G. Intrarradices

“Dinámica de la comunidad de Hongos
Formadores de Micorrizas Arbusculares

después de inocular Rhizophagus irregularis
en un sistema agrícola en el trópico”.
Yuli Marcela Ordoñez Castañeda
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias
Instituto de Biotecnología
Bogotá, Colombia
2016
“Dinámica de la comunidad de Hongos
Formadores de Micorrizas Arbusculares
después de inocular Rhizophagus irregularis
en un sistema agrícola en el trópico”.
Yuli Marcela Ordoñez Castañeda
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Doctorado en Biotecnología
Directora:
PhD. Alia Rodriguez Villate
Codirector:
PhD. Ian R. Sanders
Línea de Investigación:
Biotecnología Agrícola
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias
Instituto de Biotecnología
Bogotá, Colombia
2016
V
Agradecimientos
A Alia Rodríguez Villate PhD e Ian R. Sanders PhD, por la dirección del trabajo de tesis,
su apoyo y sus importantes y permanentes aportes a la investigación.
A Colciencias, a la Universidad Nacional de Colombia y a la fundación Suiza para la

ciencia (SCNS) por la financiación de este trabajo.
Al grupo de Ecología y Evolución de Organismos Simbiontes de la Universidad de

Lausanne, Suiza, dirigido por el profesor Ian Sanders, por el suministro de las líneas de
Rhizophagus irregularis, utilizadas como inóculo en este estudio. Tambien por acogerme
en la pasantía de investigación doctoral.
A Frederic Masclaux, Lucas Villard del Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y la

Universidad de Lausanne por su apoyo en el análisis bioinformático y estadístico.
A Tania Wyss y Frederic Masclaux por su apoyo en el diseño de marcadores moleculares

para la identificación de Rhizophagus irregularis locales.
Al Dr. Ewald Sieverding por sus enseñanzas y apoyo en la clasificación taxonómica por
morfología de HFMA.
A los Drs. Maria Isabel Chacón y Juan Carlos Pérez por sus aportes y consejos a través
del comité tutorial.
Al grupo de Biotecnología de Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares, de la

Universidad Nacional, Departamento de Biología - Bogotá, por sus valiosas discusiones
académicas y apoyo en la investigación.
A mi familia, por su apoyo incondicional y permanente.

Resumen y Abstract VII
Resumen
La inoculación con Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA) en sistemas

agrícolas ha sido reportada en términos de productividad. Estos resutlados positivos han
estimulado un uso más frecuente de HFMA como biofertilizante. Sin embargo, no se ha
descrito claramente, si la inoculación con HFMA alóctonos tiene un efecto sobre la
diversidad de la comunidad de HFMA locales. En un primer experimento, un cultivo de
yuca fue inoculado con un inóculo comercial producido en condiciones in-vitro, donde
también se incluyeron tres niveles de fertilización fosfatada. En un segundo
experimento,líneas genéticamente diferentes de Rhizophagus irregularis, el hongo
modelo en el filo Glomeromycota, fueron utilizadas como inóculo para evaluar tambien la
influencia de la información genética del inóculo sobre la estructrura de la comunidad
local de HFMA en dos variedades de yuca. Los dos experimentos fueron realizados en
condiciones de campo. Muestras de raíces fueron tomadas a los 3 y 12 meses después
de la inoculación. Utilizando la morfología de esporas en suelo rizosférico y
secuenciamiento masivo (Illumina MiSeq), se obtuvo una alta cobertura de la comunidad
de HFMA. Se observó que tanto la variedad genética del inóculo, como de la planta
tienen una influencia en la estrucutra de la comunidad de HFMA. La fertilización
fosfatada no generó distubio sobre la comunidad de HFMA y el tiempo de muestreo
tampoco fue un factor determinante en los cambios observados. En este estudio se
encontró que la especie dominante fue Rhizophagus sp, por lo tanto se diseño una
estrategia metodológica para describir la población de Rhizophagus sp en la comunidad
local en muestras ambientales. Los resultados de este trabajo son una aproximación
para entender el efecto de la inoculación de R. irregularis sobre la dinámica de las
comunidades de HFMA en suelos del trópico.
Palabras clave: Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares, Comunidades de
HFMA, diversidad en R. irregularis, MiSeq Illumina, inóculo de HFMA.
Abstract
The positive effect of arbuscular mycorrhizal fungal (AMF) inoculation on cassava plants
has been reported in terms of yield. This is likely to lead to more non-native AMF being
applied. However, it is still unclear whether non-native AMF inoculum has an effect on
local AMF communities in terms of diversity. In a first experiment, a cassava crop was
inoculated with commercial in vitro-produced Rhizophagus irregularis and grown under
three phosphate fertilizer levels. Using spore morphology and Illumina MiSeq sequences
of AMF SSU rDNA from roots and soil, a wide coverage of the AMF community was
achieved. Glomeromycota taxa outside (rhizospheric soil) and inside cassava roots were
described using SSU rDNA region, and it showed complementary information about the
AMF community. P fertilization did not showed effect on AMF communities diversity. In a
second experiment, fifteen genetically different R. irregularis lines were inoculated on two
cassava varieties. Samples were taken 3 and 12 months after inoculation. We showed
that intra-especific diversity of cassava plant and R. irregularis have an effect on AMF
communities. The sampling time was no significant. This study revealed that
Rhizophagus sp. was the dominant genus colonizing cassava roots in the field. Our work
establishes an approach for understanding the effects of inoculation on the local AMF
communities and highlights the need for more research on the potential environmental
effect of AMF.
Keywords: Arbuscular Mycorrhiza Fungi, AMF communities, Rhizophagus irregularis

diversity, MiSeq Illumina, AMF inoculum.
Contenido IX
Contenido
Pág.
1. Marco conceptual 7
2. Describir la estructura de la comunidad de HFMA asociada a plantas de

yuca en la región de estudio. 21
3. Diseñar una estrategia metodológica para evaluar la diversidad

poblacional del hongo Rhizophagus irregularis en simbiosis con plantas de
yuca en campo 69
4. Evaluar el efecto de diferentes líneas de Rhizophagus irregularis

introducidas como inóculo sobre la comunidad de HFMA asociadas a plantas
de yuca en campo. 81
5. Discusión general 125
6. Conclusiones y recomendaciones 127
7. Anexos 130
Bibliografía 228
Contenido X
Lista de figuras
Página
Figura 1. Ruta de trabajo en el análisis bioinformático para el análisis de las librerías

Illumina MiSeq. 38
Figura 2. Abundancia relativa (%) de las morfoespecies de HFMA en suelo rizosférico de
plantas de yuca en campo. 44
Figura 3. Promedio de densidad de esporas para cada tratamiento. El asterisco indica
diferencias significativas con un valor alfa de 0.05. 46
Figura 4. Promedio de la abundancia relativa de cada género de HFMA en el suelo
rizosférico de plantas de yuca en campo, basado en los datos de esporas. Las letras
diferentes indican diferencias significativas con un valor alfa de 0.05. 47
Figura 5. Curva de rarefacción para todas las secuencias SSU rDNA obtenidas en este
estudio por medio de secuenciación Illumina MiSeq® para el filo Glomeromycota. 47
Figura 6. Árbol filogenético de máxima verosimilitud con las secuencias consenso de
OTUs-HFMA presentes en raíces de yuca. La secuencia de un hongo del filo
Ascomycota (Schizosaccharomyces pombe) fue utilizado como grupo externo. 49
Figura 7. Arbol filogenético RAxML-EPA para las secuencias de HFMA obtenidas en este
estudio (SSU rDNA). En negro las secuencias de referencia, en azul las secuencias
provenientes de morfoespecies y en rojo las secuencias provenientes de raíces. Parte
I. Familia Glomeraceae. 50
Figura 8. Estructura de la comunidad intraradical de HFMA en plantas de yuca en la región
de estudio. Solo se incluyen especies con una frecuencia intraradical mayor del 1%. 53
Figura 9. Escalamiento multidimensional no métrico, calculado con el índice de Bray-Curtis
para las comunidades de HFMA, presentes en plantas de yuca, a los 12 meses después
de la siembra, utilizando los datos de OTUs y especies. Grupos que no se sobrelapan
son considerados significativamente diferentes con un valor alfa de 0.05 55
Figura 10. Abundancia relativa de cada especie de HFMA dentro de las raíces de plantas de
yuca. Solo se incluyeron especies con frecuencia promedio mayor al 1%. Los
porcentajes indican la influencia de cada especie sobre la diferencia entre
XI
comunidades de HFMA inoculadas (AMF+) y no inoculadas (AMF-) con una línea

comercial de R. irregularis. 56
Figura 11. Polimorfismo de un solo nucleótido en el aislado del grupo genético #6 (R.
irregularis C2) ubicado en el Scaffold23. 76
Figura 12. Polimorfismo en un solo nucleotido en el grupo genético #6, ubicado en el
Scaffold 1268. 77
Figura 13. Distribución de las especies de HFMA que colonizaron las raíces de las planta de
yuca en campo en el experimento 2. Los datos representan la abundancia relativa
promedio (%) para cada especie en todas las muestras de raíces evaluadas. Valores
menores al 1% no fueron incluidos. 92
Figura 14. Abundancia relativa de cada especie de HFMA dentro de las raíces de las dos
variedades de yuca, incluyendo los datos de 3 y 12 meses después de la siembra. El
asterísco muestra diferencias significativas con un P<0.05. 93
Figura 15. Estructura de la comunidad de HFMA en el suelo rizosférico antes de la siembra
y en raíces de plantas de yuca no inoculadas, a los 3 y 12 meses después de la
siembra. 94
Figura 16. Riqueza de OTUs en las raíces de plantas de yuca en campo, después de
inocular diferentes líneas de Rhizophagus irregularis, en dos variedades de Manihot
esculenta Cranz a los 12 mds. 97
Figura 17. Índice de Shannon para las comunidades de HFMA en dos variedades de yuca,
después de inocular con diferentes líneas de Rhizophagus irregularis (columnas en
gris). Resultados para la comunidad de HFMA en plantas inoculadas con el inoculante
comercial, el filtrado y plantas no inoculadas tambien son comparados (columnas en
color rojo, verde y azul respectivamente). 98
Figura 18. Índice de Pielou calculado para las comunidades de HFMA asociadas a plantas
de yuca, doce meses después de la inoculación con diferentes líneas de Rhizophagus
irregularis. 100
Figura 19. Efecto de la inoculación con Rhizophagus irregularis y de la variedad de yuca
sobre el índice de diversidad NRI - basado en la ocurrencia de OTUs. 101
Figura 20. Efecto de la inoculación con Rhizophagus irregularis y de la variedad de yuca,
sobre el índice de diversidad NRI - basado en la abundancia de OTUs. 102
Figura 21. Escalamiento multidimensional no-metrico (NMDS) para las comunidades de
HFMA asociadas a la variedad MCOL2737, evaluando por grupos genéticos de R.
irregularis inoculados en campo. Imágenes a la izquierda (a, c y e) representan las
comparaciones entre comunidades de HFMA incluyendo plantas no inoculadas (H2O).
Imágenes a la derecha (b, d y f) representan las comparaciones donde no se incluyó el
XII Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
irregularis en un sistema agrícola en el trópico
control (H2O). Figuras a y b para el grupo de líneas parentales, c y d para el grupo C3-
Sc1, e y f para el grupo C3-Sc2. 110
Figura 22. Comparación entre las comunidades de HFMA en plantas de yuca de la variedad
MCOL2737, inoculadas con la línea parental C3 y las líneas de primera y segunda
generación, doce meses después de la inoculación. a) Comparación del efecto entre la
línea C3 y sus segregadas, b) Comparación del efecto entre la línea C3, Sc2 y las
comunidades de plantas no inoculadas (H2O). Las letras indican diferencias
significativas para un valor alfa de 0.05. 111
Figura 23. Escalamiento multidimensional no-métrico (NMDS) para el efecto del Glomygel
sobre las comunidades de HFMA , doce meses después de la inoculación. a) variedad
MCOL2737, b) Variedad CM4574-7, c) Análisis estadístico PERMANOVA. Los valores en
la tabla corresponden al valor P de las pruebas estadísticas donde un valor P>α (α
=0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre tratamientos. 113
Figura 24. Comparación de la abundancia relativa de las especies en la comunidad de
HFMA no inoculada versus las comunidades de HFMA inoculadas con Glomygel y
Filtrado en la variedad MCOL2737, 12mds. 114
Figura 25. Diferencias en las comunidades de HFMA a los 3 y 12 meses después de la
inoculación con algunas líneas de R. irregularis. a) variedad MCOL2737 –Glomygel,
b)MCOL2737 – Sc2, c) CM4574-7 – Sc2c, d)CM4574-7 – Glomygel. Barras blancas y
negras representan la proporción de cada especie a los 3 meses y 12 meses después
de la inoculación. 118
Contenido XIII
Lista de tablas

Página
Tabla 1. Asignación taxonómica de morfotipos por sus características morfológicas y por el
análisis filogenético RaxML-EPA 43
Tabla 2. Análisis estadístico para los datos de diversidad de HFMA en el suelo rizosférico, basado
en el recuento de esporas de HFMA. Diferencias significativas para valores P<0.05. 46
Tabla 3. Efecto de los tratamientos sobre las comunidades de HFMA en plantas de Manihot
esculenta Cranz bajo condiciones de campo. En la tabla se muestran los resultados del valor
P para los índices de diversidad alfa calculados. 55
Tabla 4. Líneas de Rhizophagus irregularis con genoma secuenciado organizadas por grupos
genéticos. Se indica el número de réplicas utilizadas en el secuenciamiento RAD-seq y
utilizadas para calcular el polimorfismo entre grupos. *ND= no determinado 73
Tabla 5. SNPs identificados para cada grupo genético 75
Tabla 6. Cebadores seleccionados para amplificar R. irregularis del grupo genético #6 en
muestras de raíces de yuca. Los cebadores llevan la misma nomenclatura de la región
genómica donde fueron ubicados. Ta-calc: Ta calculada. Ta-grad: Ta por gradiente de
temperatura. 76
Tabla 7. Tratamientos en el experimento #2. Tres factores fueron incluidos: tiempos de muestreo
(3 y 12 mds), variedades de planta y la inoculación con diferentes líneas de Rhizophagus
irregularis. El número dentro de cada casilla corresponde al número del tratamiento. 87
Tabla 8. Análisis estadístico para los índices de diversidad alfa, en la comunidad de HFMA
asociadas a dos variedades de yuca (MCOL2737 y CM4574-7) a los 12 meses después de la
siembra. 99
Tabla 9. Grupos de aislados de Rhizophagus irregularis según su origen, de acuerdo con la
información suministrada por el grupo de Ecología y Evolución de Organismos simbiontes
de la Universidad de Lausanne, Suiza (Comunicación personal, datos no publicados).103
Tabla 10. Análisis estadístico para el índice de Shannon agrupando tratamientos de acuerdo a la
informacíon de grupos genéticos de Rhizophagus irregularis, en las dos variedades de yuca.
XIV Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
Los valores en la tabla corresponden al valor P de las pruebas estadísticas donde un valor
mayor al valor alfa (0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre tratamientos104
Tabla 11. Análisis multivariado (PERMANOVA) para medir el efecto de la variedad de la planta y
las líneas de R. irregularis inoculadas sobre las comunidades de HFMA que colonizan las
plantas de yuca, 12 meses despues de la inoculación. El asterisco muestra las diferencias
significativas (* para un α=0.01, ** para un α=0.05). 105
Tabla 12. Análisis multivariado PERMANOVA, para evaluar diferencias entre tratamientos para
cada una de las variedades de yuca. El asterisco muestra las diferencias significativas (* para
un α=0.05). 106
Tabla 13. Comparaciones uno a uno, entre comunidades de HFMA inoculadas con diferentes
líneas de Rhizophagus irregularis versus las comunidades de HFMA no inoculadas en la
variedad MCOL2737, doce meses después de la inoculación. 107
Tabla 14. Resultados del análisis PERMANOVA agrupando tratamientos por grupos genéticos,
para las comunidades de HFMA en plantas de yuca a los doce meses después de la
inoculación. Los valores en la tabla corresponden al valor P de la prueba estadística
PERMANOVA, donde un valor P >α (α =0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre
tratamientos. 109
Tabla 15. Comparación de Pearson para las variables: peso seco de la planta, porcentaje de
colonización intraradical, Riqueza de OTUs e índice de Shannon para las dos variedades de
yuca. 116
Tabla 16. Cambios en la comunidad de HFMA en el tiempo después de la inoculación con líneas
de R. irregularis. 117
XV
Lista de anexos
Anexo 1. Análisis físico-químico de los suelo del experimento No. 1 antes de la siembra. 130
Anexo 2. Diseño experimental, experimento 1. 131
Anexo 3. Proceso metodológico para el análisis filogenético. Todos los árboles se procesaron
calculando 1000 bootstrap y con el modelo de sustitución GAMMAGTR. 132
Anexo 4. Figura del árbol filogenético RAxML básico para las secuencias de HFMA blanco
utilizando las secuencias de referencia. 133
Anexo 5. Arbol filogenetico de referencia (blackbone) para el análisis EPA en HFMA. Construido
con secuencias de referencia de la región larga SSU-ITS-LSU rDNA. 135
Anexo 6. Arbol filogenético RaxML-EPA para las secuencias de HFMA utilizando la región SSU
rDNA obtenidas en este estudio. En negro las secuencias de referencia, en azul las
secuencias provenientes de morfoespecies y en rojo las secuencias provenientes de raíces.
Los números sobre las ramas representan los valores bootstrap calculados en el árbol de
referencia. Los números en parentesis corresponde al número de morfotipos identificados
para la especie. 137
Anexo 7. Esquema representativo de la región SSU rDNA en el filo Glomeromycota. Las fechas
representan los sitios de unión de los cebadores utilizados en el análisis de la diversidad de
HFMA (Van Geel et al., 2014). La tabla contiene las secuencias de los cebadores utilizados en
este estudio. 140
Anexo 8. Lista de secuencias cortas (barcodes) adicionadas al extremo 5' del cebador NS31, para
la construcción de las librerías de ADN. 141
Anexo 9. Estandarización del algoritmo DBC454 para los datos de este estudio. 142
Anexo 10. Análisis estadístico para diversidad alfa de la comunidad de HFMA en el suelo
rizosférico, basado en la información de esporas. 143
Anexo 11. Diferencias estadísticas entre especies de HFMA en el suelo rizosférico de plantas de
yuca en campo, basado en los datos de esporas. Las letras diferentes indican diferencias
significativas con un α=0.05. 144
XVI Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
Anexo 12. Análisis estadístico PERMANOVA para las comunidades de HFMA inoculadas con
Glomygel ®, experimento 1. 146
Anexo 13. Análisis SIMPER para evaluar las especies que influyen en los cambios de las
comunidades inoculadas. Experimento 1. 147
Anexo 14. Selección de cebadores para la amplificación de regiones con polimorfismos (SNPs) en
cada grupo genético de R. irregularis. 148
Anexo 15. Alineamiento de secuencias amplificadas con los cebadores Scaffold1268 para el
grupo genético #6 de Rhizophagus irregularis. 160
Anexo 16. Diagrama para la obtención de líneas de R. irregularis de primera y segunda generación
en cultivo in-vitro. Imagen modificada de (Koch, 2006). 161
Anexo 17. Análisis fisico-químico para el suelo del experimento 2. 163
Anexo 18. Esquema de la distribución de los tratamientos en campo. 164
Anexo 19. Análisis estadístico para evaluar las diferencias entre las comunidades de HFMA
intraradicales en las dos variedades de yuca sin inocular (Tratamiento control-H2O).166
Anexo 20. Comparaciones entre la comunidad de HFMA presente en suelo rizosférico antes de la
siembra y en las raíces de plantas de yuca sin inocular a los 3 y 12 meses después de la
inoculación, para las dos variedades de yuca. 168
Anexo 21. Análisis multivariado para medir el efecto de la variedad y la inoculación con R.
irregularis sobre las comunidades de HFMA a los 12 meses después de la inoculación.172
Anexo 22. Diferencias en las comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis para cada una
de las variedades de yuca. 174
Anexo 23. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis
versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad MCOL2737. 176
Anexo 24. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis
versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad CM4574-7. 188
Anexo 25. Análisis de varianza multivariado con permutaciones usando matrices de distancia
(ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con diferentes grupos genéticos de
aislados de R. irregularis. Evaluadas a los 12 meses después de la inoculación, para la
variedad MCOL2737 202
Anexo 26. Análisis de varianza multivariado (ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con
diferentes grupos de aislados de Rhizophaugus irregularis, en la variedad MCOL2737
incluyendo el control (plantas no inoculadas). 207
Anexo 27. Análisis de varianza multivariado con permutaciones usando matrices de distancia
(ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con diferentes grupos genéticos de
XVII
aislados de R. irregularis. Evaluadas a los 12 meses después de la inoculación, para la

variedad CM4574-7 207
Anexo 28. Comparación entre las comunidades de HFMA inoculadas con la línea parental C3, la
línea de primera generación Sc2 y sus segregadas (Líneas de segunda generación), para la
variedad MCOL2737 a los 12 mdi. 212
Anexo 29. Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con GLOMYGEL y
FILTRADO versus las comunidades de HFMA no inoculadas (H2O) para las dos variedades
de yuca MCOL2737 y CM4574 215
Anexo 30. Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con FILTRADO y la
comunidad de HFMA en plantas no inoculadas, solo para la variedad MCOL2737, a los 12
mdi. 219
Anexo 31. Comparación entre las comunidades HFMA inoculadas con Filtrado y Glomygel y las
comunidades HFMA no inoculadas a los 12 mdi, para la variedad de yuca MCOL2737.221
Anexo 32. Datos de biomasa de la planta de yuca inoculada con las líneas de R. irregularis.
Análisis estadístico. 222
Introducción
Ciertos grupos de microorganismos edáficos han sido objeto de estudio, debido a que
participan en los ciclos biogeoquímicos, movilizan nutrientes y consecuentemente
favorecen la nutrición y salud de las plantas terrestres (Bloem et al., 2005). El uso de
estos microorganismos como inóculo, se ha convertido en una alternativa para
incrementar la biomasa vegetal y por lo tanto mejorar la productividad de los cultivos
agrícolas en suelos con deficiencias nutricionales (Faye et al., 2013).
En los suelos del trópico, una tercera parte ha sido clasificada como suelos ácidos con
pH menor a 4.5. Esta condición de acidez, sumada a la alta pluviosidad y la consecuente
lixiviación de cationes como Ca+2, K+ y Na+, aumentan las concentraciones de aluminio
soluble (tóxico) y disminuyen la concentración de nutrientes disponibles para la planta
(especialmente fósforo), lo cual limita la productividad de los cultivos (Koyama et al.,
1995).
En Colombia, la región denominada Llanos Orientales (26 millones de Ha) presenta

suelos Oxisoles y Ultisoles con estas características (Amézquita et al., 2003; Molina et
al., 2003; Camacho-Tamayo et al., 2010). Se ha descrito cómo la baja disponibilidad de
fósforo es uno de los principales factores relacionados con la baja productividad de la
región (Cadavid, 2002). Por ejemplo, el cultivo de yuca, con una exigencia de 10 ppm,
solo tiene disponibles <3.0 ppm de fósforo aprovechable en la solución del suelo
(Cadavid, 1980), lo cual resulta en la producción de aproximadamente 10 ton Ha-1
comparado con más de 15 ton Ha-1 producidas en Camerún, Tailandia o India
(FAOSTAT, 2010).
2 Introducción
En los suelos ácidos del trópico, los microorganismos movilizadores de fosfato como los
Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA), se convierten en una
alternativa biotecnológica para el sector agrícola. Estos hongos, que conforman el filo
Glomeromycota (Schüβler et al., 2001), desarrollan una red de micelio en el suelo que se
extiende más allá de la zona de depleción formada alrededor de las raíces, donde los
nutrientes poco móviles como el fósforo son rápidamente agotados. Este micelio absorbe
los fosfatos solubles en la solución del suelo, y luego son transportados y entregados a la
planta con la cual el hongo establece una simbiosis benéfica para ambos organismos
(Smith & Read, 2008).
Los HFMA son habitantes naturales del suelo y ubicuos en la mayoría de los biomas
terrestres (Brundrett, 1991; Öpik et al., 2006), establecen simbiosis con el 80% de las
plantas (~ 250.000), incluyendo la mayoría de las plantas de interés agronómico (Smith
& Read, 2008). En los sistemas agrícolas, la inoculación con especies previamente
seleccionadas de HFMA, debe realizarse cuando se buscan incrementos nutricionales en
las plantas hospederas y por lo tanto un efecto positivo en el sistema agrícola.
En la región de los Llanos Orientales, la yuca (Manihot esculenta Crantz). se ha escogido

como una planta modelo en el estudio de la simbiosis micorrícica, por diferentes razones:
es altamente dependiente de la micorrización (incrementa su biomasa cuando se
encuentra asociada a HFMA) (Howeler & Sieverding, 1982; Cadavid, 2011); es originaria
de América del Sur, por lo tanto es una planta adaptada a las condiciones
edafoclimáticas características de los suelos ácidos del trópico (Howeler et al., 1987;
Janos, 1987; Allem, 1994) y es el cuarto producto agrícola más importante en
Latinoamérica, después del arroz, trigo y maíz por lo tanto es considerada una de las
principales alternativas para la seguridad alimentaria en la región (Ceballos, 2002;
Hershey et al., 2004; FAO, 2008).
Introducción 3
Se ha observado el efecto positivo de la inoculación con HFMA sobre la productividad del

cultivo de yuca (Menge, 1983; Sieverding, 1989, 1991; Ceballos et al., 2013) y se ha
demostrado que la asociación micorrícica arbuscular (planta-HFMA) es necesaria para
que la planta logre aprovechar el fósforo suministrado por medio de la fertilización
química (Sieverding & Howeler, 1985). Sin embargo, existen algunos aspectos que no se
han elucidado en el uso de los HFMA como inóculo, como por ejemplo determinar si la
inoculación con un hongo micorrícico-arbuscular tiene un efecto sobre la estructura de las
comunidades locales de HFMA y si la variabilidad genética del hongo inoculado tiene
influencia sobre el disturbio de las comunidades HFMA después de la inoculación .
Para entender cada uno de estos aspectos, se debe conocer en detalle la biología de la
asociacion, la genética de estos hongos y el comportamiento de las comunidades de
HFMA.
En el estudio de las comunidades de HFMA, se ha descrito su diversidad en diferentes

condiciones, estableciendo la abundancia y riqueza a partir del análisis de esporas en la
rizósfera (Jansa et al., 2002; Mathimaran et al., 2005), así como la identidad de especies
colonizando raíces de plantas en sistemas naturales (Helgason et al., 2002; Opik et al.,
2006) y en sistemas agrícolas (Kjøller & Rosendahl, 2001; Porras-Alfaro et al., 2007).
Consecuentemente, se han evaluado diferentes teorías ecológicas que intentan explicar

cómo los factores ambientales y la interacción entre las especies determinan el
ensamblaje de las comunidades de HFMA. Dumbrell y cols (2011), demostraron que
tanto la teoría del nicho (Jongman et al., 1995), como la teoría neutral (Hubbell, 2005)
estructuran las comunidades de HFMA. Entonces, aunque el ensamblaje de las especies
del filo Glomeromycota muestra un proceso estocástico, los factores abióticos como el
pH del suelo también son importantes en términos de comunidades.
4 Introducción
Además, se ha planteado que la distribución de las especies de HFMA está influenciada

por procesos de adaptación a ciertos hábitats, por ejemplo especies más tolerantes a la
alta disponibilidad de nutrientes (Porras-Alfaro et al., 2007), al pH y tipo de suelo
(Lekberg et al., 2007; Oehl et al., 2010) y al disturbio (Schnoor et al., 2011).
El disturbio, definido como la suma de todas las perturbaciones por unidad de tiempo
(Miller, 1982), se ha considerado como uno de los factores que más influye sobre la
composición de las comunidades terrestres (Sousa, 1984; Molino & Sabatier, 2001).
En comunidades de HFMA, algunos estudios han evaluado el efecto del disturbio en

sistemas agrícolas (Jansa et al., 2002, 2003; Rosendahl & Matzen, 2008; Brito et al.,
2012b; Ipsilantis et al., 2012; Zhang et al., 2012) y también en praderas no disturbadas
(Husband et al., 2002; Sýkorová et al., 2007; Fitzsimons et al., 2008), encontrando que el
disturbio genera un cambio en la sucesión ecológica de las comunidades de HFMA.
Respecto al disturbio biológico, la inoculación con HFMA podría incrementar la

competencia por hospedero entre hongos del filo Glomeromycota, donde la planta es la
única fuente de carbono. De esta forma, algunos cambios en la riqueza y abundancia de
las especies podrían tomar lugar. Pocos estudios han observado resilencia de la
comunidad de HFMA después de la inoculación, donde no se observan cambios en la
composición pero si en la abundancia de las especies (Antunes et al., 2009; Lekberg et
al., 2012). Entonces, la interacción entre las especies de HFMA puede resultar en la
coexistencia, como consecuencia de la complementariedad fisiológica (Hubbell, 2005), o
también en procesos de exclusión competitiva debido a la competencia por nicho
ecológico (Gause, 1935).
Se ha planteado la posibilidad, de que el hongo inoculado no tenga la capacidad de

competir con los HFMA locales adaptados a las condiciones ambientales específicas
(Pattinson et al., 1997; Ortas et al., 2011; Ipsilantis et al., 2012). Sin embargo,
Introducción 5
recientemente se observó la persistencia de dos cepas de Funneliformis mosseae

inoculadas en plántulas de Medicago sativa en campo, dos años después de la
inoculación (Pellegrino et al., 2012).
Se ha propuesto que la capacidad de adaptación y competencia de los HFMA puede

estar relacionada con su información genética. Es así que se ha observado cómo
algunas familias del filo Glomeromycota tienen comportamientos específicos en procesos
de sucesión ecológica, que estarían relacionados con la respuesta de estos hongos al
disturbio (Hart & Reader, 2002; Maherali & Klironomos, 2007; Powell et al., 2009). Por
ejemplo, especies de la familia Glomeraceae han sido clasificados como estrategas r,
muestran una mayor tolerancia a la perturbación, debido a su comportamiento
oportunista y a la rápida tasa de crecimiento del micelio (Helgason et al., 1998; Ijdo et al.,
2010; Sýkorová et al., 2012).
El hongo modelo Rhizophagus irregularis, pertenece a la familia Glomeraceae y ha sido

clasificado como un estratega r, por el crecimiento rápido y profuso de su micelio
(Maherali & Klironomos, 2007). Además, R. irregularis es un hongo ubicuo en los biomas
terrestres (Öpik et al., 2006), es una de las pocas especies cultivables en el sistema in
vitro (Declerck et al., 2005), y posee una alta variabilidad genética intra-específica (Koch
et al., 2004; Croll et al., 2008b), descrita también para otras especies de este filo
(Sanders et al., 1995a; Clapp et al., 1999, 2001; Kuhn et al., 2001; Rodriguez et al., 2004;
Corradi et al., 2007).
Diferentes estudios realizados sobre líneas de R. irregularis aisladas de suelos de

