub en 1959 emplearon como soporte para la electroforesis un gel
de poliacrilamida, el proceso se basa en la migración de las moléculas con carga neta de una
muestra, cuando es sometida a un campo eléctrico, hacia el polo opuesto de su carga. Para
iniciar la técnica, primero hay que saber con qué tipo de moléculas se está trabajando, aunado
a esto se elige el procedimiento y los materiales necesarios, considerando que la electroforesis
permite separar moléculas cargadas eléctricamente, entre las cuales se encuentran los ácidos
nucleicos (DNA y RNA) o las proteínas. 3

Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento mediante

espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de una molécula en
solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas. Una característica
del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentración
mediante espectrofotometría. 4

Mediante las metodologías empleadas se pretende que el alumno comprenda el fundamento

teórico de la técnica y sus aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en gel de
agarosa de DNA plasmídico que el mismo alumno va a aislar y purificar a partir de un cultivo
bacteriano.

4
Para enriquecer las técnicas aplicadas en el laboratorio, se reporta la metodología de extracción
y aislamiento de ADN plasmídico, minipreparación de ADN plasmídico, análisis del ADN en gel
de agarosa, registro y análisis de resultados y cuantificación de ADN por espectrofotometría, de
igual forma se discuten e interpretan los resultados, planteando una conclusión a partir de los
objetivos de la tesis. Todas estas experiencias ponen en práctica los fundamentos y conceptos
básicos expuestos en la materia de Técnicas de Biología Molecular impartida por el Dr. Iván
Estrada Mota en el ITESCAM.

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 CAPÍTULO III. JUSTIFICACIÓN

Es evidente que el Instituto Tecnológico Superior de Calkiní en el Estado de Campeche

(ITESCAM), una de las principales instituciones públicas de educación superior en el Estado,
debe propiciar el desarrollo de áreas prioritarias que le permitan aplicar los conocimientos
científicos en beneficio de la sociedad, como lo es el área de Bioquímica, que a través del
docente se fomenta el desarrollo de grupos de trabajo para el estudio y manipulación de
Técnicas de Biología Molecular.

Entre las acciones que se ha emprendido en relación con la Biología Molecular se destacan la
extracción, aislamiento y purificación de ADN plasmídico para realizar su análisis por medio de
electroforesis en gel de agarosa y su cuantificación por espectrofotometría, considerando que
actualmente se requieren de técnicas de biología molecular para diversas aplicaciones como la
detección de patógenos, de enfermedades, entre otras. Una de las técnicas que resultan ser
indispensables es la electroforesis en gel, ya que se considera como una técnica sencilla
empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente
ADN, ARN y proteínas.

La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras

biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a
individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la
obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser
extraído para análisis posteriores o complementar su estudio con la amplificación mediante
PCR.

La aplicación de técnicas moleculares ha contribuido a la ciencia con datos moleculares, las

cuales han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su
distribución, el comportamiento, la selección natural, las interacciones biológicas, la
composición, funcionamiento y dinámica de comunidades microbianas, entre otros. La
aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la obtención exitosa de
datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y
puro, considerando que uno de los objetivos de la humanidad ha sido el poder analizar y alterar
la composición y expresión de los genes en todo tipo de organismos. 24

El desarrollo exponencial del área de la Biología Molecular ha permitido el avance en todas las
disciplinas de la investigación biológica e inclusive en aquellas donde solamente sea necesaria

6
una pequeña muestra de ADN, pudiendo llegar al entendimiento más profundo de los procesos
estudiados. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de
inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. El desarrollo de las
técnicas han servido para la construcción de moléculas de ADN recombinantes y artificiales
denominados Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones
genéticas por medios bioquímicos, por el cual es necesario tener noción de la replicación del
DNA, la transcripción, la traducción, el metabolismo del DNA para comprender y aplicar temas
complejas. De igual forma es importante estimar la concentración de ácidos nucleicos en una
preparación, en la que será necesario tomar en cuenta los materiales requeridos.

La técnica empleadas en el presente trabajo demuestran la importancia de su aplicación ya que

requieren de una serie de pasos en la cual se hace uso de los conocimientos adquiridos en
áreas como biología molecular, biotecnología, bioquímica, genética, aunado a esto se ven
aplicados su importancia en el estudiante bioquímico, de igual forma se obtiene la práctica y
conocimiento teórico.

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 CAPÍTULO IV. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Extraer, separar fragmentos y cuantificar ADN plasmídico modificado de la bacteria E. coli por
Medio del ensayo de Miniprep y las técnicas correspondientes de electroforesis y
espectrofotometría

4.2. Objetivos específicos

 Preparar medio de cultivo semisólido LB agar en cajas de Petri

 Sembrar E. coli transformada en medio semisólido LB agar
 Preparar medio de cultivo líquido Lauril sulfato de sodio
 Sembrar E. coli transformada en medio líquido Lauril sulfato de sodio
 Extraer ADN plasmídico por ensayo de Miniprep
 Separar y visualizar fragmentos ADN plasmídico por medio de electroforesis
 Cuantificar ADN plasmídico por medio de Espectrofotometría
 Determinar pureza de ADN plasmídico