Tanikon, Suiza, han revelado que la variabilidad genética tiene influencia directa sobre el
fenotipo in vitro (producción de esporas y micelio) (Koch et al., 2004; Ehinger et al.,
2009), y sobre el efecto de la simbiosis evaluada en condiciones de invernadero,
utilizando plántulas de Oryza sativa y Plantago lanceolata (Angelard & Sanders, 2011). El
siguiente paso en el estudio de estas líneas, corresponde a elucidar si la genética del
6 Introducción
hongo esta relacionada con cambios en la comunidad local de HFMA después de la

inoculación.
Sin embargo, debido a que no se posee la suficiente información para predecir cuál será
el comportamiento de la comunidad local de HFMA después de la inoculación, en este
estudio se planteó una hipótesis nula y una alterna. Por lo tanto:
• Hipótesis nula: La inoculación de una línea alóctona de Hongos Formadores de

Micorrizas Arbusculares (HFMA), no altera la diversidad ni la estructura de la comunidad
HFMA asociada a plantas de interés agronómico.
• Hipótesis alterna: La inoculación de una línea alóctona de Hongos Formadores de

Micorrizas Arbusculares (HFMA), altera la diversidad y la estructura de la comunidad
local de HFMA asociada a plantas de interés agronómico, lo cual está relacionado con la
genética del hongo inoculado.
En este estudio se utilizaron líneas genéticamente diferentes de Rhizophagus irregularis

como inóculo, con el objetivo evaluar los cambios cualitativos y cuantitativos que podría
generar la inoculación de una población de R. irregularis en la comunidad de HFMA
locales (hongos presentes en el suelo de forma natural), e identificar los cambios que
ocurren en la comunidad de HFMA asociada a plantas de Manihot esculenta Cranz en un
ciclo de cultivo en suelos ácidos del trópico. También se planteó una estrategia
metodológica para describir la población local de Rhizophagus sp, la especie más
abundante en los suelos analizados.
1. Marco conceptual
1.1 Biología y genética de los HFMA
Los Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA), son biótrofos obligados,

por lo que solo pueden completar su ciclo de vida en presencia de la planta hospedera.
Establecen la simbiosis micorrícico-arbuscular, con el 80% de las especies de plantas
terrestres (~250.000), incluyendo la mayoría de las plantas de interés agronómico (Smith
& Read, 2008).
Durante el establecimiento de la simbiosis micorrícica, el hongo coloniza la corteza de la

raíz y luego desarrolla un extenso micelio externo que simula un sistema radical
complementario. Este micelio extra-radical es el encargado de absorber del suelo
nutrientes, principalmente fósforo, nitrógeno y otros microelementos como el zinc, que
son transportados hacia la planta hospedera (Kiers et al., 2011; Fellbaum et al., 2012).
En la raíz, el hongo desarrolla un micelio conformado por arbúsculos, hifas y vesículas de

almacenamiento de lípidos (Smith & Read, 2008). Los arbúsculos son estructuras que se
desarrollan por la bifurcación de la hifa, que penetra la pared pero no la membrana
celular de las células corticales. En la célula vegetal se produce una membrana peri-
arbuscular que incrementa en cuatro veces la superficie de contacto entre los dos
organismos (Krajinski & Frenzel, 2007), además presenta una mayor cantidad de
proteínas transportadoras de membrana involucradas en la transferencia de fosfatos
comparado con la membrana celular de la célula vegetal (Harrison, 2005; Karandashov &
Bucher, 2005; Javot et al., 2007; Krajinski et al., 2014). Se ha demostrado que el
arbúsculo es el sitio donde ocurre el intercambio de nutrientes (Hause & Fester, 2005); el
8 Dinámica de la comunidad de HFMA después de inocular Rhizophagus
hongo entrega los minerales absorbidos del suelo y a cambio recibe entre el 4 y el 20%
del carbono fijado a través de la fotosíntesis (Read et al., 1998).
Los HFMA producen esporas de origen asexual, caracterizadas por contener un gran
número de glóbulos lipídicos y de núcleos. La presencia de esporas multinucleadas es
una particularidad de los HFMA, donde a la fecha, no es claro si los diferentes núcleos
son portadores de la misma información genética (homocariosis), o si contienen
información genética diferente (heterocariosis) (Pawlowska & Taylor, 2004; Rodriguez et
al., 2004; Hijri & Sanders, 2005; Wyss et al., 2016).
Respecto a la variabilidad genética, algunos estudios han analizado los genes

ribosomales (rDNA) (Sanders et al., 1995b; Clapp et al., 1999, 2001; Rodriguez et al.,
2004) y genes que codifican para β-tubulina y ATPasas (Kuhn et al., 2001; Corradi et al.,
2004a,b, 2007) mostrando un alto polimorfismo entre y dentro de las especies de HFMA.
En diferentes líneas de Rhizophagus irregularis aisladas de suelos de Tanikon, Suiza, se

ha identificado una alta diversidad genética intraespecífica (Koch et al., 2004; Börstler et
al., 2008, 2010; Croll et al., 2008b; Stockinger et al., 2009), diferencias fenotípicas en
condiciones in vitro -producción de esporas y micelio- (Koch et al., 2004; Ehinger et al.,
2009) y diferencias funcionales (Koch et al., 2006; Croll et al., 2008a).
La variabilidad genética en el hongo modelo R. irregularis se ha explicado básicamente

por la segregación de nucleos, donde la espora madre puede producir nuevas esporas
que contienen núcleos con información genética diferente (nucleotipos) (Angelard et al.,
2010; Sanders & Croll, 2010).
Capítulo 1 9
Diferentes líneas de Rhizophagus irregularis se han producido in vitro, como resultado de

estos dos procesos, nombrando líneas parentales a las aisladas del suelo, lineas de
primera generacion de “unica espora” a las lineas obtenidas del mantenimiento de las
lineas en condiciones in vitro provenientes de una unica espora y líneas segunda
generacion de “unica espora”, como su nombre lo indica, resultantes de la segregación
de las líneas de primera generacion de “unica espora”. Estas nuevas líneas también
presentan diferencias genéticas, fenotípicas y funcionales in vitro y bajo invernadero
comparadas con las líneas parentales (Croll & Sanders, 2009; Angelard et al., 2010).
Las diferencias genotípicas y fenotípicas intra-específicas demostradas en las líneas de

R. irregularis, tienen fuertes implicaciones respecto al uso de HFMA como inóculo en la
agricultura. El siguiente paso en el estudio de estas líneas es evaluar cómo la variabilidad
intra-específica está relacionada con el crecimiento y desarrollo de las líneas en el
ambiente suelo y por lo tanto, cómo puede influir en sus capacidades de competencia
con otros HFMA.
Si esto fuera cierto, se abre la posibilidad de manipular esta variación genética en los
HFMA, para desarrollar nuevas líneas que sean capaces de colonizar eficientemente la
rizósfera de las plantas de interés y con un óptimo efecto en la respuesta fisiológica de la
planta hospedera (Sanders, 2010).
1.2 Taxonomía de los HFMA
Inicialmente, la identificación de los HFMA estuvo basada en la morfología, el proceso de

formación y la estructura de la pared de la espora. Las estructuras intraradicales del
hongo, como los arbúsculos y las vesículas, son consideradas irrelevantes
taxonómicamente (Walker & Sanders, 1986; Morton & Benny, 1990; Schemck & Perez,
1990). Los HFMA, aunque son simbiontes obligados y no forman zigosporas, fueron
clasificados inicialmente en el orden Glomales, dentro del filo Zygomycetes (Morton &
Benny, 1990).
En los años 90’s las herramientas moleculares para el análisis taxonómico comenzaron a
estar disponibles y ayudaron en el establecimiento de una nueva taxonomía. En
particular el análisis de secuencias de la subunidad pequeña del gen ribosomal, 18S
rDNA, ha permitido ubicar a los HFMA en una nueva clasificación: el filo Glomeromycota
(Morton & Redecker, 2001; Schüβler et al., 2001).
A la fecha se aceptan tres clases (Archaeosporomycetes, Glomeromycetes y

Paraglomeromycetes), cinco órdenes (Archaeosporales, Diversisporales, Gigasporales,
Glomerales y Paraglomerales), 14 familias, 29 géneros y 230 especies (Morton &
Redecker, 2001; Schüβler et al., 2001; Oehl & Sieverding, 2004; Sieverding & Oehl,
2006; Spain et al., 2006; Oehl et al., 2011a,b,c; Krüger et al., 2012).
El uso de las herramientas moleculares permitió identificar la diversidad en los HFMA que
había sido subestimada por análisis morfológicos, es así como el género Glomus sp., fue
escindido en tres grupos: Glomus A, B y C (Schwarzott et al., 2001). Los dos primeros
grupos están englobados en el orden Glomerales, mientras que Glomus C pertenece a
los Diversisporales (Schüβler et al., 2001).
Los grupos de Glomus A y B se caracterizan por una formación de esporas en el extremo

de la hifa. Los hongos Glomus del grupo A son los más dominantes y diversos en la
mayoría de los suelos (Öpik et al., 2006). A este grupo pertenece la especie Glomus
intraradices, actualmente llamada Rhizophagus irregularis (Krüger et al., 2012), descrita
como la especie modelo de este filo y utilizada en este estudio. En el grupo B se
encuentran muchas especies que también han sido estudiadas como: G. etunicatum, G.
claroideum y G. lamellosum (Rodriguez et al., 2005). Los hongos Glomus del grupo C,
Capítulo 1 11
con base en la filogenia de los genes ribosomales (rDNA), están más estrechamente
relacionados a la familia Acaulosporaceae (Schwarzott et al., 2001). Un representante de
este grupo es Glomus fulvum que se caracteriza por formar grandes esporocarpos
(Redecker et al., 2007).
Basados en estudios de rDNA (Morton & Redecker, 2001) y en el hallazgo de ácidos

grasos que no han sido encontrados en otros Glomeromycota (Graham et al., 1995), las
familias Archaeosporaceae y Paraglomeraceae se han descrito como las familias basales
en este filo. Se caracterizan porque sus estructuras intraradicales se tiñen ligeramente y
no forman vesículas. Algunos miembros de Archaeosporaceae forman esporas
dimórficas similares a Acaulospora sp. con un sáculo esporífero formado al final de una
hifa (Spain et al., 2006).
1.3 Comunidades de HFMA
Una comunidad de HFMA se define como el ensamblaje de diferentes especies de HFMA

que comparten tiempo y espacio (asociadas a una o más plantas en la naturaleza).
Adoptando definiciones de la macro-ecología (Gee & Giller, 1987), el ensamblaje de
especies se puede definir como el conjunto de especies que comparten un lugar,
teniendo en cuenta que estas especies interactúan, y su presencia en un nicho estará
relacionada con la capacidad de competencia y la habilidad de dispersión de cada
especie. Diferentes parámetros medibles han sido utilizados para evaluar el
comportamiento de las comunidades en el tiempo y con el objetivo de comparar
comunidades presentes bajo diferentes tratamientos. Estos parámetros o atributos se
describen más adelante, cuando se habla de diversidad.
Metodologías en el estudio de comunidades de HFMA
Inicialmente, las comunidades de HFMA se evaluaron realizando la cuantificación de las

esporas aisladas de la rizósfera de plantas, con la consecuente selección de morfotipos
(grupos de esporas según tamaño, forma y color). Esporas de cada morfotipo se colocan
en una lámina portaobjetos usando PVLG (Polyvinyl alcohol-lacto-glycerol) y reactivo de
Melzer (Koske & Tessier, 1983; Morton et al., 1993) para observar bajo el microscopio
(1000x) y describir las características morfológicas tomando como referente el manual de
Schenck & Perez (Schemck & Perez, 1990), las descripciones del INVAM (the
International Culture Collection of VA Mycorrhizal Fungi, http://invam.caf.wvu.edu).
Las esporas presentes en la rizósfera aportan información sobre las especies que están
conformando la comunidad de HFMA (Robinson-Boyer et al., 2009). Pero se debe tener
en cuenta que las esporas son estructuras de resistencia que pueden no representar las
especies fisiológicamente activas, es decir aquellas que están estableciendo una
simbiosis con la planta (Clapp et al., 1995; Renker et al., 2005). Es por esto que la
extracción e identificación de esporas se ha considerado un análisis indirecto de la
comunidad de HFMA (Robinson-Boyer et al., 2009).
De forma complementaria, se planteó un estudio directo, identificando los hongos del filo
Glomeromycota que están colonizando las raíces de las plantas. Para identificar estos
hongos, es necesario el uso de herramientas moleculares como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), donde los productos obtenidos de la PCR son clonados y
secuenciados. Posteriormente, se realiza el análisis de los clones con el objetivo de
cuantificar e identificar las especies de HFMA que están colonizando un fragmento de
raíz. Para la evaluación de los clones, diferentes técnicas han sido empleadas:
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción -RFLP- (Helgason et al., 1998;
Mummey & Rillig, 2006; Lekberg et al., 2007), polimosfismo de conformación de cadena
simple –SSCP- (Kjøller & Rosendahl, 2000), electroforesis de gel con gradiente de
denaturación –DGGE- (de Souza et al., 2004) y secuenciación (Lekberg et al., 2012).
Capítulo 1 13
La región del genoma que más se ha utilizado para la identificación molecular y la

clasificación filogenética del filo Glomeromycota ha sido el ADN ribosomal (rDNA). Esta
región es un buen marcador molecular porque está presente en múltiples copias y
contiene secciones altamente conservadas codificantes (SSU: small subunit 18S, LSU:
Large Subunit 28S), útiles en la clasificación de familias y géneros. También contiene
regiones variables que han evolucionado más rápido que las regiones conservadas, no
codificantes (ITS: Internal Transcribed Spacers) y que han sido útiles para la
diferenciación entre especies estrechamente relacionadas y entre individuos (líneas) de
la misma especie (Gorzelak et al., 2012). Ademas se reconoce una alta congruencia, a
nivel de familia y genero, entre esta informacion y la obtenida utilizando caracteres
morfologicos (Oehl et al., 2011a).
Estudios sobre las comunidades HFMA en campo fueron iniciados por Clapp y cols,
(1995) y continuados por Helgason y cols (1998; 1999; 2002), donde compararon la
diversidad en la secuencia de la subunidad pequeña de la región ribosomal rRNA de
HFMA, aislados desde un suelo arado en Yorkshire, UK. En el año 2006, Öpik y cols.,
(Öpik et al., 2006), publicaron un análisis compilado de diferentes estudios de diversidad
en HFMA realizados en diferentes ambientes, encontrando que el bosque tropical, con 18
taxones, es el hábitat con mayor número de taxones por planta hospedera.
Diferentes grupos de investigación han diseñado cebadores específicos para HFMA,

marcando diferentes regiones del 18S. El primer cebador diseñado fue el VANS1 para el
extremo 5’ de la región SSU (Simon et al., 1992), sin embargo no amplifica todos los
linajes de los Glomeromycota (Clapp et al., 1995). Este extremo de la región 18S no es lo
suficientemente variable para distinguir taxones y se ha evidenciado problemas de
amplificación cuando son usados sobre muestras de raíces de experimentos en campo
(Clapp et al., 1999). Helgason y colaboradores (1998), diseñaron el cebador AM1, el cual
es usado en combinación con el cebador universal para eucariotas, NS31. Esta
combinación de cebadores amplifica la región central de la SSU y han sido utilizados en
estudios ecológicos (Öpik et al., 2006; Öpik et al., 2008). Sin embargo, tampoco amplifica
para las familias Archaeosporaceae y Paraglomeraceae, y tampoco para Glomus del
grupo B.
Otra pareja de cebadores (AML1-AML2) ha sido diseñada sobre la región SSU rDNA
donde las familias Ambisporaceae y Paraglomaceae, si logran ser amplificadas, porque
la región blanco incluye la región central más variable de este gen, lo que permite una
mayor resolución en el análisis de datos. Además el fragmento generado incluye la
región amplificada con los cebadores NS31-AM1, por lo tanto es posible el uso de bases
de datos anotadas para este filo y este gen. Otra ventaja de estos cebadores es la baja
amplificación de otros hongos que no sean HFMA (Lee et al., 2008).
Otros grupos de investigación han construido cebadores marcando la región LSU rDNA
(Kjøller & Rosendahl, 2001; Gollotte et al., 2004). Igual como ocurre con el par
AM1/NS31, estos cebadores tampoco amplifican todos los taxones dentro del filo
Glomeromycota. Redecker y cols (2000). (Redecker et al., 2000), diseñaron un set de
cebadores para el extremo 3’ de la región SSU hasta incluir la región ITS. Este proceso
permitió detectar las familias Archaeosporaceae y Paraglomeraceae. Una posterior
extensión de la región amplificada, donde se incluye el extremo 5’ de la región LSU, ha
sido posible con el uso de los cebadores SSUmCf/LSUmBr diseñados por Stockinger y
cols., con los cuales se obtiene un amplicón de 1.5 kb y cubre 240 bp de SSU, 400-526
bp de la región ITS y 800 bp de la región LSU (Stockinger et al., 2010).
Definición de filotipos
En la actualidad, con la nueva generación de secuenciadores (NGS, Next Generation

Sequencing), se ha podido incrementar la sensibilidad en el estudio de las comunidades
de HFMA. Se han encontrado un gran número de “filotipos” (secuencias agrupadas en
Capítulo 1 15
los extremos de las ramas en un árbol filogenético, también denominados “OTUs”,

Operational Taxonomy Units), que no logran ser identificados cuando se comparan con la
información preexistente en las bases de datos, lo cual sugiere que la diversidad de los
HFMA ha sido fuertemente subestimada (Husband et al., 2002; Börstler et al., 2006;
Pellegrino et al., 2012; Lekberg et al., 2012). Otro problema en el análisis de
comunidades es la imposibilidad de comparar estudios donde han evaluado la diversidad
de HFMA utilizando diferentes marcadores moleculares (Öpik et al., 2006).
El análisis de la diversidad del filo Glomeromycota ha enfrentado la misma situación que

presenta el análisis de taxones microbianos que son identificados solo por las secuencias
de su ADN. Los filotipos son referenciados individualmente en cada estudio. Es así que
no existe un consenso sobre cuál criterio es el adecuado para delimitar estos filotipos
(Öpik et al., 2010). Algunos estudios son contradictorios en la detección de taxones con
variabilidad genética intra e inter específica demostrada (Nilsson et al., 2008; Rosendahl
& Matzen, 2008; Gamper et al., 2009; Stockinger et al., 2009). Por estas razones se
reconoce en estudios filogenéticos la asignación de filotipos más que la asignación de
especies para definir la diversidad de los Glomeromycota (Helgason et al., 1998;
Vandenkoornhuyse et al., 2003).
La publicación de las secuencias de Glomeromycota generadas en diferentes estudios

son consignadas en las bases de datos públicas. Sin embargo estas secuencias pueden
estar pobremente anotadas o identificadas erróneamente (Bidartondo et al., 2008;
Ryberg et al., 2008; Brock et al., 2009). En el año 2010, Öpik y colaboradores,
desarrollaron una base de datos para proporcionar secuencias de alta calidad y
completamente anotadas con taxonomía verificada para este filo. En la base de datos
MaarjAM (http://maarjam.botany.ut.ee), se han almacenado las secuencias según su
origen, planta hospedera, bioma y zona climática. La base de datos contiene secuencias
del gen SSU rRNA, y se espera aumentar el rango de marcadores moleculares a futuro.
En el año 2012, Krüger y colaboradores, publicaron la más reciente revisión de

secuencias de HFMA, con el número de accesión en el NCBI (National Center for
Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esta publicación incluye
secuencias generadas con otros marcadores moleculares como LSU e ITS.
Diversidad en las comunidades HFMA
El término diversidad se refiere a la variabilidad en los organismos en diferentes niveles,

entre especies, dentro de especies y en ecosistemas (UNEP, 1992). La variación
genética determina la forma en que una especie interactúa con su ambiente y con otras
especies. Para describir la diversidad de HFMA en el suelo, se deben tomar en cuenta
diferentes aspectos como la dispersión en espacio y tiempo (Helgason et al., 1999;
Daniell et al., 2001), entre hospederos (Helgason et al., 2002; Vandenkoornhuyse et al.,
2002), el manejo del suelo (Helgason et al., 1998; Hijri et al., 2006) y la distribución
dentro de las raíces (Scheublin et al., 2004).
Se ha identificado que el número de HFMA colonizando un fragmento corto de raíz puede

alcanzar los 10 taxa o más. Estos taxa no permanecen durante todo el ciclo de vida de la
planta. Es decir, tanto la cantidad de especies, así como la identidad de los HFMA
colonizando un fragmento de raíz varía con el tiempo. Ya se han observado diferencias
entre los hongos colonizando una plántula y la misma planta en edad adulta (Husband et
al., 2002; Öpik et al., 2003).
El número de taxa de HFMA por planta puede diferir entre hábitats. Se han identificado
entre 7 y 22 taxa colonizando una planta en la selva tropical (Öpik et al., 2006). Sin
embargo, la composición de la comunidad puede ser más importante que el número de
taxa per se, porque se ha observado que las diferentes familias de HFMA presentan una
Capítulo 1 17
estrategia de vida diferente que puede aportar mayor estabilidad de la comunidad frente
a cualquier disturbio (Maherali & Klironomos, 2007; Öpik et al., 2010).
Para que los cambios en las comunidades puedan ser medibles, diferentes índices de
diversidad han sido diseñados. Estos índices adaptados de la macro-ecología han sido
utilizados con éxito en la descripción de las comunidades de microorganismos.
La riqueza de especies (número de especies en una comunidad local, temporal o

espacialmente homogénea) es la vía más simple para empezar su descripción (Stevens,
1989). La cuantificación de cada una de las especies (abundancia), es importante para la
comparación de especies entre sitios, y también para identificar las especies dominantes
y raras en un proceso de sucesión ecológica. La medición de la riqueza en las
comunidades se puede medir por índices que son dependientes del tamaño de la
muestra, como por ejemplo el índice de Margalef (Margalef, 1960). Sin embargo, debido
a la heterogeneidad en la distribución de los microorganismos en el suelo, y a que el
número de especies observadas aumenta con el esfuerzo de muestreo, otras
aproximaciones son consideradas (Colwell & Coddington, 1994; Leitner & Turner, 2001).
Uno de los acercamientos estadísticos que ha sido utilizado para estimar la riqueza de
las comunidades de HFMA corresponde a la generación de curvas de rarefacción y
curvas de acumulación de especies donde se normalizan los datos para poder comparar
entre muestras y se asume la riqueza total como el número de especies que se
encontraría en un esfuerzo infinito de muestreo (Gotelli & Chao, 2013). Otra
aproximación es el uso de estimadores no paramétricos, que se utilizan cuando no se
conoce la distribución estadística de los datos o no se ajustan a ningún modelo
determinado (Chao, 1984). Entre estos, se encuentran los estimadores basados en la
incidencia de especies (Colwell & Coddington, 1994; Leitner & Turner, 2001; Chao et al.,
2005) y los métodos basados en remuestreo, como los estimadores tipo Jackknife y las
técnicas Bootstrap (Palmer, 1990). Estos métodos no paramétricos son aplicables al
estudio de las comunidades de HFMA ya que no se conoce el número de individuos

probable ni cómo se distribuyen las especies en la muestra.
En el análisis de la estructura de las comunidades de HFMA, el índice de abundancia de

Simpson y el índice de diversidad de Shannon-Weaver (Shannon & Weaver, 1949)
también han sido utilizados (Sánchez-Castro et al., 2012).
Para medir el cambio en las comunidades de HFMA, se han utilizado métodos de

similitud, como el índice de Sorensen (Öpik et al., 2010) y análisis multivariados
(Sanchez-Castro et al., 2012) que expresan el grado de semejanza en composición de
especies y abundancias entre muestras.
Estudios de comunidades de HFMA en Colombia.
La aproximación metodológica en el estudio de las comunidades de HFMA en suelos de

Colombia, ha sido enfocada al análisis de la diversidad de especies en suelos ácidos y
asociadas a plantas de yuca (Sierverding, 1991) y maíz (Serralde & Ramirez, 2004).
Estudios recientes, evaluaron la diversidad de HFMA en cultivos de uchuva (Grupo de

Biotecnología de las Micorrizas Arbusculares, Universidad Nacional de Colombia, Sede
Bogotá), con el objetivo de seleccionar especies adaptadas a las condiciones particulares
de los suelos ácidos del trópico y posteriormente, caracterizar estas especies para
realizar aplicaciones biotecnológicas en los mismos cultivos de donde fueron aisladas
(Ramirez, 2014), pues se ha demostrado que la previa adaptación a las condiciones
ambientales, favorece la función del hongo en el sistema (Van Der Heijden et al., 2006).
Capítulo 1 19
Debido a la alta diversidad de HFMA en el trópico observada en estudios previos (Öpik et

al., 2006) y a la importancia de la identidad de las especies en el comportamiento de la
comunidad (Öpik et al., 2010), se abre la necesidad de realizar estudios donde se analice
la diversidad de las comunidades de HFMA en los suelos agrícolas ácidos del trópico,
utilizando nuevas tecnologías que permitan aumentar la probabilidad de describir con
mayor profundidad la comunidad en suelos dedicados a la agricultura en el trópico. En el
trópico, el interes en el uso de inoculantes con base en HFMA, ha ido creciendo, con el
objetivo de mejorar la productividad en sistemas agricolas.
Además, se debe estudiar cuál es el efecto de la inoculación, analizada como disturbio

biológico sobre las comunidades en estos suelos, pues no se conoce si puede ocurrir una
perturbación de la comunidad, como ocurre con disturbios mecánicos o químicos
evaluados en suelos de la zona templada (Porras-Alfaro et al., 2007; Brito et al., 2012a),
también es posible que ocurran fenómenos de competencia que modifiquen la
composición de la comunidad local pero que permitan la colonización de la especie
inoculada o que la inoculación se comporte como un disturbio que de acuerdo con la
teoría del disturbio intermedio (Connell, 1978), aumente la riqueza de especies de la
comunidad HFMA y favorezca la coexistencia.
2. Describir la estructura de la comunidad de
HFMA asociada a plantas de yuca en la
región de estudio.
2.1 Introducción
Los Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA) conforman el filo

Glomeromycota (Schüβler et al., 2001) y establecen simbiosis con el 80% de las plantas
terrestres, donde el beneficio que otorgan los hongos a su hospedero ha sido relacionado
principalmente con el suministro de fosfatos (Smith & Read, 2008).
Los HFMA son un elemento fundamental en los agroecosistemas, porque colonizan las
plantas de interés agronómico mas importantes para la nutrición humana y se ha
demostrado que el uso de HFMA como inóculo (por ejemplo plantas de yuca, Manihot
esculenta Cranz), incrementa la biomasa y el rendimiento del cultivo (Sieverding &
Howeler, 1985; Ceballos et al., 2013).
La simbiosis microrrícica toma una mayor importancia si se tiene en cuenta que las
fuentes de fertilizantes fosfatados se están agotando y aproximadamente para el año
2050, se convertirán en un recurso limitante para la producción de alimentos (Gross,
2010). De esta forma, la aplicación biotecnológica de HFMA en la agricultura, se puede
considerar como una solución para contribuir a la seguridad alimentaria (Rodriguez &
Sanders, 2015), mas aún cuando hay estudios de campo que señalan que con el uso de
los HFMA se puede disminuir la cantidad de fertilizante fosfatado aplicado al cultivo sin
afectar la productividad (Ceballos et al., 2013).
A pesar de que se conoce que los HFMA conforman el 50% de la biomasa microbiana en
el suelo (Olsson, 1999) y que son organismos ubicuos en todos los biomas terrestres
(Öpik et al., 2010), los estudios de los HFMA como inóculo se han enfocado en la
respuesta de la planta, pero los eventos biológicos que ocurren en la rizósfera después
de la inoculación, han sido poco explorados.
De igual forma, el conocimiento sobre la diversidad de los HFMA en suelos ácidos del
trópico, con uso agrícola es limitado, pues se ha centrado en la descripción de las
comunidades por métodos morfológicos en el espacio extraradical, pero poco se ha
indagado sobre las comunidades intraradicales (Senés-Guerrero et al., 2014, 2015; Leon,
2015) y cómo estas se ven afectadas por la fertlilización fosfatada y la inoculación con
HFMA.
Respecto a la fertilización fosfatada, existe un gran número de reportes donde se analiza

el efecto del fosforo sobre las comunidades de HFMA asociadas a plantas en
ecosistemas no agrícolas (Alguacil et al., 2010; Wakelin et al., 2012; Lin et al., 2012;
Camenzind et al., 2014). Sin embargo, pocos estudios han evaluado el mismo efecto en
plantas de interés agronómico (Sieverding & Howeler, 1985).
Para la inoculación con HFMA en sistemas agrícolas la especie más utilizada es

Rhizopagus irregularis. Diferentes razones explican el uso de esta especie como inóculo
tanto en estudios experimentales como en la práctica agrícola. Rhizophagus irregularis
es el hongo modelo en el filo Glomeromycota porque tiene la capacidad de crecer en
cultivo in-vitro (Bécard & Fortin, 1988), es la única especie con el genoma secuenciado
(Tisserant et al., 2013), es abundante en un amplio rango de ecosistemas (Oehl et al.,
2010), coloniza eficientemente las raíces de la mayoría de las plantas (Hepper et al.,
Capítulo 2 23
1988; Jansa et al., 2008; Pellegrino et al., 2011) es una especie resilente frente a
prácticas de manejo agronómico (Oehl et al., 2010). Además se ha demostrado que R.
irregularis aplicado como inóculo se establece exitosamente en las raíces de las plantas
inoculadas (Alkan et al., 2006; Janoušková et al., 2013; Köhl et al., 2016).
Algunas investigaciones en invernadero, han evaluado el efecto que tiene la inoculación

de Rhizophagus irregularis (previamente denominado Glomus intraradices) sobre la
diversidad de la comunidad local de HFMA. Antunes y cols (2009), utilizando T-RFLP y la
región LSU rDNA, encontraron que la inoculación de R. irregularis sobre plantas de maíz,
no afecta la diversidad de los HFMA locales (Antunes et al., 2009). En otro estudio,
donde se analizó la variabilidad el gen ribosomal completo (SSU-ITS-LSU) usando
secuenciación Sanger, se determinó que la inoculación de R. irregularis disminuye la
diversidad de la comunidad local de HFMA asociada a plantas de arveja (Jin et al., 2013).
En este estudio, se describen las comunidades de HFMA asociadas al cultivo de yuca en

la región de la Orinoquía colombiana utilizando métodos morfológicos y moleculares para
i) determinar las especies que están tanto en la rizosfera como las que se encuentran
colonizando las raíces de las plantas de yuca en campo, ii) establecer las especies
fúngicas dominantes que se asocian simbioticamente con la planta de yuca en
condiciones de campo, iii) evaluar la resilencia de las comunidades locales, al disturbio
causado por la fertilización fosfatada y la inoculación con una linea comercial de R.
irregularis.
2.2 Metodología
2.2.1 Descripción del área de estudio y material biológico
El experimento se realizó en la Sede Utopia de la Universidad de la Salle, ubicada en

Yopal, Casanare, Colombia (72º 17’ 48’’ W, 5º 19’ 31’’ N). Las propiedades fisico-
químicas del suelo se muestran en el Anexo 1. El clima en Yopal es tropical con una
temperatura promedio de 18ºC (noche) a 28ºC (día), una humedad promedio de 75% y
una precipitación anual total de 2335 mm con 172 días de lluvia al año
(http://goo.gl/0tm6ns).
El campo experimental utilizado, no había sido cultivado en los últimos 14 años, y era
una pastura en rastrojo. Se preparó el terreno en caballones para el cultivo de yuca. La
variedad de yuca (Manihot esculenta Crantz) MCOL2737 se seleccionó por ser una de
las variedades mas utilizadas por los agricultores de la zona.
Múltiples razones explican la razón por la que se utilizó Rhizophagus irregularis como
inóculo en este experimento: es el hongo modelo para el estudio de Glomeromycota
porque se puede cultivar in-vitro y su genoma ha sido secuenciado (Bécard & Fortin,
1988; Tisserant et al., 2013), es una especie de HFMA ampliamente distribuida, que se
encuentra en todos los biomas terrestres (Öpik et al., 2006), coloniza rápida y
eficientemente las raíces de la mayoría de las plantas (Hepper et al., 1988; Jansa et al.,
2008; Pellegrino et al., 2011) es una especie resilente frente a prácticas de manejo
agronómico (Oehl et al., 2010), se establece exitosamente en las raíces de las plantas
inoculadas (Alkan et al., 2006; Janoušková et al., 2013; Köhl et al., 2016) y es el hongo
mas comúnmente usado como biofertilizante a nivel comercial (Faye et al., 2013), El
producto comercial denominado Glomygel Hortalizas® (http://www.mycovitro.com) fue
producido en condiciones de laboratorio usando técnicas de cultivo in-vitro.
Capítulo 2 25
2.2.2 Diseño experimental
En el experimento se tuvieron dos factores: micorrización y adición de fosfato. Para la

micorrización se establecieron dos niveles: con micorriza (+AMF, por sus siglas en ingles
Arbuscular Mycorrhizal Fungi) y sin micorriza (-AMF). Para la adición de fosfato, se
establecieron tres niveles del fertilizante fosfatado (P) : sin fertilización (0% P), 50% de
fertilización (50% P) y 100% de fertilización (100% P). El tratamiento 100%P equivale a la
cantidad normal de fertilizante fosfatado aplicado a los cultivos de yuca en la región: 201
Kg ha-1 de fosfato di-amónico. Para conocer el plan de fertilización completo del cultivo
ver Ceballos y cols (2013).
Los seis tratamientos se organizaron en un diseño factorial en bloques con dos factores y
parcelas subdivididas, donde la inoculación con HFMA fue el tratamiento principal y la
adición de fosfato conformaba la subparcela. El control del experimento fueron plantas no
inoculadas. Se establecieron cuatro bloques, cada uno contenía tres réplicas por
tratamiento, para un total de 12 plantas (réplicas) por tratamiento (Anexo 2).
El material vegetal para la siembra, fue seleccionado usando el tercio medio del tallo de
plantas parentales que tenían dos o tres yemas vegetativas y un grosor de 2 cm
aproximadamente. Estas estacas se sembraron con una inclinación de 30º a 20 cm de
profundidad. En el momento de la siembra los cangres se inocularon, y se realizó una
una re-inoculación a los 45 días. El fertilizante fosfatado se aplicó a los 45 días después
de la siembra. No se realizó ningun riego artificial y el manejo del cultivo fue convencional
sin la aplicación de fungicidas, debido a la ausencia de enfermedades en el cultivo.
Para la inoculacion, y antes de la siembra, las estacas de Manihot esculenta Cranz

fueron sumergidas en una solución diluída del producto comercial (1:200) que contenía
500 propágulos de R. irregularis, lo cual corresponde al doble de la dosis sugerida por el

fabricante. Luego de la siembra, el exceso de inóculo fue distribuido en partes iguales
para cada planta en el tratamiento +AMF. Las plantas no inoculadas recibieron la misma
cantidad de agua.
2.2.3 Muestreo
Las muestras de suelo rizosférico (50 gramos) y raicillas de cada planta de yuca fueron
colectadas en el momento de la cosecha (Mayo del año 2012). Estas muestras fueron
transportadas dentro de las 24 horas siguientes a los laboratorios de la Facultad de
Ciencias – Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá .
Las muestras de suelo, que se destinaron para la descripción de la comunidad de HFMA

a partir de esporas, fueron secadas a temperatura ambiente y luego almacenadas a 4 ºC
hasta su procesamiento. Se analizaron 4 muestras por tratamiento.
Las muestras de raíces se utilizaron para análisis moleculares con el objetivo de describir
la comunidad de HFMA que se encontraba dentro de las raíces de yuca y que muy
posiblemente eran las que estaban estableciendo una relación simbiótica en el momento
del muestreo. Las raíces fueron lavadas con el fin de retirar las particulas de suelo
adheridas y luego fueron rotuladas y almacenadas a -80ºC. Para el análisis molecular,
las 12 plantas por tratamiento fueron agrupadas en 4 muestras compuestas, para tener al
final cuatro replicas por tratamiento.
Capítulo 2 27
2.2.4 Análisis de la comunidad de HFMA a partir de esporas en el

suelo rizosférico
Para hacer un reporte cuantitativo de la diversidad de HFMA presente en el suelo

rizosférico, se realizó la extracción de esporas y se cuantificó la densidad de esporas de
HFMA en cada una de las muestras (Gerdemann & Nicolson, 1963). Las esporas fueron
clasificadas según su forma, color y tamaño en morfoespecies.
En el análisis por morfología se tuvo en cuenta que las esporas de HFMA no representan
individuos, son unidades discretas que pueden ser asignadas a morfotipos y usadas para
cuantificar la diversidad de una comunidad de HFMA en suelo (Smith & Read, 2008). Por
lo tanto se cuantificó el número de morfotipos y la abundancia de cada morfotipo por
muestra. Estos datos se utilizaron para calcular diferentes índices de diversidad como se
describe a continuación.
Índices de diversidad
En el análisis de esporas de HFMA presentes en suelo rizosférico los índices de

diversidad calculados para cada muestra fueron:
1. Densidad (DE): Número de esporas por gramo de suelo

2. Riqueza (S)= Número de morfotipos presentes por muestra
3. Abundancia absoluta (AA): Número de esporas de cada morfotipo en 10 gramos de
suelo.
4. Abundancia relativa se describe en la siguiente formula:
AAx100
Abundancia Relativa(AR) =
DE
Los siguientes índices fueron calculados para el análisis de esporas HFMA en el suelo
rizosférico, usando como unidad de medida los morfotipos:
5. Índice de diversidad de Shannon – Wiener (H’):
Donde: Pi = Proporción de individuos de cada morfotipo con respecto al total de
morfotipos. Varía entre 1 y 5.
6. Índice de Uniformidad (E)
E = H’/H’max , donde H ́max = ln S . (S=N° de morfotipos).
Si una comunidad exhibe una máxima uniformidad (E=0), no hay morfotipos dominantes.
7. Índice de dominancia de Simpson (D):
D =∑ [ni (ni - 1) / N(N -1)], donde (ni = N° de individuos de un morfotipo y N= N° total de
individuos)
Análisis estadístico:
Previo a detectar diferencias significativas entre tratamientos, se comprobó que los datos
cumplieran los supuestos de igualdad de varianza y normalidad requeridos para pruebas
paramétricas.
La diferencia significativa para los datos de riqueza fue evaluada por un análisis de
varianza (ANOVA) de dos vías o Kruskall-Wallis para pruebas no-paramétricas. Las
Capítulo 2 29
diferencias fueron consideradas significativas con un valor P ≤0.05 y se realizó la prueba

de Tukey para encontrar la diferencia entre medias. Estos análisis fueron realizados en el
programa R version 2.15.0 (R Core Team, 2013).
a) Identificación de esporas de HFMA usando caracteres

morfológicos
Se realizó la descripción de los caracteres morfológicos utilizando esporas jóvenes

provenientes de cultivos trampa. El montaje de cultivos trampa se describe a
continuación:
Montaje de cultivos trampa:
El objetivo de este proceso fue promover la multiplicación de esporas activas presentes

en el suelo problema. En este caso, la planta trampa seleccionada fue Allium porrum, una
especie vegetal altamente dependiente de la micorrización, que pudo ser cultivada bajo
las condiciones ambientales de los invernaderos de la Universidad Nacional, Facultad de
Ciencias, sede Bogotá.
Debido a que el suelo que se utiliza para el montaje del cultivo trampa, debe tener las
condiciones físico-químicas similares al suelo problema, se transportó suelo desde el
campus experimental Utopía en Yopal, Casanare.
Se utilizaron macetas de 300 g para colocar una mezcla de suelo:arena (1:1) esterilizada
por calor (121ºC por 40 minutos). Sobre éstas se colocaron 200 g del suelo problema y
se sembraron de dos a tres plántulas de A. porrum previamente germinadas en semillero.
Las plántulas fueron regadas con 200 ml de agua cada dos o tres días. Transcurridos dos
meses, las plántulas fueron trasplantadas a macetas de 500 g, adicionando suelo:arena

esterilizado por calor y mantenidas por dos años. Los muestreos de suelo rizosférico para
la extracción de esporas de cultivos trampa, se realizaron 0.5, 1.0 y 1.5 años después del
trasplante. Las esporas extraídas del cultivo trampa, que se observaron saludables (que
no estaban parasitadas, ni rotas, ni deshidratadas) fueron separadas por morfotipos y se
utilizaron para la identificación taxonómica por morfología y también para la identificación
taxonómica por métodos moleculares (secuenciacion metodo Sanger).
Descripción de caracteres morfológicos:
Esporas de cada morfotipo (entre 5 y 15), se colocaron en una lámina portaobjetos

usando PVLG (Polyvinyl alcohol-lacto-glycerol) y reactivo de Melzer (Koske & Tessier,
1983; Morton et al., 1993) para observar bajo el microscopio en un aumento 400x y
1000x. Las características morfológicas de las esporas (número de capas de la pared,
color, tamaño, conexión hifal y otras estructuras) se describieron con base en los
parámetros del INVAM (the International Culture Collection of VA Mycorrhizal Fungi,
http://invam.caf.wvu.edu) y otras referencias (Krüger, 2011; Oehl et al., 2011a,d;
Błaszkowski, 2012).
En la identificación a nivel de especie, se contó con la asesoría del profesor Ewald

Sieverding (Institute for Plant Production and Agroecology in the Tropics and Subtropics,
University of Hohenheim, Stuttgart, Germany), especialista en la morfología y taxonomía
de HFMA, co-autor de diferentes publicaciones donde se estudia la morfología y
taxonomía de esporas de HFMA (Sieverding & Howeler, 1985; Sieverding, 1991; Oehl et
al., 2008, 2011a; Sieverding et al., 2014).
Capítulo 2 31
b) Identificación de morfotipos de HFMA por métodos

moleculares
Entre 2 a 5 esporas de cada morfotipo, fueron procesadas: lavado tres veces por pipeteo
con agua destilada desionizada estéril (H2O-dde), para eliminar partículas que estuvieran
adheridas a la pared de la espora. El protocolo de extracción de ADN de esporas de
HFMA, se estandarizó adaptado de Sanders y cols., (1995), sin la necesidad de
sonicación ni el uso del Chelex®. Brevemente, las esporas se suspendieron en 20 µl de
H2O-dde, se colocaron en tubos de polipropileno de 0,2 ml y se mantuvieron en hielo. Las
esporas fueron presionadas con mini pistilos estériles (Eppendorf®) hasta romperlas y
liberar su contenido; 2µl de esta suspensión fueron colocados como templete
directamente en la reacción de PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).
Para amplificar secuencias de ADN de hongos del filo Glomeromycota, la primera

reacción de PCR (AML1-AML2; Lee et al., 2008) fue llevada a cabo a un volumen final de
25 µl, usando 0,2 mM de dNTPs y 0,5 mM de cada cebador. Las condiciones del proceso
de amplificación fueron: 94°C por 3 min, 30 ciclos de 1 min de denaturación a 94°C, 1
min de hibridación de cebadores a 50°C y 1 min de extensión a 72°C, seguido por una
extensión final de 72°C por 10 min. El producto de la PCR fue diluido 1:100 y 2 µl fueron
usados como templete para la segunda PCR, donde se utilizó la pareja de cebadores
NS31-AM1 (Helgason et al., 1998), con las siguientes condiciones: 94°C por 3 minutos,
30 ciclos de 1 min de denaturación a 95°C, 1 min de hibridación de cebadores a 58°C y 1
min de extensión a 72°C, seguido por una extensión final de 72°C por 10 min. Como
control positivo se utilizó ADN de Rhizophagus irregularis extraído a partir de cultivo in-
vitro, que tenía una concentración aproximada de 30 ng/µl; donde 1 µl fue colocado en la
reacción de PCR.
Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% y

teñidos con Sybr®Safe (Life technologies®). Fragmentos del tamaño esperado (550 bp)
fueron cortados, purificados (The Wizard® SV Gel y PCR Clean-Up System, Promega),
clonados en el vector pGEM-T Easy® (Promega) e insertados en células competentes de

Eschericiha coli, cepa JM109® (Promega). Los clones obtenidos fueron utilizados para
amplificar el fragmento deseado, por medio de PCR-colonia usando los cebadores NS31-
AM1, con las condiciones descritas anteriormente. Los productos de PCR del tamaño
esperado, fueron purificados y enviados a secuenciación por Sanger a Macrogen Inc
(Corea).
Las secuencias fueron filtradas por calidad del electroferograma. También se eliminaron
las secuencias que, por similitud con secuencias en las bases de datos (BLASTn), no
correspondían a Glomeromycota. Las secuencias filtradas fueron utilizadas para el
análisis filogenético con el fin de realizar una asignación taxonómica apropiada para cada
morfotipo y comparar con los resultados del estudio morfológico.
Análisis filogenético
Secuencias del gen ribosomal del filo Glomeromycota (1.5 kb, SSU-ITS-LSU),
disponibles online (http://schuessler.userweb.mwn.de/amphylo/) y publicadas por Krüger
y colaboradores (2012), representan la taxonomía mas reciente para este filo y fueron
utilizadas como referencia con el objetivo de determinar la posición filogenética de las
secuencias SSU rDNA obtenidas en este estudio.
El alineamiento de secuencias blanco o “query” (secuencias de HFMA provenientes de

esporas y raíces) se realizó utilizando el programa MAFFT (Multiple sequence alignment
based on fast fourier transform) version 6.8 (Katoh & Standley, 2013) en el servidor
http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py; y el resultado se revisó manualmente utilizando
el programa MEGA versión 6 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis Program)
(Tamura et al., 2013).
Capítulo 2 33
El árbol de máxima verosimilitud (ML) se calculó con el programa RAxML versión 8

(Stamatakis, 2014), en el servidor CIPRES (https://www.phylo.org/portal2/), utilizando dos
estrategias: i) RAxML básico y ii) el algoritmo de colocación evolutiva o también llamado
algoritmo EPA (Evolutionary Placement Algorithm). Las condiciones de corrida de cada
estrategia se observan en el Anexo 3.
Para todos los análisis filogenéticos se calcularon 1000 bootstrap y se utilizó el modelo
GTR+GAMMA que se ha demostrado se ajusta para esta region genómica (Krüger et al.,
2012). En la estrategia RAxML-básico, un total de 1077 secuencias (incluídas las
secuencias de referencia, secuencias HFMA provenientes de esporas y secuencias
HFMA provenientes de raíces) fueron alineadas en un mismo archivo y procesadas para
el análisis filogenético. Este proceso requirió un tiempo computacional mayor y se obtuvo
un soporte de bootstrap menor a nivel de familias taxonómicas comparado con la
estrategia RAxML-EPA. Además separó secuencias de referencia con un bootstrap de
100, indicando que son secuencias diferentes, cuando por conocimiento previo
pertenecen a la misma especie (Por ejemplo Funneliformis sp). Algunas secuencias de
esporas fueron ubicadas en el género Scutellospora, resultado no era concordante con lo
observado en la morfología (Anexo 4).
En la estrategia RAxML-EPA, utilizada por Senes y cols (2015), las secuencias de

referencia se utilizaron para calcular un árbol filogenético de referencia (Anexo 5), sobre
el cual las secuencias blanco fueron ubicadas por ML (Anexo 6). El algoritmo EPA tuvo
un tiempo computacional menor con una mejor resolucion de clados comparado con la
estrategia RAxML-básico. Por estas razones se eligió la estrategia RAxML-EPA como la
adecuada para analizar las secuencias de este estudio.
De acuerdo con el análisis filogenético RAxML-EPA, los OTUs se ubicaron en una

especie putativa, cuyo clado podía o no tener un valor de bootstrap asociado,
dependiento de si el clado estaba presente en el arbol de referencia, debido a que esta
estrategia utiliza los valores de bootstrap existentes pero no calcula valores bootstrap
para nuevas ramas del árbol. (Carolina Senes, comunicación personal). Se identificaron
especies. Se identificó la especie a la cual pertenecía cada secuencia blanco y se
asignaron especies denominadas “putativas” para los nuevos clados en el árbol.
Otra estrategia utilizada en diferentes investigaciones de HFMA (Öpik et al., 2006;

Davison et al., 2015), denominada “virtual taxa” (VT), se desarrolló para clasificar los
OTUs en estudios de comunidades de HFMA. Sin embargo los virtual taxa agrupan un
nivel de similaridad que no corresponde directamente a una especie o género
establecido. Por lo tanto en este estudio se hizo la propuesta de ubicar las secuencias a
un nivel taxonómico con el objetivo de encontrar un significado ecológico a los cambios
observados en la comunidad de HFMA
2.2.5 Análisis de la comunidad de HFMA presente en las raíces

de plantas de yuca
Para el análisis de la diversidad de HFMA presentes dentro de las raíces de la planta de

interés, se utilizó el siguiente esquema de trabajo: (a) Extracción de ADN, amplificación
de la región SSU rDNA de los HFMA (b) Secuenciación con tecnologías de tercera
generación, Illumina MiSeq (c) Análisis bioinformático y delimitación de unidades
taxonómicas operacionales (OTUs) (d) Análisis filogenético, (e) índices de diversidad y (f)
Análisis estadístico.
a) Extracción de ADN, amplificación de la región SSU rDNA de

los HFMA
La extracción de ADN de raíces de yuca se realizó siguiendo el protocolo del kit Power
Soil® (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA), utilizando 100 mg del material vegetal
Capítulo 2 35
que fue previamente lavado para eliminar partículas de suelo y se almacenó a -80ºC
hasta su procesamiento. Las raíces colocadas en un tubo plástico de 1.5 ml fueron
trituradas manualmente utilizando nitrógeno líquido y pistilos de plástico pequeños
estériles. La eficiencia de la extracción se evaluó por espectrofotometría (NanoDrop®
1000 Thermo Scientific) y se seleccionaron muestras con >10 ng/µL. Para aumentar el
éxito de la amplificación, el ADN fue utilizado el mismo día de la extracción. Se guardaron
alícuotas de ADN a -20ºC.
Se utilizaron 6 µl de ADN para iniciar la amplificación con la pareja de cebadores AML1-

AML2 (Lee et al., 2008), bajo las mismas condiciones descritas anteriormente (Numeral
2.2.4). Con el producto de PCR de esta primera reacción, se realizó una segunda
reacción de PCR, utilizando la pareja de cebadores NS31-AM1 (Simon et al., 1992;
Helgason et al., 1998) (Anexo 7).
Se realizó una estandarización preliminar con el fin de determinar si los amplicones

resultantes de este proceso correspondían a secuencias de Glomeromycota. Para esto,
el producto de PCR de diez muestras fue colonado en el vector pGEM T-easy vector®
(Promega) y transformadas en células competentes MAX Efficiency® DH5α (Life
Technologies). Después de la selección de las colonias transformantes, se realizó la
secuenciación por Sanger, utilizando los cebadores SP6 y T7. Un total de 94 clones
fueron secuenciados. Las secuencias obtenidas fueron alineadas en MEGA6 (Tamura et
al., 2013). Los resultados obtenidos confirmaron que las secuencias amplificadas con los
cebadores AM1-NS31, pertenecían a secuencias de HFMA y de esta forma el proceso de
amplificación fue validado para realizar secuenciamiento masivo.
Posteriormente, para todas las muestras de ADN de raíz, los productos de PCR de la
primera reacción fueron utilizados en una segunda amplificación con la pareja de
cebadores AM1-NS31*, donde el cebador NS31* tenía una secuencia de 5 nucleótidos
(nt) adicionales, que se añadieron para ser utilizados como código de identificación o
“barcode” (Anexo 8). Los “barcodes” fueron generados usando el programa “Barcode
Generator”, http://comailab.genomecenter.ucdavis.edu/index.php/Barcode_generator)
(Luca Comai & Tyson Howell), utilizando los siguientes parámetros: longitud del barcode
5 nt, mínima distancia genética entre barcodes 2 nt, contenido de GC entre 0 y 50%.
Para esta segunda amplificación se utilizaron las mismas condiciones de PCR descritas
previamente. Los productos de PCR se separaron por electroforesis de agarosa 1.0%
(p/v) con tinción SYBR® safe (ThermoFisher Scientific). Las bandas de 550 bp fueron
eluídas usando el kit de purificación QIAquick® Gel Extraction® kit (Qiagen). La cantidad
de ADN purificado se evaluó en gel de electroforesis, para asegurar la presencia del
amplicón.
Las muestras fueron enviadas al Laboratorio del Grupo de evolución de microorganismos

simbiontes, dirigido por el Profesor Ian Sanders y ubicado en el edificio Biophore de la
Universidad de Lausanne, Suiza, donde fueron almacenadas a -20ºC hasta su
procesamiento.
b) Secuenciación con tecnologías de tercera generación, Illumina

MiSeq
Inicialmente, se realizó la cuantificación de ADN por fluorescencia, utilizando el kit

Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay® Kit y el analizador QuantusTM Fluorometer.
Luego, se construyeron las librerías de ADN utilizando el kit TruSeq® DNA Sample
Preparation de Illumina®. En cada librería se incluyeron de 20 a 40 muestras donde
ningún código (barcode) podía estar repetido para evitar la mezcla de tratamientos o
réplicas (conocido en inglés como “sample multiplexing”). Posteriormente, se cuantificó la
concentración de ADN final para cada librería utilizando el kit Qubit® dsDNA High
Sensitivity (ThermoFisher Scientific®) El control de calidad de cada una de las librerías
se realizó por medio de cromatografía capilar (Fragment Analyzer™, Advanced Analytical
Technologies, Inc.), donde se evaluó la cantidad de ADN y el tamaño del fragmento
Capítulo 2 37
obtenido, que debía corresponder a 670 nt (550 bp del fragmento de PCR, más 120 bp
de los adaptadores).
Las librerías fueron secuenciadas con la plataforma MiSeq IlluminaTM, en el Centro de

Genómica Integrativa (Center for Integrative Genomics, CIG), en la Universidad de
Lausanne, Suiza.
Los resultados del secuenciamiento fueron almacenados en la pagina web del centro de
tecnologías genómicas de la Universidad de Lausanne (Lausanne Genomic Technologies
Facility – LGTF) y descargados en el servidor “vital-it”( http://www.vital-it.ch) del Instituto
Suizo de Bioinformática (Swiss Institute of Bioinformatics - SIB), plataforma en la cual se
realizó todo el proceso de análisis bioinformático.
c) Análisis bioinformático y delimitación de OTUs
Para el análisis bioinformático, se estableció un grupo de trabajo con el Dr. Frédéric

Masclaux y el señor Lucas Villard, integrantes del Instituto Suizo de Bioinformática (Swiss
Institute of Bioinformatic, SIB) y del grupo de Ecología y Evolución de organismos
simbiontes de la Universidad de Lausanne, respectivamente. Se diseñó una ruta de
trabajo que se resume en la Figura 1.
Para la delimitación de OTUs (clustering) se utilizó el programa DBC 454 (Pagni et al.,
2013), diseñado por el Instituto Suizo de Bioinformática para el análisis de comunidades
de hongos en muestras ambientales (Pellissier et al., 2013). La estandarización de este
proceso, se realizó con el fin de calcular el valor ideal para cada uno de los parámetros
exigidos por el programa, que son intrínsecos para cada grupo de datos (Anexo 9). En
este estudio, se utilizó un profuso número de secuencias de hongos SSU rDNA, que
fueron obtenidas por la amplificación de diferentes muestras de raíces de plantas de yuca
en campo, como se describió anteriormente. En un total de 1.213.653 secuencias

utilizadas para esta estandarización, estaban incluidas las secuencias del experimento
descrito en este capítulo.
Figura 1. Ruta de trabajo en el análisis bioinformático para el análisis de las librerías

Illumina MiSeq.
Como resultado final del análisis bioinformático se obtuvieron los siguientes productos: (i)
la tabla de abundancias usada en los análisis estadísticos para determinar la diversidad
alfa y beta; y (ii) las secuencias consenso utilizadas para identificar cuáles OTUs
pertenecían al filo Glomeromycota y para el análisis filogenético.
Capítulo 2 39
Para confirmar que las secuencias consenso de cada OTU correspondían al filo
Glomeromycota, éstas se evaluaron en la herramienta BLASTn del NCBI para aislar las
secuencias que pertencen a secuencias de plantas, otros hongos uo animales del suelo.
Curvas de rarefacción y acumulación de especies fueron calculadas utilizando el

programa estadístico R, version 2.15.0 (R Development Core Team, 2012)., con las
funciones ‘specaccum’() y ‘rarecurve’().
d) Análisis filogenético
Las secuencias consenso de cada OTU, fueron alineadas con las secuencias de los
morfotipos con el fin de estimar la posición filogenética utilizando la estrategia RAxML-
EPA. El proceso se realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente (numeral
2.2.4, Anexo 3)
e) Índices de diversidad
Para calcular los índices de diversidad se utilizaron dos bases de datos. La primera fue la
tabla de abundancia relativa de cada OTU en cada muestra. En la segunda base de
datos, siguiendo los resultados el análisis filogenético RaxML-EPA, los OTUs fueron
agrupados en especies, entonces los datos de abundancia relativa de OTUs de la misma
especie fueron sumados.
El número de OTUs o especies presentes en cada muestra y sus abundancias fueron

utilizadas para calcular el índice de diversidad de Shannon y Weaver (H’) (1963), el
índice de dominancia de Simpson (D) (Simpson, 1949) y el índice de Pielou (Pielou,
1977) aplicando la función “diversity()” en el paquete “Vegan” (Oksanen et al., 2015). del
programa estadístico R version 2.15.0 (R Development Core Team, 2012).
En estas ecuaciones, “s” es el número total de OTUs o especies y “Pi” (la abundancia
relativa de cada OTU o especie) es medida como: “Pi=ni/N”, donde ni representa el
número de secuencias que representan un OTU y N el número total de secuencias que
representan la comunidad HFMA. La uniformidad de especies (“evenness” en ingles), fue
estimada utilizando la ecuación E=H/logS (Pielou, 1977), donde H es el valor para el
índice de Shannon.
f) Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa R versión 2.15.0 (R

Development Core Team, 2012). Las diferencias entre tratamientos fueron encontradas
significativas para un valor P <0.05 en todos los análisis.
Para evaluar las diferencias estadísticas entre los índices de diversidad alfa causadas
por la inoculación con R. irregularis y la fertilización fosfatada, se realizaron análisis de
varianza (ANOVA) de dos vías utilizando el paquete ‘stat’. Se realizó prueba de Tukey
para encontrar diferencias entre medias.
Previo al análisis de la beta-diversidad (las muestras fueron normalizadas calculando la

proporción para cada OTU en la comunidad, con el fin de remover la variabilidad
generada por el número de secuencias entre muestras (rango entre 50 y 16000). Para
Capítulo 2 41
esto se siguió la metodología propuesta por Bainard y col (2014) donde el número de
secuencias de un OTU en una muestra se dividió en el número total de secuencias para
la misma muestra.
El análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA), fue utilizado para

evaluar el efecto de los tratamientos sobre la estructura de la comunidad de HFMA,
usando las funciones ‘adonis’ y ‘beta-disper’ basado en matrices de distancias Bray-
Curtis, para incluir cambios en riqueza y abundancia de las comunidades evaluadas.
El escalamiento multidimensional no métrico (NMDS, Nonmetric mulridimensional

scaling) fue utilizado para visualizar las diferencias entre las comunidades de HFMA
teniendo en cuenta los tratamientos que significativamente afectaron las comunidades
según el resultado de PERMANOVA.
El porcentaje de similaridad para determinar cuales especies contribuyen a la

disimilaridad entre grupos fue calculado utilizando la función ‘simper’ en el paquete
Vegan.
2.3 Resultados
2.3.1 Comunidad de HFMA a partir de esporas del suelo

rizosférico
El suelo rizosférico recolectado de cada planta de yuca, fue utilizado para la identificación
taxonómica de los morfotipos que conformaban la comunidad de HFMA y para evaluar la
resilencia de ésta comunidad, frente a prácticas agrícolas habituales como son la

fertilización fosfatada y la inoculación con HFMA .
a) Diversidad de HFMA locales en suelo rizosférico a partir del

análisis de esporas
En el análisis de esporas, se recopiló información de caracteres morfológicos para cada

morfotipo, tales como tamaño, número de capas en la pared, ornamentaciones y reacción
con el reactivo de Melzer que, permitieron clasificar los morfotipos a nivel de orden
taxonómico (Tabla1). Sin embargo, la dificultad de observar conexión hifal y tipo de septo
en la mayoría de los morfotipos, dificultó su identificación a nivel de familia o género,
como si se ha observado en otros estudios donde utilizan únicamente parámetros
morfológicos para describir la comunidad de HFMA (Stürmer et al., 2006; Oehl et al.,
2011a; Ramirez, 2014).
En las muestras de suelo rizosférico de las plantas de yuca, se identicaron 37 morfotipos

que fueron asignados a nivel de género o especie de acuerdo con los resultados del
análisis morfológico y molecular (Tabla 1, Anexo 6). Una vez que los mortotipos tenían
una asignación taxonómica establecida, fueron denominados morfoespecies. En este
estudio el uso de secuencias de ADN para la identificación de cada morfotipo fue una
herramienta muy útil y como se ha reportado previamente (Krüger, 2011; Young, 2012),
el uso combinado de estas dos metodologías, se constituyó en una estrategia acertada
para la clasificación taxonómica de esporas de HFMA
Para algunos morfotipos no se logró obtener una secuencia de ADN (Tabla 1), debido a
su baja frecuencia en el suelo y/o no amplificaron, se aislaron esporas viejas o
parasitadas que no eran apropiadas para el estudio genético, no lograron clonarse o
dieron un resultado en la secuenciación que no correspondía a Glomeromycota.
Capítulo 2 43
Tabla 1. Asignación taxonómica de morfotipos por sus características morfológicas y por

el análisis filogenético RaxML-EPA
Morfoti Clasificación por

Clasificación por RAxML-EPA
po morfología
1 Diversisporales Diversispora aurantia
2 Glomerales Sin secuencia
3 Glomerales Claroideoglomus sp
4 Glomus brohultii Sin secuencia
5 Glomus austral Sin secuencia
6 Glomerales Claroideoglomus claroideum
7 Diversisporales Diversispora aurantia
8 Glomerales Acaulospora sp2
10 Glomerales R. irregularis
14 R. irregularis Claroideoglomus sp
17 Diversisporales. Claroideoglomus sp
19 Glomus manihotis R. irregularis
20 sin clasificar Claroideoglomus sp
21 sin clasificar Claroideoglomus sp
22 sin clasificar Diversispora epigea
23 Diversisporales Sin secuencia
24 sin clasificar R. irregularis
25 Diversisporales Rhizophagus sp1
26 Diversisporales Diversispora sp
27 Diversisporales Claroideoglomus sp
30 sin clasificar Claroideoglomus claroideum
32 Diversisporales Sin secuencia
34 Diversisporales R. irregularis
Archaeosporales.
36 Claroideoglomus sp
Ambispora sp.
37 Diversisporales Claroideoglomus sp
La comunidad de HFMA en el espacio extraradical estaba conformada por especies de

dos ordenes taxonómicos: Glomerales y Diversisporales, donde el primero ocupó casi el
90%. Usando la información de caracteres morfológicos, solo dos morfotipos dentro de
los Glomerales fueron idenficados a nivel de especie: Glomus brohultii y Glomus austral .
En el orden Glomerales, Claroideoglomus sp fue el género dominante y ocupó entre el 54

al 56% de la comunidad de HFMA en el suelo rizosférico; seguido del género Glomus sp
(8-20%) y Rhizophagus sp (6-20%). En el orden Diversisporales, Diversispora sp y
Acaulospora sp representaron el 12% y 3% respectivamente (Figura 2)
Figura 2. Abundancia relativa (%) de las morfoespecies de HFMA en suelo rizosférico de

plantas de yuca en campo.
Capítulo 2 45
b) Efecto de la inoculación con un aislado de R. irregularis y la

fertilización fosfatada en la comunidad extraradical de HFMA
El experimento en campo, en el cual se realizó la descripción de la comunidad

extraradical de HFMA a partir de esporas, tuvo la influencia de dos factores: la
inoculación con R. irregularis y diferentes niveles de fertilización fosfatada.
Los análisis estadísticos mostraron que la densidad de esporas de HFMA fue la variable
mas afectada por la interacción de los dos factores (Tabla 2, Anexo 10). En este estudio,
factores como la inoculación y la aplicación de fertilizante fosfatado generan una
disminución de aproximadamente el 50% en la esporulación de especies de HFMA, en el
suelo rizosférico de plantas de yuca en campo (Figura 3).
Con base en la información de esporas en el suelo rizosférico de plantas de yuca, las

comunidades HFMA extraradicales mostraron homogeneidad en el número de
morfoespecies encontradas, con una riqueza en promedio de 26 a 33 morfoespecies por
tratamiento y sin cambios en la abundancia (Tabla 2).
Agrupando las morfoespecies a nivel de género, se encontró que la tasa de esporulación

del género Acaulospora sp, se vio favorecida con la inoculación, con un mayor número
de esporas en las comunidades inoculadas comparado con las no inoculadas (P=0.042,
Anexo 11). Por el contrario, para el género Glomus sp se presentó una disminución en la
esporulación cuando se adicionó fertilizante fosfatado al suelo rizosférico (P=0.0084).
Para el género Claroideoglomus sp se presentó mayor esporulación en la adición del
50% de fertilizante fosfatado (P= 0.05), mientras que para el género Diversispora sp,
disminuyó su producción de esporas con la aplicación de fertilizante fosfatado (P=
0.0170) (Figura 4).
Tabla 2. Análisis estadístico para los datos de diversidad de HFMA en el suelo

rizosférico, basado en el recuento de esporas de HFMA. Diferencias significativas para
valores P<0.05.
Tratamientos Riqueza Indice de Indice de Uniformidad Densidad

de Shannon Simpson de
esporas esporas
Interacción 0.711 0.704 0.567 0.957 0.004 *
- Inoculación 0.628 0.408 0.198 0.578 --
- Fertilizante P 0.506 0.219 0.130 0.267 --
Figura 3. Promedio de densidad de esporas para cada tratamiento. El asterisco indica

diferencias significativas con un valor alfa de 0.05.
Capítulo 2 47
Figura 4. Promedio de la abundancia relativa de cada género de HFMA en el suelo

rizosférico de plantas de yuca en campo, basado en los datos de esporas. Las letras
diferentes indican diferencias significativas con un valor alfa de 0.05.
*Las letras sobre las barras muestran las diferencias encontradas para cada género, según el factor responsable de estas
diferencias. Entonces para Acaulospora sp fue la inoculación y para los demás géneros, excepto Rhizophagus sp, fueron
las dosis de fertilizante fosfatado.
2.3.2 Comunidad de HFMA presente en las raíces de plantas de

yuca
Después del análisis bioinformático, un total de 1.213.653 secuencias fueron agrupadas

en 235 OTUs. Por análisis de similitud de secuencias con la base de datos NCBI,
utilizando el programa BLASTn, se detectó que 77 de los 235 OTUs pertenecían al filo
Glomeromycota (OTUs-HFMA). Los OTUs restantes presentaron una similitud con
secuencias de Basidiomycetes, Ascomycetes, plantas y otros eucariotas, y fueron
descartados de los análisis estadísticos.
Figura 5. Curva de rarefacción para todas las secuencias SSU rDNA obtenidas en este
estudio por medio de secuenciación Illumina MiSeq® para el filo Glomeromycota.
Con la gráfica de rarefacción, se determinó que el número de secuencias del filo

Glomeromycota obtenidas por muestra, fue suficiente para proporcionar una cobertura de
la diversidad de HFMA en las raíces de las plantas de yuca (Figura 5). Con un bajo
número de secuencias por muestra el valor de riqueza observado se alejó del valor no
paramétrico de riqueza estimado Chao-1, que calcula el número de posibles especeies,
incluyento las especies no detectadas en el ensamblaje (Gotelli & Chao, 2013). Sin
embargo, a medida que se aumentó el número de secuencias por muestra, el valor
observado se acercó al valor estimado, lo cual indicó que los valores de riqueza
obtenidos en este estudio son representativos de lo que ocurre en la naturaleza.
Un análisis filogenético inicial, alineando todas las secuencias OTUs-HFMA, sin el uso de
secuencias de referencia (Anexo 3) mostró la agrupación de los OTUs a nivel de familia.
Utilizando la información generada en el árbol filogenético RAxML-EPA, dentro del
género Rhizophagus solo la especie R. irregularis pudo identificarse claramente. Las
demás especies en el género Rhizophagus quedaron sin clasificación, sin embargo la
estrategia metodológica utilizada permitió separar especies putativas dentro del género,
denominadas Rhizophagus sp1 hasta Rhizophagus sp7 (Figura 7). Dos OTUs
Capítulo 2 49
correspondieron al género Claroideoglomus. En el orden Diversisporales, diez OTUs

correspondieron a Acaulospora sp y dos OTUs a Scutellospora cerradensis.
Figura 6. Árbol filogenético de máxima verosimilitud con las secuencias consenso de

OTUs-HFMA presentes en raíces de yuca. La secuencia de un hongo del filo Ascomycota
(Schizosaccharomyces pombe) fue utilizado como grupo externo.
0.23
0.3 consensus_cluster118
0.41
consensus_cluster100
0.84
0.68
0.5
consensus_cluster67
consensus_cluster34
0.32 0.95 consensus_cluster39
0.48
consensus_cluster40
consensus_cluster42
0.78
consensus_cluster38
0.35
consensus_cluster92
0.85
0.56
0.88
consensus_cluster69
0 0.95 consensus_cluster70
0.28
consensus_cluster44
consensus_cluster47
0 0.22 consensus_cluster173
1
0.8
0.54
consensus_cluster29
consensus_cluster31
0.38
0.49
0.17 0.47
0.49
consensus_cluster24
0.13 0.87
consensus_cluster26
consensus_cluster27
consensus_cluster33
0.52
0.43
consensus_cluster65
0.38 0.21
0.83
consensus_cluster28
1 0.43
0.99
consensus_cluster35
0.91
0.3
consensus_cluster23
0.67
1
0.54
0.82
0.78
consensus_cluster21
1
consensus_cluster25
gi_Schizosaccharomyces_pombe
Los colores en la Figura 6 indicaron la familia a la cual pertenecen las secuencias: azul
para Glomeraceae, verde para Claroideoglomeraceae, amarillo para Acaulosporeaceae,
rosado para Gigasporaceae).
Figura 7. Arbol filogenético RAxML-EPA para las secuencias de HFMA obtenidas en

este estudio (SSU rDNA). En negro las secuencias de referencia, en azul las secuencias
provenientes de morfoespecies y en rojo las secuencias provenientes de raíces. Parte I.
Familia Glomeraceae.
Rhizophagus
irregularis
Rhizophagus sp7
Rhizophagus sp6
Rhizophagus sp1
Rhizophagus sp5
Capítulo 2 51
Parte II. Continuación. Arbol filogenético RAxML-EPA. Familia Glomeraceae (azul y

verde), Familia Claroideoglomeraceae (aguamarina) y Familia Acaulosporaceae
(Amarillo).
Rhizophagus sp4
Rhizophagus sp3
Glomus sp
Rhizophagus sp2
Claroideoglomus sp
Acaulospora sp2
Acaulospora sp1
Acaulospora sp3
Parte III. Continuación. Arbol filogenético RaxML-EPA.Continuación Orden taxonómico

Diversisporales.
Scutellospora
cerradensis
Capítulo 2 53
a) Descripción de la comunidad intraradical de HFMA en el

experimento No. 1
Para este primer experimento, de las 24 muestras compuestas de raíces de yuca, 21

muestras fueron utilizadas en una librería de ADN para su procesamiento por Illumina
Miseq®. Con estas 21 muestras, cada tratamiento tuvo entre 3 y 4 réplicas.
Figura 8. Estructura de la comunidad intraradical de HFMA en plantas de yuca en la

región de estudio. Solo se incluyen especies con una frecuencia intraradical mayor del
1%.
En la comunidad intraradical de HFMA de las plantas de yuca analizadas, se encontró

que Rhizophagus fue el género dominante, ocupando en promedio el 93% en todas las
plantas analizadas (Figura 7). Un gran grupo de OTUs agrupados como Rhizophagus
sp1 constituyeron la mayoría, alcanzando en promedio el 61%. Algunos OTUs fueron

identificados como Rhizophagus irregularis, lo cual demuestra que esta especie estaba
presente antes de la inoculación. Se identificó que las especies Claroideoglomus sp,
Glomus sp, Acaulospora sp2 y Scutellospora sp tenían un porcentaje menor al uno por
ciento cada una, en el total de la comunidad intraradical de HFMA.
b) Efecto de la inoculación y la fertilización fosfatada sobre

comunidades de HFMA intraradicales
Analizando la presencia y abundancia de OTUs, se encontró que la inoculación de la

línea comercial de Rhizophagus irregularis, contenida en el producto comercial
Glomygel® afecta la riqueza de las comunidades locales de HFMA, donde el valor más
alto lo presentan las plantas inoculadas. Treinta y cuatro OTUs que aparecen en las
plantas inoculadas no estan presentes en plantas no-inoculadas. Otros índices de
diversidad alfa como el índice de Shannon y la uniformidad también mostraron
diferencias significativas causadas por la inoculación (Tabla 3).
Con los datos agrupados a nivel de especie, el índice de Shannon no mostró diferencias
debidas a la inoculación. Los diferentes niveles de fertilizante fosfatado no afectaron la
diversidad de las comunidades intraradicales de HFMA (Tabla 3).
Análisis multivariados sobre los datos de OTUs y especies, confirmaron que la

inoculación de la línea comercial de R. irregularis tiene un efecto sobre la diversidad de
los HFMA asociados con la variedad de yuca MCOL2737 (PERMANOVA, P: 0.019)
(Figura 9,Anexo 12).
Capítulo 2 55
Tabla 3. Efecto de los tratamientos sobre las comunidades de HFMA en plantas de

Manihot esculenta Cranz bajo condiciones de campo. En la tabla se muestran los
resultados del valor P para los índices de diversidad alfa calculados.
Interacción Fertilizante
ANÁLISIS POR OTUs Inoculación
(Fertilizante*Inoculación) fosfatado
Indice de Shannon 0.618 0.167 *0.014
Uniformidad 0.786 0.050 *0.001
Riqueza 0.455 0.253 *0.010
ANÁLISIS POR Interacción Fertilizante
Inoculación
ESPECIES (Fertilizante*Inoculación) fosfatado
Indice de Shannon 0.190 0.243 0.119
Uniformidad 0.524 0.834 *0.038
Riqueza 0.225 0.070 *0.046
Figura 9. Escalamiento multidimensional no métrico, calculado con el índice de Bray-

Curtis para las comunidades de HFMA, presentes en plantas de yuca, a los 12 meses
después de la siembra, utilizando los datos de OTUs y especies. Grupos que no se
sobrelapan son considerados significativamente diferentes con un valor alfa de 0.05
Utiizando los datos de especies, se realizó el análisis SIMPER para identificar cuales
especies estaban generando las diferencias en el análisis multivariado. Se encontró que
los cambios significativos en la abundancia relativa de Rhizophagus sp1, Rhizophagus
sp4, Rhizophagus sp 6 y Acaulospora sp3, aportan el 79% de los cambios de la
comunidad de HFMA (Figura 10, Anexo 13).
Figura 10. Abundancia relativa de cada especie de HFMA dentro de las raíces de plantas
de yuca. Solo se incluyeron especies con frecuencia promedio mayor al 1%. Los
porcentajes indican la influencia de cada especie sobre la diferencia entre comunidades
de HFMA inoculadas (AMF+) y no inoculadas (AMF-) con una línea comercial de R.
irregularis.
2.4 Discusión
Este es el primer estudio en donde se describe, en condiciones de campo, la comunidad

de HFMA asociadas a plantas de Manihot esculenta Cranz, una planta de interés
agronómico y de importancia en la seguridad alimentaria mundial.
Capítulo 2 57
Los métodos utilizados para el análisis de la comunidad de HFMA, incluyen técnicas

tradicionales para el análisis morfológico de esporas y secuenciación Sanger, así como
métodos de secuenciamiento masivo.
Este es el primer estudio en donde se utiliza metagenómica para evaluar los cambios que
pueden ocurrir en la estructura de la comunidad de HFMA causados por la inoculación
con un hongo alóctono (Rhizophagus irregularis, contenido como línea comercial en el
producto utilizado), en plantas de interés agronómico y en condiciones de campo. La
descripción de la diversidad también se utilizó para evaluar el efecto de otra práctica
agronómica tradicional como es la fertilización fosfatada.
Los resultados de este estudio muestran que la estructura de la comunidad intraradical

de HFMA puede cambiar cuando se inocula con la línea comercial R. irregularis
contenida en el producto Glomygel ® (Figura 10), mientras que la adición de fertilizante
fosfatado no genera ningún cambio en la estructura de esa comunidad (Tabla 3).
1.1.1 Ventajas metodológicas del presente estudio
Los métodos utilizados en este estudio presentan diversas ventajas en comparasión con
los estudios publicados a la fecha que describen la diversidad de HFMA (Öpik et al.,
2006; Bainard et al., 2014; Colombo et al., 2014; Davison et al., 2015). En primer lugar,
para la comunidad intraradical se realizó secuenciamiento masivo utilizando Illumina
MiSeq®, que puede amplificar regiones de ADN de hasta 600 bp y producir un total de
30 millones de secuencias, mientras que para la tecnología 454-GLX, utilizada en la
mayoria de estudios a la fecha, se amplifican secuencias de la misma longitud pero con
una menor profundidad de secuenciamiento, máximo 1.5 millones de secuencias en cada
corrida (Lindahl et al., 2013). Un mayor número de secuencias obtenidas con el uso de
Illlumina MiSeq®, se traduce en un mayor esfuerzo de muestreo y en el análisis de un
mayor número de alelos, información fundamental cuando se está describiendo la

diversidad en el filo Glomeromycota.
En segundo lugar, el uso del algoritmo DBC454 para hacer el agrupamiento de

secuencias en OTUs, es una herramienta que aporta confiabilidad en los OTUs
obtenidos, porque es sensible a la densidad de secuencias en cada cluster y además
utiliza una base de datos de referencia para identificar y seleccionar las secuencias que
pertenecen al filo Glomeromycota (Pagni et al., 2013),
En tercer lugar, el uso de la región genómica SSU rDNA es una ventaja en estudios de
diversidad del filo Glomeromycota, porque la base de datos existente para esta región es
extensa y permite un primer acercamiento a la identificación taxómica por medio de la
similitud de las secuencias, donde un valor del 97% de similitud es aceptable para incluir
secuencias en este filo, lo que no sucede con otras regiones como por ejemplo con LSU
rDNA (Lee et al., 2008). Sin embargo, se debe tomar en cuenta que la región SSU rDNA
también tiene algunas limitaciones. Por ejemplo: subestima la diversidad del filo
Glomeromycota porque no amplifica linages basales (Lumini et al., 2010), puede
amplificar al mismo tiempo ADN de plantas (Alguacil et al., 2011) y hongos de otros filo
(Lee et al., 2008). Las dos últimas limitaciones fueron resueltas en el análisis
bioinformático donde secuencias de plantas u otros organismos diferentes a HFMA
fueron eliminadas. La primera continua siendo una limitación sin superar, inclusive con
las herramientas metodológicas actuales y es una limitante que enfrentan actualmente,
todos los grupos de investigación dedicados al análisis de la diversidad de los
Glomeromycota.
En cuarto lugar, el uso de la estrategia RAxML-EPA también representa una ventaja,

debido a que esta metodología permitió una clasificación a nivel de especie, lo que no fue
posible con la estrategia RAxML básica (Anexo 4, Anexo 6). Este elemento del análisis
es fundamental, principalmente cuando se utilizan herramientas de secuenciamiento de
alto rendimiento, que, sin una aproximacion adecuada, pueden llevar a la sobre/sub-
Capítulo 2 59
estimacion de la diversidad de las comunidades de hongos FMA. Además, el uso de las

secuencias de referencia de Krueguer y col (2012), que representan la taxonomía mas
actualizada, facilitó la identificación de algunos OTUs en especies específicas como
Rhizophagus irregularis y Scutellospora cerradensis. Es necesario resaltar que también
se observó cómo la mayoría de OTUs corresponden a especies aún no descritas, por lo
que su identificación queda incompleta (por ejemplo Rhizophagus sp) y demuestra que
trabajos en diversidad utilizando morfología de esporas y secuenciamiento, son
fundamentales y altamente requeridos.
Finalmente, cuando se amplifica la región SSU rDNA para los morfotipos encontrados en
el suelo rizosférico de plantas de yuca, y tambien se utiliza la misma región para describir
la comunidad intraradical en la planta hospedera, es posible identificar cuales
morfoespecies lograron establecer simbiosis. En teoría, esta estrategia tambien favorece
la asignación taxonómica de secuencias que no han sido anotadas en las bases de datos
(Figura 7).
2.4.1 Efecto de la inoculación con una línea comercial de

Rhizophagus irregularis.
En este estudio experimental en condiciones de campo, se observó un efecto significativo

de la inoculación con Rhizophagus irregularis (línea comercial presente en el producto
Glomygel®) sobre la comunidad de HFMA que estaba en simbiosis con las plantas de
yuca de la variedad MCOL2737.
El uso de metodologías de secuenciamiento masivo, como por ejemplo Illumina MiSeq

utilizada en este estudio, fue una herramienta que aportó mayor confiabilidad en los
resultados, comparado con previos estudios que analizaron los cambios en la comunidad
de HFMA despues de la inoculación en plantas de maiz y alverja utilizando RFLP y
secuenciación Sanger para describir la comunidad de HFMA en condiciones de

invernadero (Antunes et al., 2009; Jin et al., 2013).
Los resultados obtenidos en este estudio aportan información para entender la dinámica
de las comunidades de HFMA despues de la inoculación con R. irregularis, sin embargo
no son extrapolables a ningún otro estudio, debido a que las condiciones del suelo, el
inóculo o la planta pueden afectar la respuesta. Sin embargo, como sugieren (Rodriguez
& Sanders, 2014), se deben realizar estudios donde se incluyan diferentes tipos de líneas
de R. irregularis, diferentes tipos de suelo y variedades de plantas.
2.4.2 Efecto de la fertilización fosfatada
En este estudio se observó una comunidad de HFMA resilente al disturbio causado por la
adición del fertilizante fosfatado (Tabla 3). La mayoría de los estudios donde se involucra
la adición de fosfatos en el suelo, demuestran que al aumentar las concentraciones de P
en la rizósfera se genera una disminución en la riqueza intraradical de especies de HFMA
(Alguacil et al., 2010; Camenzind et al., 2014). Este cambio en la diversidad es explicado
posiblemente porque al incrementar los nutrientes disponibles en el suelo para la planta,
esta reduce el volumen de exudados carbonatados, por lo tanto se limita el crecimiento
de los HFMA (Johnson, 2010; Olsson et al., 2010). En teoría, cuando se disminuye la
cantidad de carbono entregado por la planta, entonces las especies con una mayor
habilidad de competencia, serán las que finalmente permanezcan asociadas (Hepper et
al., 1988; Johnson, 1993).
Sin embargo, los estudios donde se reportan cambios en la estructura de la comunidad

intraradical de HFMA asociados con la fertilización fosfatada, han evaluado experimentos
en campo después de 2 (Camenzind et al., 2014) y 5 años (Alguacil et al., 2010) de
aplicaciones constantes de fertilizantes fosfatados. Esto sugiere que el efecto de la
Capítulo 2 61
fertilización fosfatada sobre la comunidad de HFMA ocurre después de aplicaciones

sucesivas en periodos de tiempo largo (mas de dos años). En este estudio, solo una
aplicación de fertilizante fue requerida para el sistema productivo de yuca, y ocurrió en el
momento de la siembra, sin embargo, la comunidad de HFMA se analizó a los doce
mesesd después de aplicar el fertilizante.. Esta es una información importante a tener en
cuenta en futuros estudios, donde un tratamiento con dosis de fertilizante, se debería
realizar en un cultivo no destructivo que permita aplicaciones sucesivas por mas de un
año.
Aún así, en este estudio la fertilización fosfatada causó diferencias entre tratamientos,
afectando la la densidad total de esporas de HFMA. Se encontró un mayor número de
esporas en los suelos donde no se adicionó fertilizante fosfatado. Resultados similares
fueron obtenidos por Toro (1984), quien utilizando la misma metodología de el presente
estudio (Recuento de esporas de HFMA en suelo rizosférico), analizó el suelo rizosférico
de yuca en la región del Valle del Cauca, Colombia y observó diferencias significativas
en la densidad de esporas, causada por la aplicación de fertilizante fosfatado.
2.4.3 Diversidad de HFMA en el espacio intra y extraradical

asociados a plantas de yuca.
El análisis metagenómico de la región SSU rDNA utilizando la tecnología Illumina

MiSeq®, fue útil para describir la comunidad intraradical de HFMA, con una alta
profundidad en el secuenciamiento. Se encontró una alta riqueza con 65 OTUs,
comparado con lo encontrado en otros estudios donde analizan comunidades de HFMA
en regiones templadas, utilizando diferentes técnicas de análisis como T-RFLP para la
región SSU rDNA (Dumbrell et al., 2010) y 454-pirosecuenciación GS-FLX tanto de la
región SSU rDNA (Lumini et al., 2010; Saks et al., 2014) como LSU rDNA (Camenzind et
al., 2014; Horn et al., 2014), donde se reportan comunidades con mas de 50 OTUs.
De los 65 OTUs encontrados en este estudio, 77% corresponden por analisis

filogenético, al orden Glomerales, lo cual está acorde con lo encontrado en otros estudios
donde claramente los Glomerales dominan las comunidades intraradicales (Öpik et al.,
2009; Davison et al., 2011; Lekberg et al., 2013).
La abundancia de Rhizophagus sp en comunidades intraradicales se ha descrito tanto en

ecosistemas disturbados, como en ecosistemas no intervenidos (Öpik et al., 2006;
Appoloni et al., 2008; Lekberg et al., 2013). La abundancia de Rhizophagus sp también
se presenta en diferentes hospederos (Helgason et al., 2007), sugiriendo que las
especies de Rhizophagus sp se adaptan y logran sobrevivir en diferentes ambientes, por
lo tanto tienen un estilo de vida generalista (significa que es tolerante al disturbio y
permanence viable en el suelo). Aunque se ha señalado que este tipo de organismos
producen un gran número de esporas en el micelio extraradical (Öpik et al., 2006), esto
no se presentó en este estudio, porque el espacio extraradical fue dominado por esporas
de Claroideoglomus sp, otra especie en el orden Glomerales (Figura 4).
En el orden Diversisporales, la especie mas frecuente en las raíces de yuca fue

Acaulospora sp, representando el 6% de la comunidad. Se ha reportado que en los
suelos ácidos, Acaulospora sp es la especie dominante (Oehl et al., 2010; Veresoglou et
al., 2013; Camenzind et al., 2014; Senes et al., 2015), y también produce una gran
cantidad de esporas en el suelo (Hart & Reader, 2002; Brundrett & Ashwath, 2013; Leal
et al., 2013; Stürmer & Siqueira, 2011; Turrini & Giovannetti, 2012). Sin embargo, en este
estudio la presencia de Acaulospora sp no fue dominante en ninguno de los dos
ambientes (raices y suelo rizosférico) donde se pueden encontrar los HFMA.
Algunos estudios de las comunidades HFMA utilizando técnicas moleculares, han

reportado la dificultad de detectar OTUs de los órdenes Paraglomerales y
Archaeosporales en las muestras de raíces (Hijri et al., 2006; Alguacil et al., 2008). Esta
dificultad se puede explicar porque especies de Paraglomus sp y Archaeospora sp se
encuentran en baja abundancia en la comunidad de HFMA y por lo tanto se disminuye la
Capítulo 2 63
posibilidad de ser amplificadas en una reacción de PCR. De igual manera, se ha

demostrado que los cebadores seleccionados para la amplificación de secuencias de
HFMA tienen baja especificidad para especies de Paraglomerales y Archaeosporales
(Lee et al., 2008). Por lo tanto, al reportar que estas especies no fueron encontradas en
este estudio, no se puede intrepretar como la ausencia en la comunidad, sino como un
sesgo metodológico.
Se ha descrito que Paraglomerales y Archaeosporales son los linages mas basales en el

filo Glomeromycota, pero muy poco se conoce sobre el papel funcional de estos ordenes
en el ecosistema. En futuros estudios, en donde el objetivo sea estudiar la funcionalidad
de especies de algunos de estos órdenes, se podría utilizar la región rDNA completa
(SSU-ITS-LSU), que se ha demostrado puede amplificarlos en muestras ambientales
(Schlaeppi et al., 2016).
En la descripción de la comunidad extraradical, basada en la identificación de esporas

por morfología y por secuenciación Sanger, se encontraron 37 morfoespecies agrupadas
en 12 especies, lo cual sugiere un valor de riqueza bajo comparado con otros estudios.
Excepcionalmente, Strümer & Siqueira (2011) han reportado el número más alto de
morfoespecies, para un total de 61 en suelos del Amazonas. Sin embargo, otros autores
han encontrado 39 morfoespecies en los Andes chilenos (Castillo et al., 2006), 36
morfoespecies en el bosque amazónico de Brazil (Leal et al., 2013), 37 morfoespecies en
los bosques de México (Violi et al., 2008) (Violi, et al., 2008). Otros estudios han
reportado un menor número, por ejemplo 13 morfoespecies en un suelo de Costa Rica
(Lovelock et al., 2003), 18 morfoespecies en pasturas de México (Gavito et al., 2008;
Aguilar-Fernandez et al., 2009; Guadarrama et al., 2014). En Colombia 18 morfoespecies
se encontraron en bosques húmedos tropicales (Peña-Venegas et al., 2007), de 17 a 35
morfoespecies en suelos agrícolas donde se cultiva Physalis peruviana (Ramirez, 2014) y
41 en suelos de la amazonía asociados a poblaciones semi-naturales de yuca (Leon,
2015).
De los 37 morfotipos encontrados, 86% fueron identificados por sus características

morfológicas y ubicados al menos a nivel de orden taxonómico. Se ha reportado que
hasta un 30% de los morfotipos en un suelo puede quedar sin identificación (Stürmer &
Siqueira, 2011), debido a que algunas esporas provenientes de campo están
parasitadas, han perdido su contenido y no logran multiplicarse en cultivos trampa.
No se identificaron morfoespecies con presencia exclusiva para algún tratamiento. La

abundancia de morfoespecies encontradas que pertenecen a la familia Glomeraceae (30
de un total de 37) sugiere un amplio rango de tolerancia de esta familia a condiciones
ambientales, lo cual ha sido reportado previamente (Stürmer & Siqueira, 2011).
Diversos estudios conducidos en suelos de uso agrícola han reportado variabiliad en el

grado de dominancia de algunos géneros de HFMA, donde los suelos con mayor
labranza y uso intensivo presentan a la familia Glomeraceae, particularmente el género
Glomus sp, como el género dominante (Bhadalung et al., 2005; Mathimaran et al., 2005;
Oehl et al., 2010). Por clasificación morfológica y molecular se identificó que en este
estudio, Claroideoglomus sp es la especie dominante con una presencia de mas del 50%
en promedio, tanto en las muestras inoculadas como en las no inoculadas.
Rabelo y cols (Rabelo Pereira et al., 2014) y Guadarrama-Chávez y cols (Guadarrama et

al., 2014), han reportado que esporas de las familias Glomeraceae y Acaulosporacea
predominan en la rizosfera, ocupando entre las dos, del 50 al 80% del total de la
comunidad de HFMA. En la región amazónica de Brazil, se ha encontrado que las
comunidades en el suelo estan dominadas por especies de Glomus, mientras que
Acaulospora es uno de los géneros que mas produce esporas (Strümer & Siqueira,
2011). Otros estudios con plantas de maíz y aguacate sembrados en Andisoles, han
reportado que el género predominante en el suelo es Acaulospora sp (González-Cortés
et al., 2012). Reportes de Sieverding (1991) describen que la comunidad de esporas de
HFMA en suelo rizosferico de plantas de yuca en Colombia, estaba representada en mas
Capítulo 2 65
de un 80% por esporas de Acaulospora sp. De forma contrastante, en este estudio, las
esporas de Acaulospora sp representaron solamente el 3% de la comunidad.
2.4.4 Comparación de la comunidad de HFMA intra y extraradical
De las treinta y siete morfoespecies encontradas en la rizósfera de las plantas de yuca,

solo dos se encontraron colonizando las raíces. Estos resultados sugieren que no existe
una relación directa entre las morfoespecies más abundantes en la rizosfera y la
colonización intraradical.
Estudios previos han observado que la estructura de las comunidades de HFMA es

diferente en cada uno de los compartimentos donde los HFMA pueden ser analizados
(raíces o suelo) (Clapp et al., 1995; Hempel et al., 2007) y que las plantas son
colonizadas por una proporción del total de especies de HFMA encontradas en la
rizosfera (Öpik et al., 2009; Chagnon et al., 2013).
Lo anterior puede explicarse ya sea porque no todos los propágulos de HFMA están
activos al momento del muestreo y/o durante un ciclo de observación, por las diversas
estrategias de vida de los HFMA (Sýkorová et al., 2007), la habilidad de habitar los
espacios en el suelo (suelo y raíces) y acumular biomasa intra o extraradicalmente (Hart
& Reader, 2002).
Por ejemplo se ha encontrado que las especies de Glomus del grupo A, al cual pertenece
Rhizophagus sp presente en la comunidad intraradical, tienen como propagulos infectivos
esporas, hifas en el suelo o raíces colonizadas, mientras que otros géneros como
Acaulospora, Scutellospora y Gigaspora necesitan de la germinación de una espora para
colonizar la raíz (Gazey et al., 1993; Brundrett et al., 1999).
En este estudio, la especie Scutellospora cerradensis presente dentro de la raíz de yuca,

no se identificó en la comunidad de esporas. Este resultado se puede relacionar con el
ciclo de vida de esta especie, caracterizada por una “estrategia K”, por lo tanto produce
un bajo número de esporas lejos de la raíz (Voets et al., 2009). Por otro lado, especies
del género Diversispora sp solo se encontraron en el espacio extraradical.
Lo anterior se podría explicar por procesos de selección dirigidos por alguno de los dos
simbiontes (planta u hongo). También se ha reportado que existen procesos de selección
dirigidos por alguno de los dos simbiontes (planta u hongo). Estos procesos de selección
no han sido descritos completamente para la simbiosis micorrícica. Una interacción
especie-específica se ha descartado, sin embargo se sugiere que la selectividad del
simbionte puede ocurrir a nivel de grupos ecológicos, por especies generalistas que se
asocian con un gran número de organismos o por especialistas que se asocian con un
número selecto de organismos (Davison et al., 2011; Öpik Maarja & Moora, 2012). En
este caso, la planta de yuca se pudo comportar como especialista que se asocia con un
número selecto de géneros. Se ha reportado que la planta selecciona especies de HFMA
que le generan un mayor beneficio, generalmente nutricional, durante su interaccion
(Vandenkoornhuyse et al., 2003; Veresoglou & Rillig, 2014).
2.5 Conclusiones
Este es el primer estudio en donde se describe la comunidad de HFMA asociada a

plantas de yuca mantenidas en campo bajo un sistema comercial y a unos rendimientos
agronómicos obtenidos en condiciones de campo y donde se evalúa la dinámica de las
especies bajo dos agentes disturbantes como la fertilización fosfatada y la inoculación
con R. irregularis, utilizando las dos aproximaciones existentes para el estudio de
comunidades de HFMA: análisis morfológico de esporas en el espacio extraradical, con
secuenciamento Sanger y en paralelo, el análisis metagenómico para la comunidad
intraradical.
Capítulo 2 67
Se estableció que la riqueza de la comunidad intraradical de HFMA aumenta y hay una

fluctuación en la abundancia de las especies cuando se introduce una especie alóctona
de la R. irregularis. Por otro lado, la fertilización fosfatada no genera cambios en la
estructura de la comunidad tanto intra como extraradical de los HFMA.
Adicionalmente, los resultados de este estudios demuestran que no existe una relación
directa entre las morfoespecies mas abundantes en la rizósfera y la colonización
intraradical.
Rhizophagus sp establece una asociación simbiótica con la planta de yuca y ocupa mas
del 60 % de la comunidad intraradical. Los resultados mostrados en este experimento
solo serían aplicables a la línea comercial de R. irregularis utilizada y no se pueden
extrapolar y afirmar que todos los aislados de esta especie de hongo tendrán el mismo
efecto sobre cultivos de yuca en campo. Rodriguez & Sanders (2014) sugieren que para
comprender un poco más sobre la ecología de las comunidades de HFMA, se deberían
realizar estudios a gran escala que incluyan diferentes tipos de suelo, aislados
geneticamente diferentes y diferentes hospederos.
Diferentes OTUs reportados, fueron clasificados a nivel de género como Rhizophagus sp,
pero no se pudieron clasificar a nivel de especie debido a la alta diversidad que presenta
este género y es una evidencia de que la diversidad en este género no ha sido
completamente descrita.
Debido a que los experimentos en campo pueden tener una alta variabilidad, se sugiere
que repeticiones biológicas de este experimento sean realizadas con el fin de observar la
reproducibiliadd de los cambios reportados.
3. Diseñar una estrategia metodológica para
evaluar la diversidad poblacional del hongo
Rhizophagus irregularis en simbiosis con
plantas de yuca en campo
3.1 Introducción
En las últimas dos décadas, el uso de Rhizophagus irregularis como biofertilizante ha

aumentado significativamente (Faye et al., 2013; Verbruggen et al., 2013). Esto se debe
a los resultados positivos que se han obtenido en ensayos experimentales, donde el
crecimiento y la nutrición de la planta hospedera se ven favorecidos con la inoculación de
R. irregularis (Sieverding, 1991; Wagg et al., 2011; Ceballos et al., 2013; van der Heijden
et al., 2015).
Algunos estudios han demostrado que R. irregularis es una especie ubicua en los suelos
agrícolas (Davison et al., 2015) y que la población de R. irregularis tiene una alta
variabilidad genética (Börstler et al., 2008, 2010; Croll et al., 2008b; Wyss et al., 2016).
Una población local de R. irregularis esta conformada por un número indeterminado de
individuos. En este documento, se denominan líneas o aislados de R. irregularis cuando
una espora ha sido recuperada del suelo y a partir de esta, se han obtenido generaciones
del hongo a partir de una “unica espora” mediante la técnica de cultivo in-vitro (Bécard &
Fortin, 1988). Por lo tanto, para las líneas de R. irregularis utilizadas en este estudio, se
conoce información sobre su biología y genética (Koch et al., 2006; Croll et al., 2008b;
Croll & Sanders, 2009; Wyss et al., 2016).
Se ha demostrado que las líneas de R. irregularis tienen un efecto diferencial sobre el

crecimiento de la planta hospedera (Angelard et al., 2010), lo cual sugiere que la
diversidad intra-específica de R. irregularis es importante desde el aspecto biológico,
ecológico y agronómico (Rodriguez & Sanders, 2014).
Sin embargo, a la fecha no se tiene información sobre las diferencias genéticas entre
individuos de una población de R. irregularis en un suelo agrícola del trópico. Tampoco
se conoce si las líneas de R. irregularis utilizadas como inóculo tienen una información
genética diferente a la población ya establecida en el suelo.
Por lo tanto, introducir un aislado no-nativo de R. irregularis en un sitio donde R.

irregularis ya está presente, puede resultar en la adición, no de una especie, pero si de
un nuevo material genético (nuevos alelos).
Para identificar si existe la probabilidad de introducir nuevos alelos en una población de

R.irregularis como consecuencia de la inoculación, es necesario describir la diversidad de
la población local de R. irregularis y compararla con la diversidad del hongo inoculado.
Para resolver esta pregunta de investigacion, el objetivo de este capítulo fue plantear una
estrategia metodológica que permita describir la población local de R. irregularis en un
suelo agrícola. La información genética de diferentes líneas de R. irregularis aisladas de
diferentes regiones alrededor del mundo, fue utilizada como una base de datos, para
identificar regiones polimórficas que permitieran la clasificación de grupos genéticos
(aislados que comparten información genética). Para cada grupo genético se identificaron
SNPs, inserciones y deleciones con el fin de generar marcadores moleculares que
permitan detectar la presencia o ausencia de un grupo genético en una población de R.
irregularis.
Capítulo 3 71
3.2 Metodología
3.2.1 Material fúngico
El genoma de cincuenta y siete líneas de R. irregularis, fue secuenciado por el grupo de

Ecología y Evolución de Organismos Simbiontes de la Universidad de Lausanne, Suiza,
mediante el secuenciamiento de ADN asociado a sitios de restricción (RAD-seq,
restriction site-associated DNA sequencing), utilizando las enzimas MseI y EcoRI,
siguiendo la metodología descrita por Wyss y colaboradores (2016).
La procedencia de cada línea se encuentra descrita en la Tabla 4. Utilizando la

información proveniente del RAD-seq, se seleccionaron los sitios polimórficos y se
identificaron grupos genéticos (Romain Savary y Frederic Masclaux. Comunicación
personal, 2016. Datos no publicados).
3.2.2 Búsqueda de regiones polimórficas y diseño de cebadores
Los polimorfismos en un solo nucleótido (SNP, single nucleotide polimorfism) e

inserciones/deleciones fueron detectadas para cada grupo genético, utilizando el
programa FreeBayes (Garrison & Marth, 2012). Se seleccionaron los SNPs que
estuvieran en regiones con una profundidad de 10x y con una calidad en escala Phred de
30 puntos.
Se recuperó una secuencia de 500-700 bp donde se incluía el SNP y se diseñaron

cebadores para amplificar estas regiones con el programa Primer3 (Untergasser et al.,
2012). Los cebadores para cada grupo genético fueron filtrados por características
intrínsecas (Tm, %CG, formación de dímeros). Utilizando la herramienta en línea Primer-

BLAST del NCBI (Ye et al., 2012), se evaluó que cada pareja de cebadores no
amplificara otras regiones del genoma de R. irregularis (assembly ASM159312v1,
(Tisserant et al., 2013)) ni otros organismos del suelo.
3.2.3 Identificación de grupos genéticos en muestras de campo
Inicialmente se comprobó que los cebadores amplificaban el ADN de líneas de

Rhizophagus irregularis (A1, B, C). Por lo tanto, el ADN de estas líneas, fue extraído
siguiendo el protocolo descrito por Wyss y colaboradores (2016). Brevemente, los
aislados cultivados in vitro en asociación con raíces de zanahoria transformadas con el
plásmido Ri de Agrobacterium tumefaciens (Bécard & Fortin, 1988), fueron dispuestos en
cajas de dos compartimentos con el objetivo de disponer las hifas y esporas del hongo en
un espacio físico fácil de extraer (St-Arnaud et al., 1996). Después de cuatro meses de
crecimiento a 25ºC, el compartimento donde creció el hongo se disolvió en un buffer de
citrato (450 ml de agua destilada desionizada (ddH2O), 8,5 ml de ácido cítrico 0.1 N, 41.5
ml de citrato de sodio 0.1 N), durante 1.5 horas. El pellet resultante fue colocado en un
tubo de polipropileno de 1.5 ml y lavado con ddH2O. Para la extracción de ADN se utilizó
el kit de extracción DNeasy Plant Mini kit® (Quiagen) siguiendo el protocolo del
fabricante.
Para identificar grupos genéticos de R. irregularis presentes en las raíces de yuca en

campo, se utilizaron muestras de raíces de la variedad MCOL2737 crecidas en los suelos
de la Orinoquía colombiana, en un campo experimental donde se aplicó el 50% de
fertilizantes de acuerdo con los requerimientos tradicionales del cultivo, recolectadas a
los 12 meses después de la siembra de la planta, lo que corresponde a la cosecha (Ver
experimento del capítulo 4, muestreo de raíces en plantas no inoculadas). La extracción
del ADN de estas raíces se realizó siguiendo la descripción del numeral 2.2.5 de este
documento.
Capítulo 3 73
Tabla 4. Líneas de Rhizophagus irregularis con genoma secuenciado organizadas por

grupos genéticos. Se indica el número de réplicas utilizadas en el secuenciamiento RAD-
seq y utilizadas para calcular el polimorfismo entre grupos. *ND= no determinado
Grupo 1 Origen réplicas Grupo 5 Origen réplicas

5B ND 5 A1 Suiza 3
7B ND 4 A5 Suiza 3
ESLQS69 ND 3 B1 Suiza 3
LPA54 Dinamarca 4 B2 Suiza 3
SAMP7 ND 2 B3 Suiza 3
B4 Suiza 3
Grupo 2 Origen réplicas B7 Suiza 3
BEG140 R. Checa 5 B8 Suiza 2
Israel Israel 3 B10 Suiza 3
PH5 R. Checa 2 B11 Suiza 3
P33PC ND 3 B12 Suiza 3
B14 Suiza 3
Grupo 3 Origen réplicas B15 Suiza 3
BEG72 R. Checa 5 B17 Suiza 3
B22 Suiza 3 CAN Canadá 5
IRTA102 España 3 D1 Suiza 3
KUVA ND 4 D2 Suiza 3
D3 Suiza 3
Grupo 4 Origen réplicas D4 Suiza 3
A2 Suiza 3 E1 Suiza 3
A3 Suiza 3 F1 Suiza 3
A4 Suiza 3 Glam ND 4
BEG53 R. Checa 4 G1 Suiza 3
BEG144 Rusia 5 India1105 India 7
C3 Suiza 3 DAOM- Canadá 3
Miroslave
C4 Suiza 3 DAOM234180 Canadá 2
DAOM229457 Canadá 5 DAOM234181 Canadá 3
DAOM240409 Canadá 3 DAOM234328 Canadá 1
LPA9 Dinamarca 3 DAOM240158 Canadá 3
DAOM240443 Canadá 1
Grupo 6 Origen réplicas DAOM240448 Canadá 2
C1 Suiza 3 DAOM240721 Canadá 2
C2 Suiza 3
C5 Suiza 3
FL707B ND 2
La reacción de PCR para cada pareja de cebadores seleccionada, se realizó en un

volumen final de 25 ml, utilizando 0,2 mM de dNTPs y 0,5 mM de cada cebador y 0.5 U
de Taq Polimerasa. Las condiciones del proceso de amplificación fueron: 94°C por 3 min,
30 ciclos de 1 min de denaturación a 94°C, 1 min de hibridación de cebadores con una
temperatura específica para cada pareja y 1 min de extensión a 72°C, seguido por una
extensión final de 72°C por 10 min.
El calculo de la temperatura de asociación (anneling temperature Ta) para cada pareja de

cebadores se realizó según lo descrito por Breslauer y cols (Breslauer et al., 1986),
utilizando la herramienta online de Thermo Scientific (https://goo.gl/aA0ka8). Con los
cebadores que no amplificaron, se realizó un gradiente de temperatura para seleccionar
el valor mas preciso donde los cebadores lograran amplificar la región específica.
Los amplicones fueron purificados utilizando el kit comercial (The Wizard® SV Gel y PCR
Clean-Up System, Promega) y enviados a secuenciación por Sanger en Macrogen Inc
(Corea). Las secuencias fueron alineadas en el programa MEGA6 (Tamura et al., 2013) y
comparadas contra la secuencia del genoma de referencia (R. irregularis DAOM197198)
para comprobar la presencia del polimorfismo en las muestras
3.3 Resultados
Se identificaron polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), encontrando entre 4 y 15

SNPs para cada grupo genético. No se identificaron inserciones o deleciones y tampoco
regiones con más de un SNP, lo cual aportaría una facilidad metodológica.
Capítulo 3 75
Para cada SNP se obtuvieron entre 1 y 3 pares de cebadores, los cuales fueron
descartados cuando no cumplían con las características deseadas (Tm, %CG, formación
de dímeros y/o amplificación en otras partes del genoma de R. irregularis u otros
organismos). Para algunos SNPs se eliminaron todos los cebadores con lo cual se
eliminaba tambien la posibilidad de usar ese SNP en la caracterización de la población
de R. irregularis.
Para el grupo 5, que estaba compuesto por un mayor número de aislados comparado
con los otros grupos, se seleccionaron 4 SNPs. Mientras que en otros grupos con 4 y 5
aislados, como es el caso de los grupos 1, 2 y 3, se seleccionaron entre 14 y 15
polimorfismos (Tabla 4 y 5).
Después de filtrar los cebadores de acuerdo con las características requeridas, se redujo
el número de potenciales SNPs en aproximadamente el 50% (Tabla 5, Anexo 9).
Tabla 5. SNPs identificados para cada grupo genético
Número inicial de
Grupo genético SNPs eliminados SNPs finales*
SNPs identificados
1 14 7 7
2 14 7 8
3 15 6 9
4 - - -
5 4 1 3
6 4 2 2
Para el grupo 5 se identificó un subgrupo que incluye los aislados C1, C2, C5 y FL707B,
que fue denominado grupo 6. Independientemente de los SNPs identificados para el
grupo 5, se identificaron cuatro SNPs para el grupo 6 y se diseñaron cebadores que
fueron filtrados bajo los parámetros mencionados anteriormente. Dos parejas de
cebadores fueron seleccionadas (Tabla 6, Anexo 9) y se utilizaron para evaluar la
presencia de R. irregularis del grupo genético 6, en las raíces de yuca de campo.
Tabla 6. Cebadores seleccionados para amplificar R. irregularis del grupo genético #6 en

muestras de raíces de yuca. Los cebadores llevan la misma nomenclatura de la región
genómica donde fueron ubicados. Ta-calc: Ta calculada. Ta-grad: Ta por gradiente de
temperatura.
Cebador Secuencia 5’-3’ Ta - calc Ta- grad

Scaffold 23 Directo: ACATAGGGTATTGAGTCTGGCT 49.6 57.7
Reverso: AACTTATGGGGTTGCTAGAGTT
Scaffold 1268 Directo: ACGTTCAAATGACGCTGTTGTT 51.6 54.7
Reverso:ATGCTGAGGTTCCTGGATTGTT
Se confirmó que los polimorfismos detectados in-silico estaban presentes en muestras de

ADN del aislado C2. También se confirmó que los polimorfismos no estaban presentes
en otras líneas de R. irregularis como A2, B1 y D1. En la Figura 10 se puede observar
que en la posición 352 del alineamiento, el nucleótido correspondiente para el grupo
genético #6 es Timina (T), mientras que para aislados de otros grupos corresponde una
Guanina(G).
Figura 11. Polimorfismo de un solo nucleótido en el aislado del grupo genético #6 (R.
irregularis C2) ubicado en el Scaffold23.
Para el SNP en el Scaffold1268, también se confirmó la presencia del polimorfismo en las

muestras de ADN del aislado C2, que correspondía al nucleótido Guanina en la posición
351 del alineamiento (Figura 11, muestra DNA_C2). Cuando se amplificó el ADN de
raíces de yuca de campo no inoculadas, en la posición 351 tambien se detectó el
nucleótido Guanina. Sin embargo, otros polimorfismos fueron observados en el mismo
amplicón, presentes en la posición 292, 311, 331, 339-341, 349, 350, 352 y 353, lo cual
Capítulo 3 77
sugiere que estas secuencias no pertenecen a la especie R. irregularis (Alineamiento

completo, Anexo 15).
Aunque in-silico se intentó identificar si los cebadores utilizados amplificaban el ADN de

otras especies, es posible que otros hongos endófitos que no están en la base de datos
utilizada (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, NCBI) hayan sido amplificados, como por ejemplo
otras especies de HFMA cuyo genoma no ha sido evaluado a la fecha. La comparación
directa de las secuencias marcadas como “DNA_Roots” no mostró una similitud con
ninguna secuencia presente en las bases de datos. Entonces se descarta que
pertenezcan a Lichtheimia ramose o Bipolaris oryzae que fueron amplificados in-silico
con la herramienta Primer-BLAST (Anexo 9).
Figura 12. Polimorfismo en un solo nucleotido en el grupo genético #6, ubicado en el

Scaffold 1268.
3.4 Discusión
Este estudio es la primera aproximación metodológica para describir una población de R.

irregularis sin incluir el proceso tradicional que incluye aislamiento de individuos a partir
de esporas, el uso del cultivo in-vitro para HFMA y el secuenciamiento del genoma. Este
proceso tradicional puede tardar, al menos, entre 2 y 5 años y además representa una
alta inversión de recursos (Anexo 16).
La caracterización de la diversidad poblacional de R. irregularis se propuso en este

estudio con el fin de obtener herramientas para identificar el efecto de la adición de
material genético a una población de R. irregularis local, como consecuencia de la
inoculación. Esta clase de estudios se vuelven viables, toda vez que las tecnologías de
secuenciamiento han bajado sus costos y por lo tanto es posible secuenciar el genoma
de un alto número de aislados para la posterior busqueda de polimorfismos. Desde un
esfoque biotecnológico, la necesidad de los estudios poblacionales de R. irregularis ha
cobrado mayor interés, debido a que se ha demostrado que la variabilidad intraespecífica
es más importante que la variabilidad entre especies y beneficios en la planta hospedera
son más contrastantes inoculando líneas de R. irregularis que inoculando diferentes
especies de Rhizophagus sp u otras especies (por ejemplo Munkvold et al., 2004).
Estudios de la diversidad poblacional en los hongos del filo Glomeromycota han sido
limitados por tres factores. Primero, la incapacidad de distinguir aislados de la misma
especie con base en las características morfológicas, por lo tanto el estudio poblacional
en los HFMA se ha enfocado en el desarrollo de herramientas moleculares que permitan
medir la variabilidad genética. En segundo lugar, la dificultad de cultivar los HFMA en
sistemas eficientes (por ejemplo sistemas in-vitro) y tener suficiente biomasa del hongo
para el aislamiento de ADN, sin extraer al mismo tiempo el ADN de la planta. Este
problema fue solucionado solamente hasta el año 1996, donde St Arnaud y
colaboradores utilizaron una caja de petri con dos compartimentos para separar la
biomasa del hongo de las raíces transformadas. Una vez se logró estandarizar el cultivo
in-vitro se pudo obtener suficiente ADN para el secuenciamiento del genoma de
referencia (Tisserant et al., 2013).
En tercer lugar, la falta de conocimiento sobre la biología y genética del hongo. En el año
2015 solo se había secuenciado el genoma de un aislado de R. irregularis, conocido
como DAOM 197198 (Tisserant et al., 2013; Lin et al., 2014). Recientemente, el grupo del
profesor Sanders en la Universidad de Lausanne publicó el genoma de diescinueve
aislados de R. irregularis secuenciados con RAD-seq (Wyss et al., 2016), una técnica
Capítulo 3 79
que amplifica regiones del genoma con alta profundidad (más de 50x) lo que favorece la
confiabilidad en los polimorfismos encontrados.
Por otra parte, algunas regiones del genoma se han utilizado para diferenciar individuos
de R. irregularis. Por ejemplo, la región mitocontrial ribosomal mtLSU rDNA se puede
usar para diferenciar multiples cepas de R. irregularis (Börstler et al., 2010; Sýkorová et
al., 2012). Otras regiones del genoma mitocondrial tambien han sido utilizadas para
describir la diversidad poblacional de R. irregularis. Por ejemplo, Croll y colaboradores
(2008) evaluaron la diferencia genética de la población de R. irregularis, utilizando 48
aislados y los intrones 1 y 2 de la region mtLSU, donde se clasificó la población de R.
irregularis en 3 grupos genéticos, lo cual parece subestimar la variabilidad en esta
especie.
Genomas mitocondriales completos de R. irregularis secuenciados a la fecha han

mostrado que no hay polimorfismo dentro del mismo aislado, pero si se observan
diferencias en el tamaño y la secuencia entre aislados (Formey et al., 2012). Esto sugiere
que en futuros estudios, el genoma mitocondrial completo podría ser una alternativa para
evaluar las poblaciones de R. irregularis en campo.
Otra estrategia para describir la población de R. irregularis puede ser el uso de la región
completa del operon rDNA de 1.5 kb de longitud (Krüger et al., 2012; Schlaeppi et al.,
2016) para diferenciar aislados, y con el uso de nuevas técnicas de secuenciamiento
masivo como el secuenciamiento de una molécula simple en tiempo real (single molecule
real-time, SMRT) de la compañía Pacific Biosciences, se pueden amplificar fragmentos
largos de hasta 20 kb (Carneiro et al., 2012). Esto permitiría el analisis no solo de la
población de R. irregularis sino tambien de la comunidad de HFMA.
3.5 Conclusiones
En este estudio se identificaron marcadores moleculares que permiten evaluar la

presencia de diferentes grupos genéticos de la especie R. irregularis en muestras de
campo.
Los SNPs identificados en el genoma de R. irregularis podrán ser utilizados para describir
la diversidad poblacional de esta especie en suelos agrícolas y también para evaluar las
diferencias alélicas entre los aislados inoculados y los aislados locales.
Estudios posteriores deben establecer el número de SNPs que deben ser confirmados
para clasificar los aislados en los grupos genéticos.
4. Evaluar el efecto de diferentes líneas de
Rhizophagus irregularis introducidas como
inóculo sobre la comunidad de HFMA
asociadas a plantas de yuca en campo.
4.1 Introducción
En el filo Glomeromycota, la especie Rhizophagus irregularis ha sido la más estudiada a

diferentes niveles, desde análisis genómicos (Hijri & Sanders, 2005; Tisserant et al.,
2013; Lin et al., 2014; Wyss et al., 2016), hasta el funcionamiento de la simbiosis en
experimentos en condiciones de campo (Sieverding, 1991; Ceballos et al., 2013).
Los estudios en ciencia básica se han enfocado en entender la biología de R. irregularis y

la organización de la información genética. Rhizophagus irregularis se ha clasificado
como un hongo asexual que se reproduce clonalmente, tiene hifas cenocíticas y esporas
multinucleadas (Smith & Read, 2008; Marleau et al., 2011), donde a la fecha la hipótesis
de homocariosis y heterocariosis no han sido completamente comprobadas ni
descartadas (Kuhn et al., 2001; Pawlowska & Taylor, 2004; Sanders & Croll, 2010).
Diversas investigaciones han reportado que existe una alta variabilidad genética entre los
diferentes aislados de la especie R. irregularis (Koch et al., 2004), causada posiblemente
por fenómenos de segregación y anastomosis (Croll et al., 2009; Angelard et al., 2010).
Estos mecanismos se han utilizado en el grupo de investigación del Profesor Ian Sanders
(Universidad de Lausanne, Suiza), para generar nuevas líneas de R. irregularis que son
genéticamente diferentes de sus parentales. Inicialmente, tres líneas fueron aisladas de
suelos de praderas en Tanikon, Suiza (Koch et al., 2004), introducidas en el sistema in-
vitro, donde raíces transformadas de zanahoria fueron utilizadas como hospedero
(Bécard & Fortin, 1988). Estas tres líneas (tres aislados diferentes), conocidas como
“líneas parentales” fueron utilizadas en experimentos in-vitro donde el proceso de
anastomosis (fusión de hifas) fue favorecido para producir nuevas esporas (Croll et al.,
2008a) que serán denominadas en este documento como “líneas de primera generación”.
Cuando una espora de una línea de primera generación fue colocada en un nuevo medio
de cultivo in-vitro, se produjeron nuevas esporas por medio de segregación (Croll et al.,
2010 las identifica como líneas segregadas), de esta forma se generaron lo que se
denominaran en este documento como “líneas de segunda generación” (Anexo 16). En
ambos casos los cultivos in vitro fueron iniciados con una única espora cada vez y por lo
tanto se conocen como “single spore culture” de primera o de segunda generación. A
pesar que originalmente se habían establecido estas líneas genéticas sobre la base de
que existían procesos de cruce y segregación, recientes estudios llevados a cabo por el
grupo del profesor Sanders han demostrado que no es posible determinar la existencia
de líneas cruzadas por cuanto no hay un aporte en proporción adecuada, por parte de
ambos parentales (Estudios no publicados, comunicación personal Ian Sanders).
La posibilidad de obtener líneas nuevas de R. irregularis en el laboratorio es una

estrategia que presenta diversas ventajas, como por ejemplo: facilidad para el análisis de
genómico y transcriptómico del hongo, conocer la información genética del organismo
que se está utilizando como inóculo, la certeza de producir propágulos activos en una
alta concentración, la facilidad de propagar las líneas en condiciones asépticas para su
aplicación en experimentos en campo e invernadero.
Experimentos en invernadero y en campo han demostrado la diversidad funcional de las

diferentes líneas de R. irregularis, las cuales pueden o no generar un beneficio a la planta
Capítulo 4 83
hospedera. Angelard y cols (2011) y Ceballos (2016, datos no publicados, Tesis

Doctorado) (Ceballos, 2016) mostraron que la inoculación sobre plantas de arroz y yuca,
respectivamente, tiene un efecto estadísticamente significativo sobre algunas variables
fisiológicas como la biomasa de la planta y agronómicas como la producción de yuca.
Una vez detectadas estas diferencias funcionales, es importante analizar el efecto que
puede tener la inoculación de las líneas de R. irregularis sobre la comunidad de HFMA
local, porque es posible que: i) también puedan generar cambios medibles en la
diversidad de la comunidad local de HFMA, y que ii) las líneas que son genéticamente
relacionadas, por ejemplo la línea de primera generación y sus líneas de segunda
generacion, pueden tener el mismo efecto sobre las comunidades locales de HFMA.
Estudios recientes han analizado el efecto de la inoculación con R. irregularis sobre la

comunidad local de HFMA, sin embargo los resultados encontrados han sido opuestos
(Antunes et al., 2009; Jin et al., 2013; Symanczik et al., 2015). Por ejemplo, Antunes y
cols (2009) evaluaron la comunidad de HFMA asociada a plantas de maíz a las doce
semanas después de la inoculación y no encontraron cambios en la diversidad. Jin y cols
(2013) reportaron una reducción en la diversidad de la comunidad local de HFMA
después de cuarenta y dos días de inocular R. irregularis en plantas de arveja. Por otra
parte, Symanczik y cols (2015) detectaron cambios en la abundancias de las especies
locales, medidos a las dieciséis semanas después de la inoculación en plantas de sorgo.
La dificultad de concluir sobre el efecto de la inoculación de R. irregularis en la
comunidad local de HFMA utilizando estos estudios ocurre porque, en primer lugar, estos
estudios fueron realizados en invernadero y solo han analizado el efecto de una línea de
R. irregularis a la vez, sin tener en cuenta la diversidad intra-específica de esta especie;
en segundo lugar, cada estudio utilizó una cepa o aislado de R. irregularis diferente, que
puede interactuar de forma particular con las especies de HFMA locales y con la planta; y
finalmente las metodologías utilizadas para describir las comunidades intraradicales de
HFMA tambíen fueron diferentes, por lo tanto sesgos en la metodología hace que los
estudios no sean comparables.
A pesar de que se acepta actualmente, que la diversidad intraespecifica en los HFMA es

enorme y que ese nivel taxonómico es el apropiado para evaluar el papel de la
asociación tanto en ecosistemas como agro-ecosistemas (Sanders & Rodriguez, 2016),
no se ha abordado la pregunta de si la diversidad genética intraespecifica de estos
hongos tiene un efecto diferencial sobre la comunidad local de HFMA. Por lo tanto en
este estudio se planteó un diseño experimental en condiciones de campo, que tuvo en
cuenta diferentes factores como la diversidad genética intra-específica de R. irregularis,
la variabilidad genética de la planta, y el tiempo de muestreo, con el fin de aportar
información que permita resolver el interrogante sobre el impacto que puede causar la
inoculación de líneas R. irregularis sobre las comunidades locales de HFMA.
4.2 Metodología
4.2.1 Material fúngico y vegetal
Para el establecimiento de los experimentos en campo se utilizaron dos variedades de

yuca (Manihot esculenta Crantz): MCOL2737 y CM4574-7. La variedad MCOL2737 es
frecuentemente sembrada en la región de la Orinoquía colombiana utilizada para la
alimentación humana. Las estacas del tercio medio del tallo de plantas de yuca de esta
variedad, que fueron utilizadas para la siembra, se obtuvieron de plantas saludables
presentes en el campus Utopía de la Universidad de La Salle. La variedad CM4574-7
tiene una aplicación industrial y las estacas fueron obtenidas del Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT).
Quince líneas de Rhizophagus irregularis utilizadas para inocular las plantas de yuca en
el experimento en campo, fueron suministradas por el grupo de Ecología y Evolución de
Organismos simbiontes de la Universidad de Lausanne en Suiza. Entre estas líneas se
encontraban líneas parentales, de primera y segunda generación (Anexo 16).
Capítulo 4 85
Con todas las líneas de R. irregularis en cultivo in-vitro, se realizó una formulación
comercial, de acuerdo al procedimiento establecido en la empresa Mycovitro, España
(Cano & Bago, 2007. Patente CSIC WO/2007/014974: 343425), donde los propágulos
fueron mantenidos en una suspensión gelatinosa. Se incluyó una línea de R. irregularis
adicional que correspondió a la línea comercial “Glomygel”, producida por la compañía
Mycovitro®, donde los progágulos de R. irregularis tambien se encuentran suspendidos
en el mismo gel.
Los componentes de este gel no se conocen debido a que esta información se encuentra
protegida por la patente en mención. Con la intención de utilizar el gel como un control y
ante la imposibilidad de obtener este gel libre de hongo, se realizó un “Filtrado” del
Glomygel en condiciones de asepsia, utilizando filtros de hasta 35 µm. Este “filtrado” se
se utilizó como un tratamiento adicional en el experimento.
4.2.2 Condiciones del experimento
El experimento se realizó en la Sede Utopía de la Universidad de la Salle, ubicada en

Yopal, Casanare, Colombia (72º 17’ 48’’ W, 5º 19’ 31’’ N). Las propiedades físico-
químicas del suelo se muestran en el Anexo 17. El clima en Yopal es tropical con una
temperatura promedio de 18ºC (noche) a 28ºC (día), una humedad promedio de 75% y
una precipitación anual total de 2335 mm con 172 días de lluvia al año
(http://goo.gl/0tm6ns).
El campo experimental utilizado, no había sido cultivado y fue clasificado como una
pastura en rastrojo. Se preparó el terreno en caballones para el cultivo de yuca.
4.2.3 Diseño experimental y muestreo.
El experimento se estableció en un diseño de bloques completos al azar con tres

factores: variedad de yuca, líneas de Rhizophagus irregularis y tiempo de muestreo. Se
utilizaron dos variedades de yuca (Variedad MCOL2737 y Variedad CM4574-7). Las
quince líneas de R. irregularis fueron utilizadas como inóculo. Se tomaron muestras en
dos tiempos (3 y 12 meses después de la siembra - mds) para evaluar los posibles
cambios en la composición de la comunidad de HFMA presente en las raíces de yuca. Se
incluyeron tres controles: plantas no inoculadas denominadas “H2O”, el inóculo comercial
Glomygel y el filtrado. En total se establecieron 58 tratamientos (Tabla 7).
Se establecieron nueve bloques, cada uno contenía una repetición de cada tratamiento.
Los bloques fueron dispuestos en posición perpendicular a la pendiente del campo. Dos
hileras de plantas de la variedad MCOL2737, se plantaron alrededor de cada tratamiento
para reducir el efecto borde y evitar contaminación cruzada de inóculos, es decir que los
hongos inoculados crecieran en el suelo lo suficiente para alcanzar otra unidad
experimental (Anexo 18).
Las estacas de las plantas de yuca fueron sembradas de acuerdo a la metodología

realizada en el experimento del objetivo 1 (Ceballos et al., 2013). Las estacas se cortaron
en bisel como material de siembra, tenían de dos a tres yemas vegetativas y un grosor
de 1.5 a 2.0 cm de diámetro. Las plantas fueron inoculadas a los 20 días después de la
siembra con 500 propágulos por planta. El inóculo concentrado de cada línea de R.
irregularis fue diluido en agua hasta alcanzar la concentración de 50 propágulos/ml, por
lo tanto 10 ml fueron aplicados sobre las primeras raicillas de cada planta de yuca. Las
plantas no inoculadas recibieron la misma cantidad de agua.
La cantidad de fertilizantes aplicados se determinó por el contenido inicial de nutrientes

del suelo (Anexo 17), los requisitos nutricionales de yuca y eficiencia de los fertilizantes.
Capítulo 4 87
Tabla 7. Tratamientos en el experimento #2. Tres factores fueron incluidos: tiempos de

muestreo (3 y 12 mds), variedades de planta y la inoculación con diferentes líneas de
Rhizophagus irregularis. El número dentro de cada casilla corresponde al número del
tratamiento.
Variedad Variedad
Línea MCOL2737 CM4574
Origen de la línea inoculada Muestreo Muestreo Muestreo Muestreo
en campo a los 3 a los 12 a los 3 a los 12
mds mds mds mds
Parental D1 - 11 29 41
Parental C2 1 12 30 42
Parental C3 2 13 31 43
Primera generación S4 (C2xC3) - 14 - 44
Segunda generación de S4 S4a - 15 32 45
Segunda generación de S4 S4b - 16 33 46
Primera generación Sc1 (D1xC3) 3 17 - 47
Segunda generación de Sc1 Sc1a 4 18 - 48
Segunda generación de Sc1 Sc1d 5 19 34 49
Segunda generación de Sc1 Sc1e - 20 35 50
Primera generación Sc2 (D1xC3) 6 21 - 51
Segunda generación de Sc2 Sc2a - 22 36 52
Segunda generación de Sc2 Sc2b - 23 - 53
Segunda generación de Sc2 Sc2c 7 24 37 54
Segunda generación de Sc2 Sc2d - 25 - 55
Línea comercial Glomygel 8 26 38 56
n/a Filtrado 9 27 39 57
n/a H2O 10 28 40 58
n/a= no aplica
El fertilizante fosfatado se adicionó en una concentración del 50% de acuerdo con los
requerimientos de cultivo. La mitad de los fertilizantes se aplicaron 45 días después de la
siembra (dds) y la otra mitad 90 dds. Todas las plantas recibieron 233 kg ha-1 de urea,
125 kg ha-1-fosfato di-amónico, 100 kg ha-1 de cloruro de potasio (KCl).
Las plantas se mantuvieron durante 12 meses después de la siembra para completar el

ciclo de cultivo. No se instaló riego artificial y se realizó un manejo manual de plagas y
malezas, semanalmente.
4.2.4 Muestreo
Se realizó un muestreo a la comunidad de HFMA presente en el suelo antes de la

siembra, con el fin de identificar cuales de estas especies establecieron una simbiosis
con las plantas de yuca. Para esto, un muestreo de suelo se realizó después de la
preparación del terreno y antes de la siembra, donde cinco puntos por bloque fueron
muestreados aleatoriamente. Se tomaron 100 gramos de suelo por cada punto, a una
profundidad de 5 a 10 cm, y se conformó una muestra compuesta de suelo por cada
bloque. Estas muestras fueron utilizadas para describir la comunidad de HFMA en el
suelo por medio de métodos moleculares.
Se realizó muestreo no destructivo de raíces a los tres meses después de la siembra

(mds) para todos los tratamientos y controles (tres réplicas por cada tratamiento). Raíces
de todos las unidades experimentales fueron recolectadas a los 12 mds. Estos tiempos
de muestreo se fijaron de acuerdo a las etapas fisiológicas del cultivo de yuca. A los tres
meses después de la siembra es la etapa de mayor produccion de raíces en esos suelos
y con esas variedades (Fernandez et al., 2016), donde se identificaron las primeras
especies de HFMA que colonizaron la planta de yuca en campo y a los 12 mds fue el
momento de la cosecha, donde se pudieron correlacionar las comunidades de HFMA con
las variables de rendimiento de la planta.
Las muestras fueron transportadas dentro de las 24 horas siguientes a los laboratorios de
la Facultad de Ciencias – Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia,
sede Bogotá. Las muestras de suelo fueron almacenadas a -80ºC hasta su
Capítulo 4 89
procesamiento. Las raíces fueron lavadas con el fin de retirar las partículas de suelo
adheridas y luego fueron rotuladas y almacenadas a -80ºC.
4.2.5 Extracción de ADN, construcción de librerías y

secuenciamiento masivo
Para la extracción de ADN de raíces de yuca y suelo, se utilizaron 100 mg y se siguió el

protocolo del kit Power Soil® (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA), de acuerdo a lo
descrito en el numeral 1.2.4. Para la amplificación de la región SSU rDNA, construcción
de librerías de ADN y el secuenciamiento masivo por medio de Illumina MiSeq, se siguió
el procedimiento descrito previamente en el numeral 1.2.4. En la construcción de las
librerías de ADN, 279 muestras se agruparon en 11 librerías.
4.2.6 Análisis bioinformático y filogenético
Cada una de las líbrerías fue analizada siguiendo el esquema propuesto en la Figura 1,
para obtener una tabla de OTUs con las abundancias para cada muestra. En la
identificación taxonómica de los OTUs se utilizó la estrategia RAxML-EPA, como se
explica en el numeral 2.2.4 de este documento y en el Anexo 3.
4.2.7 Índices de diversidad y análisis estadístico
La mayoría de los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa R versión

2.15.0 (R Development Core Team, 2012). Las diferencias entre tratamientos fueron
encontradas significativas para un valor P <0.05 en todos los análisis. La riqueza de
OTUs, índice de Shannon y la uniformidad se calcularon utilizando la función
“specnumber” y “diversity” en el paquete Vegan (Oksanen et al., 2015). El índice de

relación neta (NRI) basado en especies y en abundancias (Webb, 2000), fue calculado
en el programa Phylocom v. 4.2 (Webb et al., 2008) y utilizado para cuantificar el grado
de relación filogenética entre los OTUs dentro de cada tratamiento.
Para comparar los índices de diversidad alfa entre los diferentes tratamientos, se verificó
que las variables respuesta cumplieran los supuestos de normalidad (prueba Shapiro
Wilk) y homocedasticidad (prueba de Levene) en el programa JMP® versión 9.0. Si se
cumplían los dos supuestos, se realizó la prueba homogeneidad de varianzas (ANOVA).
Cuando solo se cumplía el supuesto de normalidad se utilizó la prueba Welch que no
exige igualdad de varianzas (Horn, 2009). Si el supuesto de normalidad o los dos
supuestos fueron rechazados, se utilizó la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis. Para
realizar las comparaciones múltiples se utilizó la prueba de Tukey y la prueba de
Wilcoxon, para datos paramétricos y no paramétricos respectivamente.
Previo al análisis de la beta-diversidad (las muestras fueron normalizadas calculando la

proporción para cada OTU en la comunidad, con el fin de remover la variabilidad
generada por el número de secuencias entre muestras (rango entre 50 y 16000). Para
esto se siguió la metodología propuesta por Bainard y cols (2014) donde el número de
secuencias de un OTU en una muestra se dividió en el número total de secuencias para
la misma muestra.
Se utilizaron gráficas de ordenación NMDS, para visualizar la similiaridad de las

comunidades en cada tratamiento, por medio de la función “metaMDS”, el índice Bray-
curtis y 1000 repeticiones en el paquete Vegan, el cual incorpora una transformación raíz
cuadrada y una doble estandarización de Wisconsin para las abundancias de los OTUs.
Para cuantificar el efecto de la inoculación de diferentes líneas de R. irregularis sobre la

estructura de la comunidad local de HFMA asociada a plantas de yuca en campo, se
Capítulo 4 91
realizó el análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA), utilizando la

function “adonis” y “beta-disper” en el paquete Vegan, basado en la matriz de similaridad
Bray-Curtis y 1000 repeticiones.
Para encontrar la relación entre la composición de la comunidad de HFMA intraradical y

la productividad de la planta de yuca, se realizaron análisis de correlación de Pearson
con la variable peso seco de la planta en el momento de la cosecha.
4.3 RESULTADOS
4.3.1 Rhizophagus sp domina la comunidad intraradical de

plantas de yuca en campo.
Después del análisis bioinformático, se utilizó el algoritmo DBC454 (Pagni et al., 2013)
para agrupar las secuencias de acuerdo con su grado de similitud formando clados.
Luego, similitud de secuencia (BLASTn, NCBI) se seleccionaron los OTUs que
correspondían a Glomeromycota (OTUs-HFMA).
Se encontraron 77 OTUs-HFMA, que fueron asignados a especie por medio del análisis
filogenético RAxML-EPA (Figura 7). El 92.8% de los OTUs se ubicaron en el género
Rhizophagus sp, 6.7% de los OTUs se ubicaron el el género Acaulospora sp y solo el
0.17% correspondían a la especie Scutellospora cerradensis. Otros géneros dentro del
orden Glomerales fueron identificados en muy baja proporción: Claroideoglomus sp con
0.19% y Glomus sp con 0.06% (Figura 13).
Figura 13. Distribución de las especies de HFMA que colonizaron las raíces de las planta
de yuca en campo en el experimento 2. Los datos representan la abundancia relativa
promedio (%) para cada especie en todas las muestras de raíces evaluadas. Valores
menores al 1% no fueron incluidos.
No se encontraron OTUs específicos para algún tratamiento en particular. Solamente el

OTU180 (Rhizophagus sp4) estuvo presente únicamente en las plantas inoculadas con
una proporción muy baja dentro de la comunidad (0.02%).
Análisis de las comunidades de HFMA en plantas de yuca sin inocular:
La estructura de la comunidad de HFMA en plantas sin inocular fue diferente para cada
una de las variedades de yuca (PERMANOVA, P=0.0009, Anexo 19), representado no en
el número de especies encontradas, pero si en su abundancia (Figura 14). La especie
Rhizophagus sp1, fue la especie más abundante en las dos variedades, sin embargo
ocupó el 50% de la comunidad para la variedad CM4574-7, mientras que para la
variedad MCOL4574 ocupó el 70% en promedio.
Capítulo 4 93
La mayoría de las especies también presentaron cambios significativos en su abundancia

relativa dependiendo la variedad, a excepción de Rhizophagus sp6 y S. cerradensis. Las
especies Claroideoglomus sp y Glomus sp, tuvieron muy baja representatividad en el
total de la comunidad de hongos y fueron sumadas en un solo grupo denominado
GlomusNORh (Glomerales que no pertenecen al género Rhizophagus) que tampoco tuvo
diferencias signifactivas entre las variedades de yuca (Anexo 19).
Figura 14. Abundancia relativa de cada especie de HFMA dentro de las raíces de las dos
variedades de yuca, incluyendo los datos de 3 y 12 meses después de la siembra. El
asterísco muestra diferencias significativas con un P<0.05.
Con el objetivo de evaluar si las comunidades de HFMA en el suelo rizosférico tenían una
mayor diversidad que las comunidades de HFMA que colonizaron las plantas de yuca, se
realizaron comparaciones entre la estructura de la comunidad de HFMA descrita en el
suelo rizosférico antes de la siembra y las comunidades de HFMA descritas para las dos
variedades de yuca a los 12 mds (Figura 15).
Figura 15. Estructura de la comunidad de HFMA en el suelo rizosférico antes de la

siembra y en raíces de plantas de yuca no inoculadas, a los 3 y 12 meses después de la
siembra.
Se observó que la comunidad de HFMA presente en el suelo fue similar en estructura a

la comunidad de HFMA asociada a la variedad de yuca CM4574-7, tanto a los 3 como a
los 12 meses después de la siembra en plantas no inoculadas (PERMANOVA, P= 0.079,
Anexo 20). En el suelo y en las raíces de la variedad CM4574-7, Rhizophagus sp1 ocupó
en promedio el 50% de la comunidad de HFMA, siendo así la especie más abundante.
La comparación entre la comunidad de HFMA presente en el suelo, con la comunidad

HFMA presente en las raíces de la variedad MCOL2737, mostró diferencias significativas
(PERMANOVA, P=0.009, Anexo 19, Figura 15).
Capítulo 4 95
En las plantas de yuca no inoculadas, la estructura de la comunidad de HFMA fue igual

en los dos tiempos de muestreo, tres y doce meses después de la siembra (mds)
(Variedad MCOL2737, P=0.3107 ; Variedad CM4574, P=0.3776) (Anexo 20).
4.3.2 Diversidad de las comunidades de HFMA después de la

inoculación
Cinco variables de alfa diversidad fueron utilizadas para evaluar el efecto de la

inoculación sobre las comunidades de HFMA asociadas a plantas de yuca en campo:
riqueza, índice de Shannon, índice de Pielou, índice de parentesco neto (NRI- net
relateness index) basado en el número de OTUs y NRI basado en la abundancia.
Para cada una de las estas variables se comprobaron los supuestos de normalidad y
homocedasticidad. Para las variables índice de Shannon e índice de Pielou, se encontró
un efecto de la interacción de las variables (inoculación y variedad de la planta), pero
cuando se evaluó el efecto de cada variable por separado, se observó una fuerte
influencia de la inoculación, pero ningún efecto por parte de la variedad de yuca (Tabla
8).
Para la variable riqueza de OTUs. se observó un efecto de la interacción de las variables

pero no un efecto de las dos variables evaluadas independientemente. Cuando las dos
variedades de yuca fueron evaluadas por separado, se observó un efecto de la
inoculación sobre la riqueza de OTUs. En la variedad MCOL2737, la comunidad de
HFMA inoculada con la línea Sc2 mostró el valor más alto, con un promedio de 74.3
OTUs, mientras que el valor mas bajo lo presentó la comunidad de HFMA inoculada con
la línea Sc2a con 15.7 OTUs en promedio.
En la variedad CM4574-7 el valor más alto se observó en las plantas no inoculadas (62.3
OTUs) y el más bajo se observó cuando se inoculó la línea S4 (33 OTUs) (Figura 16).
Comparando las dos variedades, en la variedad MCOL2737 el valor promedio de OTUs
encontrados fue menor (37,2 OTUs) que en la variedad CM4574-7 (45,9 OTUs). Sin
embargo al agrupar los OTUs en las especies putativas, de acuerdo con los resultados
del análisis RAxML-EPA, las dos variedades fueron colonizadas por todas las especies
de HFMA.
Para el índice de Shannon, aunque no se observó un efecto de la variedad de yuca

(Tabla 8), se observó una tendencia, donde para la variedad MCOL2737, la diversidad de
la comunidad de HFMA fue en promedio mayor, comparada con las plantas no
inoculadas (control), mientras que para para la variedad CM4574-7 la diversidad fue
menor comparada con el control (Figura 17).
Analizando los datos independientemente para cada variedad, se demostró que el efecto
de la inoculación de las diferentes líneas de R: irregularis sobre la diversidad de las
comununidad de HFMA, medido en el índice de Shannon, solo fue evidente para la
variedad MCOL2737 (P<0.0001) (Tabla 8).
Capítulo 4 97
Figura 16. Riqueza de OTUs en las raíces de plantas de yuca en campo, después de
inocular diferentes líneas de Rhizophagus. irregularis, en dos variedades de Manihot
esculenta Cranz a los 12 mds.
Figura 17. Índice de Shannon para las comunidades de HFMA en dos variedades de
yuca, después de inocular con diferentes líneas de Rhizophagus irregularis (columnas en
gris). Resultados para la comunidad de HFMA en plantas inoculadas con el inoculante
comercial, el filtrado y plantas no inoculadas tambien son comparados (columnas en
color rojo, verde y azul respectivamente).
En el análisis del índice de Pielou, se observó que el efecto de la inoculación con

diferentes líneas de R. irregularis sobre la uniformidad de las comunidades de HFMA
intraradicales fue visible para la variedad MCOL2737 (Figura 18, Tabla 8). Por lo tanto,
las comunidades de HFMA se establecieron mas homogéneas en las plantas de la
variedad CM4574-7.
Capítulo 4 99
Tabla 8. Análisis estadístico para los índices de diversidad alfa, en la comunidad de

HFMA asociadas a dos variedades de yuca (MCOL2737 y CM4574-7) a los 12 meses
después de la siembra.
RIQUEZA DE OTUs
NORMALIDAD VARIANZA PRUEBA DIFERENCIA
EFECTO
(Test Shapiro-Wilk) (Test Levene) ESTADÍSTICA SIGNIFICATIVA
Interacción
0.9158 <0.0001 Welch: <0.0001 Si
Variedadx Línea
Variedad 0.9322 0.0191 Welch: 0.2662 No
Línea 0.873 <0.0001 Welch: 0.3109 No
Inoculación en la
variedad 0.4243 <0.0001 Welch: <0.001 Si
MCOL2737
Inoculación en la
variedad 0.9322 0.046 Welch: 0.0002 Si
CM4574-7
INDICE DE SHANNON
NORMALIDAD
VARIANZA PRUEBA DIFERENCIA
EFECTO (Test Shapiro-
(Test Levene) ESTADÍSTICA SIGNIFICATIVA
Wilk)
Interacción <0.001
0.5279 Welch: 0.006 Si
Variedad x Línea
Variedad 0.1305 0.5904 ANOVA: 0.3472 No
Línea 0.5279 0.284 Welch: 0.0359 Si
Inoculación en la
variedad 0.9644 0.0007 Welch: <0.0001 Si
MCOL2737
Inoculación en la
variedad 0.1305 0.0133 Welch: 0.5606 No
CM4574-7
ÍNDICE DE PIELOU
NORMALIDAD
VARIANZA PRUEBA DIFERENCIAS
EFECTO (Test Shapiro-
(Test Levene) ESTADÍSTICA SIGNIFICATIVA
Wilk)
Interacción
0.4784 0.0087 Welch: <0.0001 Si
Variedad x Línea
Variedad 0.798 0.6028 ANOVA: 0.3122 No
Línea 0.4784 0.0426 Welch 0.0130 Si
Inoculación en la
variedad 0.3880 0.0050 Welch: <0.0001 Si
MCOL2737
Inoculación en la
variedad 0.7598 0.2273 ANOVA: 0.3399 No
CM4574-7
Figura 18. Índice de Pielou calculado para las comunidades de HFMA asociadas a
plantas de yuca, doce meses después de la inoculación con diferentes líneas de R.
irregularis.
El índice de parentesco neto (NRI-Net Relatedness Index) fue utilizado para medir la
dispersión filogenética de los OTUs en la comunidad de HFMA inoculada con R.
irregularis, basado en la presencia-ausencia de OTUs y también en las abundancias.
Para el primer caso, donde se utilizaron los datos de presencia-ausencia de OTUs para
calcular el índice NRI, se observó que la interacción entre la variedad de la planta y las
líneas de R. irregularis inoculadas tienen un efecto significativo sobre la dispersión
filogenética de las comunidades de HFMA. Además se observó un fuerte efecto de la
variedad de la planta pero no de la línea inoculada (Figura 19). En la variedad CM4574-7,
el control (plantas no inoculadas) presentó valores negativos para este índice, indicando
que la comunidad de HFMA asociada, es filogenéticamente dispersa (NRI<0), al igual
que ocurrió para la comunidad de HFMA en algunos tratamientos: Glomygel, S4c, Sc1a,
Sc2, Sc2a y Sc2b (Figura 19).
En la variedad MCOL2737, la mayoría de las comunidades de HFMA asociadas

presentaron una relación filogenética estrecha (NRI>0), lo cual indica que los OTUs que
componían estas comunidades estaban filogenéticamente mas relacionados que lo
esperado por el azar (Figura 19).
Capítulo 4 101
En la variedad CM4574 las comunidades fueron mas dispersas filogenéticamente

(NRI<0), tanto para plantas no inoculadas (H2O), como plantas de yuca inoculadas con
Glomygel y otras líneas de R. irregularis: S4b, S4c, Sc1a, Sc2, Sc2a y Sc2b.
Figura 19. Efecto de la inoculación con Rhizophagus irregularis y de la variedad de yuca

sobre el índice de diversidad NRI - basado en la ocurrencia de OTUs.
Para el segundo caso, donde se calculó el NRI utilizando valores de abundancia (Figura
20), se observó que los tratamientos mostraron valores positivos, lo cual sugiere un
efecto de dominancia, donde ciertos OTUs que son los mas representativos en la
comunidad de HFMA, están presentes en igual abundancia para todos los tratamientos.
Este efecto es posiblemente generado por el OTU 32 (Rhizophagus sp1) que tuvo un
promedio de 54.9% para la variedad MCOL2737 y 53.6% para la variedad CM4574-7.

Por lo tanto, este resultado explica que la dispersión filogenética encontrada en el NRI
basado en presencia-ausencia de OTUs (Figura 19), es debida a OTUs que tienen una
baja proporción dentro de la comunidad.
Figura 20. Efecto de la inoculación con Rhizophagus irregularis y de la variedad de yuca,

sobre el índice de diversidad NRI - basado en la abundancia de OTUs.
Para evaluar con más detalle los cambios en la diversidad de la comunidad de HFMA,
después de la inoculación en las dos variedades de yuca, los tratamientos fueron
agrupados de acuerdo al origen o grupo genético de la línea de R. irregularis inoculada,
con el fin de establecer si existía alguna relación entre los cambios causados por la
inoculación y la información genética de la línea inoculada. El parental “D1” no se tuvo en
Capítulo 4 103
cuenta en la formación de estos grupos, porque se ha encontrado que no aporta

información genética a las líneas de primera generación (Comunicación personal
profesor Sanders, datos no publicados).
Se realizaron comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con líneas

parentales, líneas de primera y segunda generación, de acuerdo con lo explicado en la
Tabla 9 y para la variable indice de Shannon (Tabla 10).
Tabla 9. Grupos de aislados de Rhizophagus irregularis según su origen, de acuerdo con

la información suministrada por el grupo de Ecología y Evolución de Organismos
simbiontes de la Universidad de Lausanne, Suiza (Comunicación personal, datos no
publicados).
Grupo de R. irregularis según su origen Líneas
C2 C2, S4, S4b
C3 C3, Sc1, Sc2 y sus segregadas
C3-Sc1 C3, Sc1 y sus segregadas
C3-Sc2 C3, Sc2 y sus segregadas
Utilizando el índice de Shannon para medir los cambios en la diversidad de las

comunidades de HFMA inoculadas con diferentes líneas de R. irregularis, se observó que
ningún grupo genético generó cambios en la diversidad de las comunidades de HFMA
asociadas a plantas de yuca en campo (Tabla 10).
Para la variedad MCOL2737 solo se encontraron diferencias entre las comunidades de

HFMA cuando la planta de yuca se inoculó con lineas del grupo C3-Sc2 (Tabla 10). Por
lo tanto, aunque se observa una diferencia significativa cuando se comparan todos los
tratamientos simultaneamente, solo ciertas líneas de R. irregularis son las responsables
de estos cambios y además sugiere que las líneas del grupo C3Sc2 se comportan
diferente en el espacio intraradical comparado con las líneas R. irregularis que

pertenecen a otros grupos genéticos utilizados en el experimento.
Tabla 10. Análisis estadístico para el índice de Shannon agrupando tratamientos de

acuerdo a la informacíon de grupos genéticos de Rhizophagus irregularis, en las dos
variedades de yuca. Los valores en la tabla corresponden al valor P de las pruebas
estadísticas donde un valor mayor al valor alfa (0.05) acepta la hipótesis nula de no
diferencias entre tratamientos
MCOL2737
NORMALIDAD VARIANZA PRUEBA
EFECTO DIFERENCIAS
(Test Shapiro-Wilk) (Test Levene) ESTADÍSTICA
Welch
Grupo C2 0.8065 0.0403 No
0.5488
KW
Grupo C3 0.0086 0.0002 No
0.0821
ANOVA
Grupo C3-Sc1 0.4500 0.1147 No
0.5712
KW
Grupo C3-Sc2 0.0013 <0.0001 Si
0.0375
CM4574-7
NORMALIDAD VARIANZA PRUEBA
EFECTO DIFERENCIAS
(Test Shapiro- Wilk) (Test Levene) ESTADÍSTICA
ANOVA
Grupo C2 0.0252* 0.5869 No
0.9765
Welch
Grupo C3 0.0679 0.0190 No
0.7202
ANOVA
Grupo C3-Sc1 0.7375 0.0813 No
0.7095
ANOVA
Grupo C3-Sc2 0.0220* 0.251 No
0.6168
KW= Prueba no paramétrica Kruskall Wallis; * El supuesto de normalidad se evaluó de forma independiente
para cada tratamiento. Se identificó que el supuesto si se cumplía, por esta razón se evaluó la diferencia
entre tratamientos con el estadístico ANOVA (Horn, 2009).
Capítulo 4 105
4.3.3 Composición de las comunidades de HFMA en plantas de

yuca 12 mds, utilizando análisis multivariados
Se realizaron análisis multivariados para determinar la contribución de la inoculación con

diferentes líneas de R. irregularis y las dos variedades de planta, sobre la estructura de la
comunidad de HFMA.
El análisis PERMANOVA comparando todos los tratamientos indicó que hubo un efecto
significativo de la interaccion (Variedad de la planta y línea de R. irregularis inoculada), y
también de la línea inoculada, con un valor P=0.0009 (α=0.05), además un efecto de la
variedad de yuca (P=0.08, α=0.1) (Tabla 11, Anexo 21). En consecuencia se realizaron
análisis en grupos más pequeños de tratamientos, agrupandolos por (i) variedad de la
planta, (ii) el origen de las líneas inoculadas (Tabla 7) y (iii) evaluando el efecto de los
controles Glomygel y Filtrado.
Tabla 11. Análisis multivariado (PERMANOVA) para medir el efecto de la variedad de la

planta y las líneas de R. irregularis inoculadas sobre las comunidades de HFMA que
colonizan las plantas de yuca, 12 meses despues de la inoculación. El asterisco muestra
las diferencias significativas (* para un α=0.01, ** para un α=0.05).
Efecto F P
Variedad de yuca 2.27 0.0829 *
Linea de R. irregularis inoculada 2.44 0.0009 **
Interacción 2.36 0.0009 **

(i) Efecto de la inoculación sobre la estructura de la comunidad de HFMA en

plantas de yuca. Análisis independiente por variedad de yuca.
Cuando se realizó el análisis multivariado para identificar diferencias entre las

comunidades de HFMA que colonizaron las plantas de yuca y que en el momento de la
siembra habían sido inoculadas con diferentes líneas de R. irregularis, se encontraron
diferencias solamente para las comunidades HFMA de la variedad MCOL2737 (Tabla 12,
Anexo 22)
Tabla 12. Análisis multivariado PERMANOVA, para evaluar diferencias entre

tratamientos para cada una de las variedades de yuca. El asterisco muestra las
diferencias significativas (* para un α=0.05).
Efecto de la inoculación F P
Variedad MCOL2737 3.52 0.0009 *
Variedad CM4574-7 1.17 0.2338
Para determinar específicamente cuáles líneas de R. irregularis fueron las que generaron
un cambio sobre la estructura de la comunidad de HFMA en las plantas de la variedad
MCOL2737, se hicieron comparaciones en pares: una comunidad de HFMA inoculada
con una línea de R. irregularis versus la comunidad HFMA no inoculada (H2O) (Tabla 13,
Anexo 23 y 24).
En la variedad MCOL2737, se observó un efecto significativo de todas las líneas de R.

irregularis excepto para la línea S4 y Sc2d (Tabla 12). Por lo tanto, para la variedad
MCOL2737, la mayoría de las líneas de R. irregularis analizadas independientemente
pueden generar diferencias en la estructura de la comunidad de HFMA.
Capítulo 4 107
Tabla 13. Comparaciones uno a uno, entre comunidades de HFMA inoculadas con
diferentes líneas de Rhizophagus irregularis versus las comunidades de HFMA no
inoculadas en la variedad MCOL2737, doce meses después de la inoculación.
MCOL2737 CM4574-7
Líneas de Valor P F Valor P F

R. irregularis
D1 vs. H2O 0.0139* 5.15 0.6593 0.41
C2 vs. H2O 0.0109* 5.77 0.7173 0.30
C3 vs. H2O 0.0009* 13.9 0.8252 0.45
S4 vs. H2O 0.0809 2.53 0.4735 0.84
S4b vs. H2O 0.0004* 9.36 0.7705 0.37
S4c vs. H2O 0.0049* 8.20 0.7246 0.37
Sc1 vs. H2O 0.0029* 7.79 0.6687 0.30
Sc1a vs. H2O 0.0019* 9.29 0.7046 0.22
Sc1d vs. H2O 0.0009* 10.9 0.5808 0.47
Sc1e vs. H2O 0.0009* 15.9 0.2395 1,07
Sc2 vs H2O 0.0039* 5.2 0.7425 0.25
Sc2a vs H2O 0.0009* 29.4 0.6188 0.44
Sc2b vs H2O 0.0169* 5.25 0.8583 0.22
Sc2c vs H2O 0.0019* 15.18 0.2894 1.20
Sc2d vs H2O 0.1678 1.94 0.5709 0.72

(ii) Efecto de la inoculación sobre la estructura de la comunidad de HFMA, en

plantas de yuca de la variedad MCOL2737, evaluando por grupos genéticos de R.
irregularis.
Los tratamientos de la variedad MCOL2737 fueron agrupados de acuerdo al origen o

grupo genético de la línea de R. irregularis inoculada, con el fin de establecer si existía
alguna relación entre los cambios causados por la inoculación y la información genética
del inóculo. Por lo tanto se realizaron comparaciones entre las comunidades de HFMA
inoculadas con líneas parentales, líneas de primera y segunda generación, de acuerdo
con lo explicado previamente (Tabla 9).
En la variedad MCOL2737, cuando las comunidades inoculadas con las líneas de los
grupos genéticos parentales, C2 y C3Sc1 fueron comparadas entre sí, sin incluir la
comunidad de las plantas no-inoculadas (H2O), no se encontraron diferencias
significativas, lo cual sugiere que las comunidades comparadas presentaban los mismos
cambios causados por la inoculación, independiente de la línea inoculada. Por el
contrario, para las comunidades inoculadas con las líneas de R. irregularis del grupo
C3Sc2, mostraron diferencias entre ellas (Tabla 14, Anexo 25).
Cuando las comunidades de HFMA que fueron inoculadas con las líneas de R. irregularis
de los grupos genéticos se compararon con la comunidad de HFMA en plantas no
inoculadas (H2O), se observaron diferencias significativas causadas por la inoculación
(Anexo 26). Análisis gráficos utilizando el ordenamiento multidimensional no métrico,
también mostraron que las comunidades HFMA de plantas no inoculadas (H2O)
aparecen distanciadas de las comunidades HFMA inoculadas (Figura 21c y 21e).
Para la variedad CM4574-7 no se observaron diferencias en ningún nivel de comparación

(Tabla 14, Anexo 27).
Capítulo 4 109
Tabla 14. Resultados del análisis PERMANOVA agrupando tratamientos por grupos
genéticos, para las comunidades de HFMA en plantas de yuca a los doce meses
después de la inoculación. Los valores en la tabla corresponden al valor P de la prueba
estadística PERMANOVA, donde un valor P >α (α =0.05) acepta la hipótesis nula de no
diferencias entre tratamientos.
Grupos genéticos MCOL2737 CM4574-7
Comparaciones sin incluir el control (H2O)
Parentales D1, C2, C3 0.4558 0.9221
C2 C2, S4, S4b, S4c 0.6552 0.9900
C3Sc1 C3, C3Sc1, 2da generación 0.1249 0.6843
C3Sc2 C3, C3Sc2 y 2da generación 0.0009* 0.3746
Estos resultados muestran que para la variedad MCOL2737 existe un efecto de la

inoculación sobre la estructura de las comunidades de HFMA asociadas a las plantas de
yuca.
Los cambios generados por la inoculación de las líneas de R. irregularis del grupo C3Sc2
fueron analizados en más detalle, debido a que fue el único grupo que en el análisis
multivariado mostró diferencias significativas cuando no se incluyó la comunidad de
HFMA de plantas no inoculadas (Tabla 14). Para este análisis, los OTUs fueron
agrupados en las especies putativas identificadas en el capítulo 2 (Figura 7) y los
análisis de varianza fueron realizados utilizando el programa JMP® versión 9.0.1, donde
se comparó la abundancia relativa promedio de cada especie para cada tratamiento.
Figura 21. Escalamiento multidimensional no-metrico (NMDS) para las comunidades de

HFMA asociadas a la variedad MCOL2737, evaluando por grupos genéticos de R.
irregularis inoculados en campo. Imágenes a la izquierda (a, c y e) representan las
comparaciones entre comunidades de HFMA incluyendo plantas no inoculadas (H2O).
Imágenes a la derecha (b, d y f) representan las comparaciones donde no se incluyó el
control (H2O). Figuras a y b para el grupo de líneas parentales, c y d para el grupo C3-
Sc1, e y f para el grupo C3-Sc2.
a. b.
c. d.
e. f.
Capítulo 4 111
Figura 22. Comparación entre las comunidades de HFMA en plantas de yuca de la

variedad MCOL2737, inoculadas con la línea parental C3 y las líneas de primera y
segunda generación, doce meses después de la inoculación. a) Comparación del efecto
entre la línea C3 y sus segregadas, b) Comparación del efecto entre la línea C3, Sc2 y
las comunidades de plantas no inoculadas (H2O). Las letras indican diferencias
significativas para un valor alfa de 0.05.
a.
b.
Comparando el parental C3 con sus segregadas, las diferencias estuvieron presentes

para algunas especies: Rhizophagus sp4, Rhizophagus sp5, Rhizophagus sp7,
Acaulospora sp1 y Acaulospora sp3 (Figura 22a, Anexo 28). En la comparación de C3
con la línea de primera generación (Sc2) también se encontraron diferencias
significativas en las especies Rhizophagus sp2, Acaulospora sp2 y S. cerradensis. Al
comparar las comunidades de HFMA inoculadas con las líneas del grupo C3Sc2 versus
la comunidad de HFMA en plantas no inoculadas, se observó que los cambios se
presentaron para la mayoría de las especies, con una evidente disminución en la
abundancia relativa de la especie más abundante, Rhizophagus sp1. La especie
Rhizophagus sp6 fue la única que no mostró cambios entre tratamientos (Figura 22b).
(iii) Efecto de los controles Glomygel y Filtrado sobre la estructura de la

comunidad de HFMA en plantas de yuca de la variedad MCOL2737, doce meses
después de la siembra.
Se evaluó el efecto de los dos controles Glomygel y Filtrado sobre la estructura de las
comunidades de HFMA sin inocular, para cada una de las variedades de yuca. La línea
Glomygel® fue evaluada, comparando las comunidades de HFMA inoculadas y no
inoculadas. No se observaron cambios en la estructura de la comunidad de HFMA para
ninguna de las dos variedades de yuca (Figura 23, Anexo 29).
Para evaluar el efecto del filtrado sobre la comunidad de HFMA de la variedad

MCOL2737, también se realizaron análisis multivariados utilizando los datos de las
comunidades a los doce meses después de la inoculación. Los resultados muestran un
efecto significativo del uso del filtrado sobre la comunidad de HFMA (P=0.0009, α=0.05)
(Anexo 30). Las diferencias entre las dos comunidades fueron detectadas para la
abundancia relativa de seis especies: R. irregularis, Rhizophagus sp1, Rhizophagus sp3,
Rhizophagus sp4, Acaulospora sp1 y Acaulospora sp3 .
Capítulo 4 113
Figura 23. Escalamiento multidimensional no-métrico (NMDS) para el efecto del

Glomygel sobre las comunidades de HFMA , doce meses después de la inoculación. a)
variedad MCOL2737, b) Variedad CM4574-7, c) Análisis estadístico PERMANOVA. Los
valores en la tabla corresponden al valor P de las pruebas estadísticas donde un valor
P>α (α =0.05) acepta la hipótesis nula de no diferencias entre tratamientos.
a. b.
c.
EFECTO DEL DF F P
GLOMYGEL
Línea MCOL2737 1 1.2565 0.2777
Línea CM4574-7 1 2.2335 0.1628
En estas comparaciones se evidenció que el filtrado provocó una disminución en la

concentración intraradical de la especie Rhizophagus sp1, mientras que otras especies
del género Rhizophagus como R. irregularis, Rhizophagus sp3 y Rhizophagus sp4
aumentaron su concentración. Nuevamente, la importancia de cada una de estas
especies, deberá ser analizada en profundidad en futuros estudios, donde se determine
la influencia de estas especies en la simbiosis con la planta hospedera, evaluar si estas
especies estan involucradas en el beneficio del crecimiento de la planta de yuca y si
pueden ser cultivadas en el sistema in-vitro para su multiplicación en masa.
El efecto del filttrado sobre la comunidad de HFMA es dificil de interpretar, puesto que
este contenía metabolitos desconocidos del hongo R. irregularis presente en el inóculo
comercial Glomygel ®. Por lo tanto se sugiere en futuros estudios identificar los posibles
metabolitos que puedan causar efectos sobre los hongos locales o utilizar como control
un gel que no haya soportado el crecimiento del hongo.
El efecto del filtrado para la variedad CM4574-7 no pudo ser analizado debido a que no
existieron réplicas suficientes para hacer el análisis estadístico, ni a los tres ni a los 12
meses después de la siembra.
Figura 24. Comparación de la abundancia relativa de las especies en la comunidad de

HFMA no inoculada versus las comunidades de HFMA inoculadas con Glomygel y
Filtrado en la variedad MCOL2737, 12mds.
Capítulo 4 115
4.3.4 Relación de la diversidad de HFMA con la respuesta de la

planta hospedera a la inoculación.
Este experimento hace parte del macroproyecto “Cassava for food security and
sustainability in Colombia: Biotechnological application of mycorrhizal fungi. Financiado
por la fundación suiza para el ciencia (Swiss National Science Foundation), cuyo objetivo
también incluía evaluar el efecto de la inoculación de las diferentes líneas de R.
irregularis sobre el crecimiento de la planta hospedera (Ceballos, 2016, Datos no
publicados).
Por lo tanto, se recolectaron datos de biomasa seca de las raíces tuberosas producidas
por las plantas de yuca a los doce meses después de la inoculación. También se calculó
el porcentaje de colonización radical utilizando la técnica tinción de raíces (Vierheilig &
Piché, 1998), que es una de las variables mas frecuentemente utilizadas para evaluar la
presencia de HFMA en las raíces de las plantas (Anexo 32). Estas variables fueron
utilizadas para identificar si los valores de alfa diversidad de las comunidades de HFMA
(índice de Shannon y riqueza de OTUs) tienen alguna relación con el crecimiento de la
planta.
Por medio del estadístico de Pearson, no se observó ninguna relación entre las variables
comparadas para ninguna de las dos variedades de yuca (Tabla 15). Este resultado
sugiere que i) una alta diversidad de HFMA en las raíces de las plantas de yuca no es
directamente proporcional con un mayor crecimiento de la planta ii) una alta colonización
intraradical, medida por los métodos tradicionales de tinción de raíces, no es
directamente proporcional a una mayor riqueza de OTUs ni a una mayor diversidad de
HFMA en las raíces de la planta .
Tabla 15. Comparación de Pearson para las variables: peso seco de la planta, porcentaje
de colonización intraradical, Riqueza de OTUs e índice de Shannon para las dos
variedades de yuca.
Variable Peso seco de la planta % colonización intraradical
MCOL2737 R: 0.07 R: 0.07

Riqueza de OTUs P: 0.76 P: 0.77
MCOL2737 R: -0.23 R:-0.05

Índice de Shannon P: 0.33 P:0.81
CM4574 R: -0.025 R: 0.03

Riqueza de OTUs P: 0.91 P: 0.87
CM4574 R:-0.10 R:-0.18

Índice de Shannon P: 0.98 P:0.47
4.3.5 Comparación de las comunidades en dos tiempos de

muestreo en plantas inoculadas
Las comunidades de los HFMA que colonizaban las plantas de yuca, después de tres y
doce meses de la inoculación fueron analizadas con el fin de observar los posibles
cambios en la estructura de la comunidad en el tiempo y evaluar si los cambios son los
mismos independientemente del aislado de R. irregularis inoculado.
Para cada variedad de Manihot esculenta Cranz, un número diferente de tratamientos fue
analizado debido a que a los tres meses después de la inoculación se recolectaron tres
réplicas por tratamiento, pero algunas raíces no amplificaron o no se obtuvo número
suficiente de secuencias después de la secuenciación masiva. Para las variedades de
Capítulo 4 117
yuca MCOL2737 y CM4574-7, se analizaron ocho y nueve tratamientos respectivamente

(Tabla 16).
El resultado de las diferencias entre las comunidades a los 3 y 12 meses después de la

inoculación con cada una de las líneas de R. irregularis, fue resumido en la Tabla 16. En
su mayoría, las comunidades de HFMA no mostraron cambios estadísticos significativos
para los dos tiempos evaluados. Los tratamientos que mostraron diferencias no fueron
los mismos para cada variedad.
Tabla 16. Cambios en la comunidad de HFMA en el tiempo después de la inoculación

con líneas de R. irregularis.
Líneas de Variedad MCOL2737 Variedad CM4574

R. irregularis
D1 - No
C2 No No
C3 No No
S4 - -
S4b - -
S4c - -
Sc1 No -
Sc1a No -
Sc1d No No
Sc1e - No
Sc2 Si -
Sc2a - No
Sc2c - Si
Glomygel No Si
H2O No No
Las plantas no inoculadas no mostraron diferencias en el tiempo, independientemente de

la variedad evaluada. Para la variedad MCOL2737 se detectaron diferencias en las
comunidades inoculadas con la línea R. irregularis Sc2, mientras que para la variedad
CM4574, las diferencias fueron observadas para las comunidades inoculadas con R.
irregularis Sc2c y Glomygel. Estas diferencias fueron medidas a nivel de especie,

agrupando los OTUs de acuerdo con la aproximación taxonómica. Análisis de
normalidad, homocedasticidad y varianza fueron realizados para demostrar las
diferencias (Figura 25)
Figura 25. Diferencias en las comunidades de HFMA a los 3 y 12 meses después de la

inoculación con algunas líneas de R. irregularis. a) variedad MCOL2737 –Glomygel,
b)MCOL2737 – Sc2, c) CM4574-7 – Sc2c, d)CM4574-7 – Glomygel. Barras blancas y
negras representan la proporción de cada especie a los 3 meses y 12 meses después de
la inoculación.
Capítulo 4 119
Para las comunidades que presentaron diferencias en el tiempo se observó un patrón

donde la especie Rhizophagus sp1 está presente en una menor proporción a los 12
meses despues de la inoculación (40-50%), comparado con las comunidades evaluadas
a los 3 mdi (60-80%). Las especies Rhizophagus sp2, Rhizophagus sp3 y Rhizophagus
sp4 tuvieron en promedio una proporción mas alta a los 12mdi que a los 3mdi. Este
patrón es contrastante con la distribución de las especies en las comunidades donde no
se observaron diferencias significativas. Por ejemplo en el tratamiento Glomygel para la
variedad de yuca MCOL2737 (Figura 26a), no hay diferencias significativas en la
proporción de Rhizophagus sp1 a los 3 y 12 mdi.
4.4 DISCUSION
Este es el primer estudio que evalúa el efecto de la inoculación de diferentes líneas de R.

irregularis sobre la estructura de la comunidad de HFMA en condiciones de campo. Con
el análisis de quince líneas inoculadas en las mismas condiciones ambientales, utilizando
dos variedades de Manihot esculenta Cranz, se obtuvo una visión mas amplia de lo que
sucede con las comunidades de HFMA después de la inoculación, en condiciones de
sistemas productivos, en donde se midio tambien la productividad de la planta.
Los resultados de esta investigación sugieren que tanto la genética del hongo a nivel
intra-específico, como la genética de la planta hospedera influyen en la respuesta de las
comunidades de HFMA, a la inoculación (Tabla 10). De forma importante, la perdida y/o
ganancia de OTUs y los cambios en la abundancia no tienen ninguna relación con el
funcionamiento de la simbiosis, medido en biomasa de las raíces de la planta (Figura 20).
Es interesante por lo tanto analizar en detalle cada uno de los factores para entender el
comportamiento de las comunidades HFMA y el impacto ecológico de la práctica de
inoculación, sobre las comunidades del filo Glomeromycota.
4.4.1 El efecto de la inoculación sobre la comunidad de HFMA

depende de la variedad de la especie vegetal.
En este estudio se observó que la variedad de la planta tiene un fuerte efecto en la

estructura de las comunidades de HFMA y en la respuesta de las comunidades de HFMA
frente al disturbio. Con las variables de alfa diversidad se observó una respuesta
diferente de la comunidad de HFMA a la inoculación del mismo aislado de R. irregularis,
para cada una de las variedades. En términos de beta-diversidad para la variedad
MCOL2737, la mayoría de las líneas de R. irregularis tuvieron un efecto significativo
sobre la estructura de la comunidad de HFMA, comparado con las comunidades HFMA
de las plantas no inoculadas, mientras que en la variedad CM4574, ninguna línea generó
un cambio en la estructura de la comunidad de HFMA comparado con lo observado en el
control (plantas no inoculadas).
Los resultados de este estudio concuerdan con lo reportado previamente, donde se ha

señalado que el hospedero, tiene un impacto sobre la diversidad y composición de las
comunidades de HFMA (Bever et al.; Vandenkoornhuyse et al., 2003; Johnson et al.,
2004). Estudios mas recientes con plantas de interés agronómico, señalan que plantas
de diferentes grupos funcionales (lenteja y arveja vs no leguminosas-trigo) crecidas en un
mismo suelo, albergan en sus raíces comunidades de HFMA diferentes en la riqueza de
OTUs y la diversidad (Bainard et al., 2014). Tambien se ha reportado que las
comunidades de HFMA pueden diferir en su composición dependiendo de la variedad de
la planta. Por ejemplo Senes y cols (Senés-Guerrero et al., 2015) reportaron
comunidades de HFMA disímiles de acuerdo con la variedad de Solanum tuberosum
muestreada en campo, en diferentes puntos de los Andes (Ecuador y Perú).
Capítulo 4 121
4.4.2 Efecto de la inoculación con R. irregularis, ¿ganancia o

pérdida de diversidad?
Analizando los resultados de la diversidad alfa se encontraron diferencias significativas

causadas por la inoculación sobre variables como la riqueza de OTUs. Sin embargo,
estas diferencias no son fáciles de interpretar si no se toma en cuenta la asignación
taxonómica y la funcionalidad en el ecosistema. Por ejemplo el tratamiento Sc2a en la
variedad MCOL2737 presentó la riqueza mas baja con una media de 15 OTUs (Figura
13). Sin embargo, al agrupar por especies y analizar la abundancia relativa, se observó
que la comunidad de HFMA, cuando se inoculó la línea Sc2, estuvo compuesta por las
nueve especies mas frecuentes detectadas en todos los tratamientos y no se encontraron
secuencias que correspondieran a Acaulospora sp2, Rhizophagus sp5, Rhizophagus
sp7, Claroideoglomus sp1, Claroideoglomus sp3, ni Glomus sp, que para las otras
comunidades ocuparon entre todas una proporción muy baja: menos del 2% de la
comunidad de HFMA total.
Para la variedad CM4574, la comunidad de HFMA inoculada con la línea S4, provocó la
ausencia de la especie Glomus sp. Para los demás tratamientos se observó que
contenían secuencias de todas las especies. La composición de las comunidades en las
dos variedades fueron similiares (Tabla 9), estos resultados sugieren que en el campo
experimental analizado, las plantas de yuca de las dos variedades estuvieron
colonizadas por el mismo grupo de especies, al igual que lo reportado por Senes y cols
(2015), donde se identificaron seis especies que estuvieron presentes en todas las
plantas de papa muestreadas en diferentes latitudes.
En otros estudios donde se han analizado comunidades de HFMA asociadas a plantas

de interés agronómico en campo, se reporta que la especie más abundante (Acaulospora
sp) estuvo presente en el 85% de las raíces de plantas de papa (Senés-Guerrero et al.,
2015) y Paraglomus sp estuvo presente en el 55% en las raíces de arveja (Bainard et al.,
2014). En este estudio, el efecto de dominancia estuvo a cargo de Rhizophagus sp1
(Figura 12 y 17). Estos resultados sugieren, que las comunidades de HFMA en campo,
estan compuestas en su mayoría por una sola especie.
En las comunidades de HFMA que colonizan las plantas de yuca, se observó que el
OTU32 (Rhizophagus sp1) fue el más abundante y estuvo presente en todos los
tratamientos. Las diferencias más significativas entre tratamientos estuvieron marcadas
por la abundancia de los OTUs mas que por la riqueza (Figura 18).
Algunos autores refieren un efecto prioritario de la inoculación, que genera una

superioridad competitiva, donde el hongo introducido puede ocupar el espacio intraradical
más rápido que las especies locales (Dickie et al., 2012). En este estudio no se observó
un efecto prioritario en la inoculación de las raíces de la planta de yuca, puesto que la
especie Rhizophagus irregularis no fue la especie dominante en la comunidad, sin
embargo Rhizophagus sp si fue la dominante (Figura 12).
En la variedad CM4574-7, analizando la variable NRI basado en la presencia de OTUs

(Figura 16) se observa sobredispersión para algunos tratamientos (NRI<0), lo cual
sugiere fenómenos de competencia entre individuos. Sin embargo, estos resultados no
concuerdan con los resultados de Beta-diversidad donde no se observaron diferencias
entre tratamientos para esta variedad. Esto sugiere que para la variedad CM4574-7 la
ausencia o presencia de algunos OTUs no fue significativa en la diversidad total de las
comunidades, debido a que estos OTUs estaban en una muy baja proporción en la
comunidad.
De acuerdo con lo observado en la Figura 20, la competencia entre especies en este

estudio pudo ocurrir entre especies del mismo género (Rhizophagus sp). Esto sugiere
que para la planta de yuca en campo, aunque ocurre competencia entre especies de
diferentes géneros, el nivel taxonómico en el cual ocurre una competencia significativa
Capítulo 4 123
que marca diferencias entre tratamientos y diferenciación de nicho es a nivel inter-

especie.
No es posible deteminar cual de los OTUs encontrados corresponde a la línea de R.

irregularis inoculado. Sin embargo, no se encontraron OTUs particulares para ningún
tratamiento, solo el OTU180 (Rhizophagus sp4) que está presente en todas las plantas
inoculadas, y ausente en las plantas no inoculadas. Con la metodología utilizada en este
estudio, los resultados sugieren que con la inoculación no se están introduciendo nuevos
alelos a la población existente, y tampoco se están eliminando alelos, por lo tanto no se
observó una pérdida de la diversidad en la comunidad de HFMA.
Respecto al índice de Shannon, se observó que en la variedad MCOL2737 la

inoculación aumentó en promedio los valores encontrados para esta variable. Por el
contrario para la variedad CM4574, los valores no difieren entre tratamientos y fueron
más uniformes (Tabla 6). Para la variedad MCOL2737 la mayoría de las líneas ejercieron
un cambio sobre la estructura de la comunidad de HFMA. Solamente, para los
tratamientos S4 y Glomygel las comunidades HFMA fueron iguales a las plantas no
inoculadas.
La descripción de especies en ambientes no disturbados y en suelos agrícolas ha

aportado a la fecha información sobre la frecuencia de especies en ambientes
particulares, la presencia de especies dominantes y ha dado elementos para evaluar
fenómenos de competencia. Otros estudios han evaluado la dispersión de las especies
de HFMA en el mundo y si existe alguna relación con los factores ambientales y los
biomas terrestres (Davison et al., 2015). Sin embargo, pocos estudios han intentado
relacionar la composición de la comunidad con la funcionalidad de la simbiosis, es
sistema agricolas. En este estudio, se hizo un acercamiento a la pregunta de identificar
patrones en la comunidad de HFMA que estén relacionados con un aumento o una
dismunucion en la biomasa vegetal de plantas de yuca en campo. Con los resultados
aquí presentados, se sugiere que no existe una correlación positiva entre la diversidad de
las comunidades y el crecimiento de las plantas en campo. Por lo tanto, la riqueza o
abundancia de especies de HFMA presentes en las raíces no son significado de una
mayor productividad. Posiblemente otras características funcionales de las comunidades

deban ser evaluadas en futuros estudios.
5. Discusión general
Este estudio es altamente relevante para la ecológía de los HFMA por diferentes
razones. En primer lugar, la secuenciación de la comunidad de HFMA en las raíces de
yuca utilizando Illumina MiSeq, generó una abundante cantidad de secuencias que
aportó robustez y confianza en los resultados presentados en este estudio. Por lo tanto
este se convierte en un estudio de referencia que describe los hongos del filo
Glomeromycota que establecen simbiosis con plantas de interes agronómico en suelos
ácidos del trópico.
En segundo lugar, el análisis taxonómico realizado donde se agruparon las unidades

taxonómicas operacionales (OTUs) a nivel de especie, utilizando la estrategia RAxML-
EPA, permitió organizar los datos a un nivel más informativo. Otras investigaciones han
demostrado que el análisis basado en OTUs puede sobreestimar la diversidad y generar
información poco comparable con otros estudios (Öpik et al., 2010, 2013).
En tercer lugar, el uso de diferentes líneas de R. irregularis genéticamente diferentes,

aplicadas como inóculo, permitió mostrar la importancia de la variabilidad intra-específica
para esta especie, en relacion con el efecto que puede causar sobre la comunidad de
HFMA local. En este estudio se observó que no todas las líneas de R. irregularis generan
un disturbio sobre la comunidad de HFMA locales y que las líneas que causaron un
disturbio estan relacionadas genéticamente, es el caso de las líneas de R. irregularis del
grupo C3Sc2 (Figura 22).
En este estudio se encontró que la respuesta de la comunidad a la inoculación depende

de factores como la genética de la planta hospedera y también de la genética del hongo.
Para una de las variedades de yuca (CM4574-7) se observó que la inoculación con
diferentes líneas de R. irregularis no genera ningun efecto, aunque cambios en la
biomasa de la planta fueron evidentes relacionados con la inoculación (Anexo 32)
Por otro lado, las tecnologías de secuenciamiento masivo han avanzado a una velocidad
muy acelerada en los ultimos años. Es así que en el año 2014, el año en el cual se utilizó
la plataforma de Illumina MiSeq para secuenciar las librerías de ADN de este estudio, era
impensable utilizar Pacific Bioscience debido a la baja profundidad de secuenciamiento y
altos costos (Shokralla et al., 2012). Sin embargo, recientemente Schläppi y
colaboradores (2016) utilizaron esta tecnología para secuenciar un fragmento de 1.5 kb
correspondiente al operon ribosomal rDNA, que tiene una alta resolución de especies
para el filo Glomeromycota. Previamente Camenzid y colaboradores (2014) también
analizaron un fragmento más corto (720 bp) de la misma región genómica pero utilizando
la tecnología de pirosecuenciación Roche FLX 454.
Schläppi y colaboradores (2016) con sus resultados comparativos demuestran que más
que la tecnología utlizada para el secuenciamiento, es importante la región de ADN
seleccionada, pues es la que facilita o no la descripción de la comunidad de HFMA a
nivel de especie. En este estudio con el uso de la región SSU rDNA se amplificaron en
mayor medida secuencias del orden Glomerales. Sin embargo con nuestros resultados,
es difícil deteminar si la estructura de la comunidad de HFMA asociada a plantas de yuca
en campo, está representada en su mayoría por el orden Glomerales o es un sesgo del
marcador molecular utilizado. Para resolver esta pregunta,, será necesario hacer una
comparación amplificando las dos regiones (SSU rDNA y SSU-ITS-LSU rDNA) para la
misma muestra de raíces de yuca y utilizando la misma plataforma de secuenciamiento
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Este es el primer estudio donde se describe la comunidad de HFMA asociada a plantas

de yuca mantenidas en campo bajo un sisteáa agrícola comercial y se evaluó la dinámica
de las especies bajo dos agentes disturbantes como la fertilización fosfatada y la
inoculación con R. irregularis, utilizando análisis morfológico de esporas, secuenciación
Sanger de esporas y analisis metagenómico para la comunidad intraradical.
Con la inoculación de líneas alóctonas de R. irregularis, la riqueza de OTUs de la

comunidad intraradical de HFMA aumenta sin embargo no existe una ganancia o perdida
de especies de HFMA. Fluctuaciones en la abundancia de las especies que conforman la
comunidad intraradical de HFMA como respuesta a la inoculación de R. irregularis, son
las responsables de los cambios observados en este estudio. Por otro lado, la
fertilización fosfatada no genera cambios en la estructura de la comunidad intra ni
extraradical de los HFMA.
Los resultados de este estudios demuestran que no existe una relación directa entre las
morfoespecies mas abundantes en la rizósfera y la colonización intraradical. Diferentes
OTUs reportados, fueron clasificados a nivel de género como Rhizophagus sp, pero no
se pudieron clasificar a nivel de especie debido a la alta diversidad que presenta este
género.
Rhizophagus sp establece una asociación simbiótica con la planta de yuca y ocupa mas
del 60 % de la comunidad intraradical. Los resultados mostrados en este experimento
solo serían aplicables a la línea comercial de R. irregularis utilizada y no se pueden
extrapolar y afirmar que todos los aislados de esta especie de hongo tendrán el mismo
efecto sobre cultivos de yuca en campo. Rodriguez & Sanders (2014) sugieren que para
comprender un poco más sobre la ecología de las comunidades de HFMA, se deberían
realizar estudios a gran escala que incluyan diferentes tipos de suelo, aislados
geneticamente diferentes y diferentes hospederos.
Los resultados de esta investigación sugieren que tanto la línea inoculada como la
genética de la planta hospedera influyen en la respuesta de las comunidades de HFMA la
inoculación (Tabla 10). Adicionalmente, se pudo establecer que la perdida y o ganancia
de OTUs y los cambios en la abundancia no tienen ninguna relación con el
funcionamiento de la simbiosis, medido en biomasa de las raíces de la planta (Figura 20).
Es interesante por lo tanto analizar en detalle cada uno de los factores del sistema, para
entender el comportamiento de las comunidades HFMA y el impacto ecológico de la
inoculación sobre el filo Glomeromycota.
6.2 Recomendaciones
Las perspectivas de este trabajo están enfocadas a evaluar con más detalle la
interacción HFMA-planta, porque aunque esta simbiosis es ubicua y posible entre 250
especies de Glomeromycota y el 80% de las plantas terrestres (>200.000 especies), no
significa que las interacciones y los procesos metabólicos entre los simbiontes sean
procesos generalizados.
Futuras investigaciones deben realizarse para entender mucho mejor el comportamiento

del inóculo en las raíces de las plantas de yuca y desarrollar metodologías para
129
identificar que las líneas de R. irregularis inoculadas colonizaron eficientemente las

raíces de yuca.
Tambien se sugiere evaluar la comunidad de HFMA en otros sistemas suelo-planta, lo

cual daría una imagen mas completa de lo que ocurre en el suelo con un enfoque
ecológico.
Los enfoques de la investigación en comunidades de HFMA se deberán direccionar hacia

el estudio funcional de las especies, más que su presencia o ausencia y por lo tanto
incluir el análisis de la diversidad funcional de las diferentes aislados locales o alóctonos
de R. irregularis.
7. Anexos
Anexo 1. Análisis físico-químico de los suelo del experimento No. 1 antes de la siembra.
131
Anexo 2. Diseño experimental, experimento 1.
P : Número de parcela; %P: Porcentaje de fertilizante fosfatado aplicado en cada bloque.

El color azul indica los bloques que fueron inoculados con Glomygel ®.
Anexo 3. Proceso metodológico para el análisis filogenético. Todos los árboles se

procesaron calculando 1000 bootstrap y con el modelo de sustitución GAMMAGTR.
RAxML para RAxML para

Parámetro RAxML básico RAxML - EPA
OTUs-HFMA blackbone
RAxML sin árbol de RAxML sin árbol de RAxML sin árbol de RAxML con arbol de
Tipo de análisis
referencia base referencia base referencia base referencia base
1.Secuencias de
Secuencias consenso Secuencias de referencia 1. OTUs-HFMA
Secuencias identificadas como referencia (Kruger y 2. OTUs-HFMA (77) 2. Secuencias
OTUs-HFMA cols., 2012) 3. Secuencias esporas
esporas (35)
Número de
78 (77 OTUs +
secuencias en 965 1077 112
outgroup)
el análisis
Presencia de
secuencias de
referencia en el No No aplica Si No
alineamiento
MAFFT *
Uso de
alineamiento No aplica, las
base o secuencias de
No Si No
referencia en el referencia ya estaban
MAFFT ** alineadas.
(-add)
Grupo externo Schizosaccharomyces
Geosiphon pyriformis Geosiphon pyriformis Geosiphon pyriformis
(outgroup) pombe
Tiempo 2 min 8 min 120 min 2.4 min

computacional Núcleos=12 Núcleos=48 Núcleos =48 Núcleos=12
Clados de familias con
bajo valor de
Ubicación de
Define secuencias de Árbol de referencia bootstrap.
secuencias blanco a
Resultado HFMA a nivel de para EPA. Buena Secuencias de la
nivel de genero y/o
familia definición de clados. misma especie con
especie
alto valor de
bootstrap.
Figura o anexo Figura 6 Anexo 5 Anexo 4 Figura 7
* Presencia de secuencias de referencia en el alineamiento MAFFT: significa que en el

alineamiento previo a el calculo del arbol de Maxima verosimilitud, se incluían secuencias de
referencia
**Uso de alineamiento base en el MAFFT (-add o constraint): en el alineamiento MAFFT existe la
opción de incluir un alineamiento de referencia que sirve como molde para el alinemiento de las
secuencias blanco. Es un método para aumentar la precisión del análisis.
133
Anexo 4. Figura del árbol filogenético RAxML básico para las secuencias de HFMA
blanco utilizando las secuencias de referencia.
Valores
bootstrap mas
bajos que en
arbol
blackbone
Secuencias de
la misma
especie con
bootstrap alto
Continuación Anexo 7. RaxML básico.
Secuencias de
esporas.
No corresponde
con la morfología
135
Anexo 5. Arbol filogenetico de referencia (blackbone) para el análisis EPA en HFMA.

Construido con secuencias de referencia de la región larga SSU-ITS-LSU rDNA.
Continuación … Arbol filogenetico de referencia (blackbone).

137
Anexo 6. Arbol filogenético RaxML-EPA para las secuencias de HFMA utilizando la

región SSU rDNA obtenidas en este estudio. En negro las secuencias de referencia, en
azul las secuencias provenientes de morfoespecies y en rojo las secuencias provenientes
de raíces. Los números sobre las ramas representan los valores bootstrap calculados en
el árbol de referencia. Los números en parentesis corresponde al número de morfotipos
identificados para la especie.
Parte I. Familia Glomeraceae
Rhizophagus
irregularis (5)
Rhizophagus
intraradices (2)
Rhizophagus sp1
Parte II. Continuación anexo 6. Arbil filogenético RAxML-EPA. Familia Glomeraceae (azul
y verde), Familia Claroideoglomeraceae (aguamarina) y Familia Acaulosporaceae
(Amarillo).
Claroideoglomus sp2 (12)
Claroideoglomus sp1 (1)
Acaulospora sp2 (1)

139
Parte III. Continuación anexo 6. Arbol filogenético RaxML-EPA. Orden taxonómico

Diversisporales.
Redeckera sp (1)
Diversispora sp1 (1)
Diversispora sp2 (1)
Diversispora celata (5)

Anexo 7. Esquema representativo de la región SSU rDNA en el filo Glomeromycota. Las

fechas representan los sitios de unión de los cebadores utilizados en el análisis de la
diversidad de HFMA (Van Geel et al., 2014). La tabla contiene las secuencias de los
cebadores utilizados en este estudio.
Tamaño del
Cebadores Secuencia (5’-3’) Referencia
fragmento
AML1 ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA 800 bp Lee et al., 2008
AML2 GAACCCAAACACTTTGGTTTCC 800 bp Lee et al., 2008
NS31 TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC 550 bp Simon et al., 1992
AM1 GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA 550 bp Helgason et al 1998
141
Anexo 8. Lista de secuencias cortas (barcodes) adicionadas al extremo 5' del cebador
NS31, para la construcción de las librerías de ADN.
Barcode Secuencia Barcode Secuencia

1 AACAG 20 GAGCA
2 AATGC 21 GAGGT
3 ACAGT 22 GCAAC
4 ACGTG 23 GCCTA
5 ACTCC 24 GCTAA
6 AGAAG 25 GCTTG
7 AGACT 26 GGAGA
8 AGTCG 27 GGCAT
9 ATAGG 28 GTACT
10 ATGTC 30 GTAGC
11 CACCA 31 GTCAA
12 CACTG 32 GTTCG
13 CCAAG 33 TAACG
14 CCATT 34 TAGAG
15 CCTTA 35 TATCC
16 CGAAT 36 TCATG
17 CTGTA 37 TCCAT
18 CTTGC 38 TCGGT
19 GACAC 39 TCGTC
40 TGGAA
Anexo 9. Estandarización del algoritmo DBC454 para los datos de este estudio.
143
Anexo 10. Análisis estadístico para diversidad alfa de la comunidad de HFMA en el

suelo rizosférico, basado en la información de esporas.
DENSIDAD
RIQUEZA
UNIFORMIDAD
INDICE DE SHANNON
INDICE DE SIMPSON
Anexo 11. Diferencias estadísticas entre especies de HFMA en el suelo rizosférico de

plantas de yuca en campo, basado en los datos de esporas. Las letras diferentes indican
diferencias significativas con un α=0.05.
Glomus
145
Claroideoglomus
Rhizophagus
Diversispora
Acaulospora
Anexo 12. Análisis estadístico PERMANOVA para las comunidades de HFMA inoculadas
con Glomygel ®, experimento 1.
147
Anexo 13. Análisis SIMPER para evaluar las especies que influyen en los cambios de las
comunidades inoculadas. Experimento 1.
Anexo 14. Selección de cebadores para la amplificación de regiones con polimorfismos

(SNPs) en cada grupo genético de R. irregularis.
TABLA SELECCIÓN SNPs, GRUPO GENÉTICO 1
Número Scaf Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre Dímer Amplifi Seleccion
de fold otros genomas disponibles os ca ado
cebador otros
microo
rganis
mos
1 11- No No Si
0
11- No No Si
1
11- No No Si
2
2 21 Se identificó SNP pero no se logró diseñar
cebadores
cebadores
5-0 cebadores
5 14 No Si No
5-1
6 15 No No Si
3-0
15 No No Si
3-1
15 No No Si
3-2
7 31 Si No Si
1-0
31 No Si No
1-1
31 No No Si
1-2
149
8 36 Si Si No
3-0
36 Si No No
3-1
36 Si No No
3-2
2 cebadores
10 63 No No Si
6-0
63 No No Si
6-1
63 No No Si
6-2
11 81 Si No No
5-0
81 Si No No
5-1
12 14 No No Si
64-
0
Si.
14 No Oryza No
64- sativa
japonica
1
14 Si No No
64-
2
13 23 No No Si
63-
0
23 No No Si
63-
1
23 No No Si
63-
2
14 30 Si No No
64-
0
30 No Si No
64-
1
Parásito de aves
30 No Si No
64-
2
Cianobacteria
Self-Dimers:
1 dimer for: Seq311-0L

5-sgcactcaaactttctgaaactcga->
| |||| |||| |
<-agctcaaagtctttcaaactcacgs-5
2 dimers for: Seq363-0L

5-scttggaaggaggatcatgctca->
|| |||| ||
<-actcgtactaggaggaaggttcs-5
5-scttggaaggaggatcatgctca->
|| | |||| | ||
<-actcgtactaggaggaaggttcs-5

5-tgcttggaaggaggatcatgc->
| | |||| | |
<-cgtactaggaggaaggttcgt-5
2 dimers for: Seq363-2L

5-tggaaggaggatcatgctcataa->
| || |||| || |
<-aatactcgtactaggaggaaggt-5
5-tggaaggaggatcatgctcataa->
| || | |||| | || |
<-aatactcgtactaggaggaaggt-5

5-aatatttgacacctagggcccg->
||||||
<-gcccgggatccacagtttataa-5

5-saatgaaatatttgacacctagggc->
| |||||||| |
<-cgggatccacagtttataaagtaas-5
1 dimer for: Seq1464-2R

5-tcagggatcgatttcatattatgga->
151
| |||| |||| |
<-aggtattatactttagctagggact-5
1 dimer for: Seq3054-0R

5-ccatttcttcagtggcttgatca->
||||||
<-actagttcggtgacttctttacc-5
Núm Scaf Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre Dím Amplifica Selecci
ero fold otros genomas disponibles eros otros onado
de microorga
ceb nismos
ador
1 2 Se identificó SNP pero no se logró diseñar - - -
cebadores
cebadores
cebadores
4 88- No No Si
0
88- No No No
1
88- Si No No
2
5 160 No No Si
-0
160 No No Si
-1
160 No No Si
-2
6 177 Si No No
-0
7 192 No No Si
-0
192 No No Si
-1
192 No No Si
-2
8 200 No No Si
-0
cebadores
10 334 No No Si
-0
334 No Si No
-1
Macaca fascicularis: Macaco cangrejero

Neospora caninum
Triticum aestivum
334 Si Si No
-2
11 599 No No Si
-0
599 Si Si No
-1
599 Si No No
-2
12 996 No No Si
-0
996 No No Si
-1
996 No No Si
-2
13 146 No No Si
4-0
146 No Si No
4-1
146 Si No No
4-2
14 172 Si No No
3-0
172 No Si No
3-1
Haemonchus placei
153
172 No Si No
3-2
Self-Dimers:
1 dimer for: 5
5-tgtgtgacagaattcatataggca->
| | |||| | |
<-acggatatacttaagacagtgtgt-5
1 dimer for: 13
5-acgcgaatctctaacaattgatatt->
|| |||||| ||
<-ttatagttaacaatctctaagcgca-5
1 dimer for: 32
5-cccttcagaagagcgactaact->
| |||| |||| |
<-tcaatcagcgagaagacttccc-5
1 dimer for: 34
5-agcgactaactcaggtgatcaa->
||||||
<-aactagtggactcaatcagcga-5
1 dimer for: 46
5-tcagggatcgatttcatattatgga->
| |||| |||| |
<-aggtattatactttagctagggact-5
1 dimer for: 48
5-tgcctgattttcctgatgatatcg->
||||||
<-gctatagtagtccttttagtccgt-5
Cross Primer Dimers:

5 with 6
5
5-tgtgtgacagaattcatataggca->
|||| | | || | ||
<-aacacagacccaatgtactatgt-5
27 with 28
27
5-cctcttcttcttcctcctcttca->
|||||| |
<-ggaggacagcatacaaggactg-5
TABLA SELECCIÓN DE SNPs, GRUPO GENÉTICO 3
Nú
Ampli
mer
fica Sele
o
Scaff Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre otros ccio
de Dímeros
nad
old otros genomas disponibles micro
ceb o
organ
ado
ismos
r
1 1-0 No Si No
Stegastes partitus
Candida dubliniensis
Echinostoma caproni
Brugia pahangi
1-1 No No Si
1-2 Si No No
2 10- Si Si No
0
10- Si No No
1
10- No No No
2
3 16 Se identificó SNP pero no se logró diseñar cebadores
4 32- No Si No
0
Anaerostipes hadrus
32- No No Si
1
32- No No Si
2
5 57- No No Si
0
57- No No Si
1
155
57- No No Si
2
6 278 No No Si
-0
278 No No Si
-1
278 Si No No
-2
7 316 Si No No
-0
316 No No No
-1
8 406 No No Si
9 554 No Si No
-0
Heligmosomoides polygyrus
554 No Si No
-1
Vitis vinifera
554 No No No
-2
11 638 Si No No
-0
638 No No Si
-1
638 Si No Si
-2
12 658 No No Si
-0
658 No No Si
-1
658 Si No Si
-2
13 121 Se identificó SNP pero no se logró diseñar cebadores -
3
14 146 No No Si
4-0
146 No Si No
4-1
15 211 No No Si
7-0
Self-Dimers:
1 dimer for: 5
5-gtcaagtggtaaaggtgaaatttga->
| |||||| |
<-agtttaaagtggaaatggtgaactg-5
1 dimer for: 10
5-agtaaaacgtaatccaaaagctgt->
| |||| |
<-tgtcgaaaacctaatgcaaaatga-5
1 dimer for: 29
5-tgaagagggaattgtaccattgc->
| ||| |||| ||| |
<-cgttaccatgttaagggagaagt-5
1 dimer for: 31
5-tctgctggcattgacacatatct->
| |||| |
<-tctatacacagttacggtcgtct-5
1 dimer for: 32
5-gaaactacaacactatcccaattgt->
||||||
<-tgttaaccctatcacaacatcaaag-5
2 dimers for: 44
5-gacgtccatcctctatcgatcg->
||||||
<-gctagctatctcctacctgcag-5
5-gacgtccatcctctatcgatcg->
| |||||| |
<-gctagctatctcctacctgcag-5
2 dimers for: 48
5-tccatcctctatcgatcgaacc->
| |||| |
<-ccaagctagctatctcctacct-5
157
5-tccatcctctatcgatcgaacc->
|| |||||| ||
<-ccaagctagctatctcctacct-5
Cross Primer Dimers:

5 with 6
5
5-gtcaagtggtaaaggtgaaatttga->
| |||||| || |
<-tccaccatgacctagactccat-5
7 with 8
7
5-cgcaaataacggtttaactgaga->
||||||
<-ttgactacctcctaaacagcct-5
53 with 54
53
5-tgagtgcaaatgatgatgacaca->
|||||| || |
<-acgtttgagtgaccttttgaga-5
TABLA SELECCIÓN SNPs, GRUPO GENETICO 5
# Scaf Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC y amplificación sobre Dím Amplifica Selecci
SN fold otros genomas disponibles eros otros onado
Ps microorga
nismos
1 38- Si Si No
0
38- No Si* Si
1
38- No Si* Si
2
2 636 No No Si
-0
636 No No Si
-1
636 No No Si
-2
3 815 Si No No
-0
815 Si No No
-1
4 172 No No Si
3-0
172 No Si No
3-1
Caenorhabditis elegans
Haemonchus placei
172 No No Si
3-2
Sc Resultados en Primer-BLAST Tm, %GC Dí Amplifica Sel

a- me otros ecc
ffol ros microorg ion
d anismos ad
o
1 23- No No Si
0
23- No Si No
1
23- No No Si
2
9
3 12 No Si Si
68-
0
Lichtheimia ramose
Bipolaris oryzae
12 No Si No
68-
1
159
Pseudogymnoascus destructans
Lichtheimia ramosa
12 No Si No
68-
2
Wallemia ichthyophaga
Lichtheimia ramose
Scedosporium apiospermum
Metarhizium brunneum
4 21 No No No
17-
0
No hay formación de dímeros para ninguna pareja de cebadores ni para ningun cebador analizado independientemente.
Anexo 15. Alineamiento de secuencias amplificadas con los cebadores Scaffold1268

para el grupo genético #6 de Rhizophagus irregularis.
161
Anexo 16. Diagrama para la obtención de líneas de R. irregularis de primera y segunda

generación en cultivo in-vitro. Imagen modificada de (Koch, 2006).
Aislamiento de líneas parentales de R. irregularis desde muestras de campo.

b) Líneas de Rhizophagus irregularis de primera y segunda generación.

163
Anexo 17. Análisis fisico-químico para el suelo del experimento 2.

Anexo 18. Esquema de la distribución de los tratamientos en campo.
Ubicación de los bloques en el área de estudio para el experimento 2. En total se

establecieron nueve bloques, cada uno contenía una réplica de cada tratamiento. En la
siguiente imagen cada número
Representación de un bloque: Los bloques estaban conformados por veintitrés

caballones (filas amarillas en la gráfica) de los cuales solo nueve contenían tratamientos
(números en casilla blanca). Cada unidad experimental estaba rodeada por plantas de la
variedad MCOL2737 sin inocular (números en casilla amarilla), lo cual se denominó
efecto borde. De forma horizontal, las unidades experimentales estuvieron separadas
por un caballón y una planta de yuca no inoculada. De forma vertical, es decir dentro del
mismo caballón, las unidades experimentales estuvieron separadas por dos plantas de
165
yuca no inoculadas. Los cuadros blancos numerados representan las plantas tratamiento,
donde aleatoriamente se distribuyeron los 36 tratamientos.
Anexo 19. Análisis estadístico para evaluar las diferencias entre las comunidades de
HFMA intraradicales en las dos variedades de yuca sin inocular (Tratamiento control-
H2O).
a) PERMANOVA
Resultado= SI hay un efecto de la variedad de yuca sobre la estructura de las
comunidades de HFMA que colonizan las raíces a los 12 meses despues de la siembra.
167
b) Diferencias entre la comunidad de HFMA a nivel de especie, entre las dos variedades
de yuca utilizadas en este estudio.
Especie HFMA putativa Test normalidad Test homocedasticidad Prueba estadística

(Shapiro wilk) (Levene)
R. irregularis 0.0024 0.2911 KW: 0.0066
Rhizophagus sp1 0.0084 0.9716 KW: 0.010
Rhizophagus sp2 0.5147 0.1661 ANOVA: 0.0100
GlomusNORh 0.0963 0.871 ANOVA: 0.1354
Acaulospora sp1 0.2612 0.4739 ANOVA: <0.0001
Acaulospora sp2 0.1383 0.2171 ANOVA: 0.0245
Acaulospora sp3 0.1510 0,6246 ANOVA: 0.0253
S. cerradensis 0.0004 0.643 ANOVA: 0.0665

Anexo 20. Comparaciones entre la comunidad de HFMA presente en suelo rizosférico

antes de la siembra y en las raíces de plantas de yuca sin inocular a los 3 y 12 meses
después de la inoculación, para las dos variedades de yuca.
a) Comparación entre la comunidad de HFMA en las dos variedades de yuca, a los 12

meses despues de la siembra (plantas no inoculadas – H2O).
169
b) Comparación entre la comunidad de HFMA en la variedad de yuca MCOL2737 a los 3

y 12 meses después de la siembra, con la comunidad HFMA en el suelo antes de iniciar
el experimento
C) Comparación entre la comunidad de HFMA en la variedad de yuca CM4574-7 a los 3

y 12 meses después de la siembra, con la comunidad HFMA en el suelo antes de iniciar
el experimento
171
d) Comparación entre la comunidad de HFMA en la variedad de yuca MCOL2737 a los 3

y la comunidad en la misma variedad a los 12 meses después de la siembra.
e) Comparación entre la comunidad de HFMA en la variedad de yuca CM4574 a los 3 y

la comunidad en la misma variedad a los 12 meses después de la siembra
Anexo 21. Análisis multivariado para medir el efecto de la variedad y la inoculación con
R. irregularis sobre las comunidades de HFMA a los 12 meses después de la inoculación.
173
Anexo 22. Diferencias en las comunidades de HFMA inoculadas con R. irregularis para
cada una de las variedades de yuca.
a) variedad de yuca MCOL2737 – comparación entre todos los tratamientos

175
b) Variedad de yuca CM4574-7 – comparación entre todos los tratamiento

Anexo 23. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R.
irregularis versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad MCOL2737.
DIFERENCIAS ENTRE EL EFECTO DE LA INOCULACIÓN CON CADA LÍNEA DE R.

irregularis Y PLANTAS NO INOCULADAS.
Línea D1
LINEA C2
Linea C3
177
Línea S4
Línea S4b
Línea S4c
179
Línea C3Sc1
Línea C3Sc1a
Línea C3Sc1d
181
Línea C3SC1e
Línea Sc2
183
Línea Sc2a
Línea Sc2b
185
Línea Sc2c
Línea Sc2d
187
Anexo 24. Comparaciones uno a uno entre comunidades de HFMA inoculadas con R.
irregularis versus comunidades de HFMA no inoculadas, en la variedad CM4574-7.
Línea D1
Línea C2
189
Línea C3
Línea S4
191
Línea S4b
Linea S4c
193
Línea Sc1
Línea Sc1a
Línea Sc1d
195
Línea Sc1e
Línea Sc2
197
Línea Sc2a
Línea Sc2b
199
Línea Sc2c
Línea Sc2d
201
Anexo 25. Análisis de varianza multivariado con permutaciones usando matrices de

distancia (ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con diferentes grupos
genéticos de aislados de R. irregularis. Evaluadas a los 12 meses después de la
inoculación, para la variedad MCOL2737
a) Comparaciones entre las comunidades de HFMA presentes en plantas de yuca

variedad MCOL2737, inoculadas con los aislados llamados PARENTALES, sin incluir las
comunidades de HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
203
b) Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad MCOL2737

inoculadas con el grupo de aislados C2 incluyendo las líneas segregadas, sin incluir las
comunidades de HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
c) Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad MCOL2737

inoculadas con el grupo de aislados C3Sc1 incluyendo las líneas segregadas, sin incluir
las comunidades de HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL
EL GRUPO C3SC1 ENTRE ELLOS SIN AGUA: NO HAY DIFERENCIAS, SI

HOMOCEDASTICIDAD CON UN ALFA DE 0.1
205
d) Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad MCOL2737

inoculadas con el grupo de aislados C3Sc2 incluyendo las líneas segregadas, sin incluir
las comunidades de HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
C3Sc2all SIN AGUA

207
Anexo 26. Análisis de varianza multivariado (ADONIS) para evaluar el efecto de la

inoculación con diferentes grupos de aislados de Rhizophaugus irregularis, en la variedad
MCOL2737 incluyendo el control (plantas no inoculadas).
Grupos genéticos MCOL2737

Comparaciones que incluyen el control (H2O)
Parentales D1, C2, C3, H2O 0.0039*
Parentales D1, C2, C3, Glomygel, H2O 0.0069*
C2 C2, S4, S4b, S4c, H2O 0.0044*
C3Sc1 C3, C3Sc1, segregadas, H2O 0.0004*
C3Sc2 C3, C3Sc2 y segregadas, H2O 0.0004*
Anexo 27. Análisis de varianza multivariado con permutaciones usando matrices de

distancia (ADONIS) para evaluar el efecto de la inoculación con diferentes grupos
genéticos de aislados de R. irregularis. Evaluadas a los 12 meses después de la
inoculación, para la variedad CM4574-7
a)Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad CM4574-7 inoculadas

con líneas de R. irregularis del grupo génetico “parentales” sin incluir las comunidades
de HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
b) Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad CM4574-7 inoculadas

con líneas de R. irregularis del grupo génetico “C2” sin incluir las comunidades de HFMA
no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
209
varianza
c) Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad CM4574-7 inoculadas

con líneas de R. irregularis del grupo génetico “C3Sc1” sin incluir las comunidades de
HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
d) Comparaciones entre las comunidades de HFMA de la variedad CM4574-7 inoculadas

con líneas de R. irregularis del grupo génetico “C3Sc2” sin incluir las comunidades de
HFMA no inoculadas ni las inoculadas con GLOMYGEL.
211
Anexo 28. Comparación entre las comunidades de HFMA inoculadas con la línea
parental C3, la línea de primera generación Sc2 y sus segregadas (Líneas de segunda
generación), para la variedad MCOL2737 a los 12 mdi.
a) Diferenias entre la línea C3 y sus segregadas. Análsisis estadístico
Test
Prueba
Especie putativa Test Normalidad Homocedastici Diferencias
estadística
dad
C3 Sc2 Sc2 Sc2 Sc2

a b c d
R. irregularis 0.5160 0.1394 ANOVA:

0.0634
Rhizophagus sp1 0.0638 0.3241 ANOVA:

0.2285

0.9439

0.8747
Rhizophagus sp4 0.7169 0.3316 ANOVA: AB A AB AB B

0.0285
Rhizophagus sp5 0.4054 0.0534 ANOVA: A B B AB AB

0.0060

0.8867
Rhizophagus sp7 0.4094 0.0008 KW: 0.0315 A B AB AB A
GlomusNORh 0.7511 0.0029 KW: 0.1127
Acaulospora sp1 0.4335 0.0023 KW: 0.0129 A B AB AB A
Acaulospora sp2 0.0242 0.0195 KW: 0.1826
Acaulospora sp3 0.6175 0.1035 ANOVA: B A B AB B

0,0020
S. cerradensis 0.0001 0.0029 Welch: 0.5065
KW: prueba no paramétrica de Kruskall-Waliis

b) Diferencias entre la comunidad inoculada con la línea C3, Sc2 y la comunidad de
HFMA no inoculada
Especie Test Test Prueba

Diferencias
putativa Normalidad Homocedast estadística
213
icidad
SC2 C3 H2O
R. irregularis 0.077 0.6464 KW: 0.0015 A A B
Rhizophagus 0.011 0.2581 KW: 0.0012 B B A

sp1
Rhizophagus 0.0509 0.0803 ANOVA: A AB B

sp2 0.0011
Rhizophagus 0.093 0.1621 KW: 0.0006 A A B

sp3

sp4

sp5
Rhizophagus 0.5843 0.2174 ANOVA: A A A

sp6 0.3101
Rhizophagus 0.2929 0.0048 WELCH: A A B

sp7 0.0017
GlomusNORh 0.630 0.296 ANOVA: A AB B

0.0074
Acaulospora 0.3995 0.0389 ANOVA: A A B

sp1 <0.0001
Acaulospora 0.0209 0.0500 ANOVA: A AB B

sp2 0.0523
Acaulospora 0.1803 0.7820 ANOVA: A A B

sp3 <0.0001
S. 0.0009 0.1592 ANOVA: A AB B

cerradensis 0.0266

215
Anexo 29. Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con GLOMYGEL
y FILTRADO versus las comunidades de HFMA no inoculadas (H2O) para las dos
variedades de yuca MCOL2737 y CM4574
a) GLOMYGEL VS AGUA DOS VARIEDADES

217
b) Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con GLOMYGEL y la

comunidad de HFMA en plantas no inoculadas, solo para la variedad MCOL2737
GLOMYGEL AGUA SOLO V2737
c) Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con GLOMYGEL y la

comunidad de HFMA en plantas no inoculadas, solo para la variedad CM4574
GLOMYGEL AGUA SOLO 4574

219
Anexo 30. Comparaciones entre las comunidades de HFMA inoculadas con FILTRADO y
la comunidad de HFMA en plantas no inoculadas, solo para la variedad MCOL2737, a los
12 mdi.
221
Anexo 31. Comparación entre las comunidades HFMA inoculadas con Filtrado y
Glomygel y las comunidades HFMA no inoculadas a los 12 mdi, para la variedad de yuca
MCOL2737.
Test
Especie Test Prueba
Homocedast Diferencias
putativa Normalidad estadística
icidad
Filtrado Glomygel H2O
R. irregularis 0.0336 0.1478 KW: 0.0065 A B B
Rhizophagus 0.0688 0.4634 KW: 0.117 A AB B

sp1
Rhizophagus 0.5823 0.9544 ANOVA:0.1

sp2 720
Rhizophagus 0.5024 0.5029 ANOVA: A B B

sp3 0.0008

sp4
Rhizophagus 0.0159 0.2758 KW: 0.0133 A AB B

sp5
Rhizophagus 0.9376 0.2313 ANOVA:

sp6 0.2930
Rhizophagus 0.8054 0.6633 ANOVA:

sp7 0.0614
GlomusNORh 0.2750 0.2524 ANOVA:

0.2340
Acaulospora 0.9562 0.7296 ANOVA: A B B

sp1 0.0016
Acaulospora 0.2359 0.9026 ANOVA:

sp2 0.1014
Acaulospora 0.2962 0.0050 ANOVA: A AB B

sp3 0.017
S. 0.0017 0.9023 KW: 0.0404 A AB B

cerradensis

Anexo 32. Datos de biomasa de la planta de yuca inoculada con las líneas de R.
irregularis. Análisis estadístico.
a) Datos biomasa de la planta de yuca y porcentaje de colonización radical. Promedio

por tratamiento. Datos suministrados por Isabel Ceballos (Ceballos, 2016)
DATA FOR CASSAVA VARIETY MCOL2737, 12 MONTHS AFTER INOCULATION
12 months after inoculation

Treatment DryWeightAverage (Kg) % COLONIZATION Average
H2O 0.124487937 69.5
Fil 0.211468368 64.85
Glo 0.312940052 78.33333333
D1 0.126734737 85.5
C2 0.163638804 43.85
C3 0.170502534 71.36666667
S4 0.319297634 66.3
S4b 0.105837299 69.56666667
S4c 0.183172637 68.46666667
Sc1 0.195524641 59.15
Sc1a 0.208364074 64.95
Sc1d 0.190442758 81.05
Sc1e 0.079001625 54.23333333
Sc2 0.1904865 62.925
Sc2a 0.089650801 56.7
Sc2b 0.133421098 38.63333333
Sc2c 0.078188014 73.2325
Sc2d 0.1239 54.85

DATA FOR CASSAVA VARIETY CM4574, 12 MONTHS AFTER INOCULATION
Treatment DryWeightAverage (Kg) %COLONIZATION Average(Kg)
H2O 0.34597743 35.5
Fil 1.000782139 35.3
Glo 1.432014082 72.93333333
D1 0.941158006 25.55
C2 1.136923624 87.23333333
223
C3 1.313862283 44
S4 1.475698809 68.13333333
S4b 1.147050136 73.66666667
S4c 1.084718161 76.7
Sc1 1.392028668 82.85
Sc1a 1.270750104 57.16666667
Sc1d 0.832451893 57.7
Sc1e 0.809489082 77.53333333
Sc2 1.090477294 78.06666667
Sc2a 0.993988862 89.33333333
Sc2b 0.93724654 66.1
Sc2c 1.126674037 58.9
Sc2d 0.961679133 50.3
b) Análisis estadístico. Comparaciones de Pearson.
MCOL2737: Riqueza vs Colonización intraradical
MCOL2737: Riqueza vs DryWeight

MCOL2737: Indice de Shannon vs Colonización intraradical
MCOL2737: Indice de Shannon vs DryWeight
CM4574:Riqueza Vs Colonizacion
225
CM4574-7: riqueza vs DryWeight
CM4574-7 Shannon vs DryWeight
CM4574-7: Shannon vs %colonización

Bibliografía
Aguilar-Fernandez M, Jaramillo VJ, Varela-Fregoso L, Gavito ME. 2009. Short-term

consequences of slash-and-burn practices on the arbuscular mycorrhizal fungi of a
tropical dry forest. Mycorrhiza 19: 179–186.
Alguacil M del M, Lozano Z, Campoy MJ, Roldan A. 2010. Phosphorus fertilisation

management modifies the biodiversity of AM fungi in a tropical savanna forage system.
Soil Biology and Biochemistry 42: 1114–1122.
Alguacil MM, Lumini E, Roldán A, Salinas-García JR, Bonfante P, Bianciotto V.

2008. The impact of tillage practices on arbuscular mycorrhizal fungal diversity in
subtropical crops. Ecological Applications 18: 527–536.
Alkan N, Gadkar V, Yarden Q, Kapulnik Y. 2006. Analysis of quantitative interactions

between two species of arbuscular mycorrhizal fungi, Glomus mosseae and G.
intraradices, by real-time PCR. Applied and Environmental Microbiology 72: 4192–4199.
Allem A. 1994. The origin of Manihot esculenta Crantz (Euphorbiaceae). Genetic

Resources and Crop Evolution. 41: 133–150.
Amézquita E, Hoyos P, Molina D, Chávez L, Galvis J. 2003. Resultados de la

investigación en suelos de la altillanura colombiana 1996 - 2002. CIAT. Ministerio de
Agricultura (MADR): 46.
Angelard C, Colard A, Niculita-Hirzel H, Croll D, Sanders IR. 2010. Segregation in a

mycorrhizal fungus alters rice growth and symbiosis-specific gene transcription. Current
biology 20: 1216–1221.
Angelard C, Sanders IR. 2011. Effect of segregation and genetic exchange on

arbuscular mycorrhizal fungi in colonization of roots. New Phytologist 189: 652–657.
Antunes PM, Koch AM, Dunfield KE, Hart MM, Downing A, Rillig MC, Klironomos
JN. 2009. Influence of commercial inoculation with Glomus intraradices on the structure
and functioning of an AM fungal community from an agricultural site. Plant and Soil 317:
257–266.
Appoloni S, Lekberg Y, Tercek MT, Zabinski CA, Redecker D. 2008. Molecular

community analysis of arbuscular mycorrhizal fungi in roots of geothermal soils in
Yellowstone National Park (USA). Microbial Ecology 56: 649–659.
Bainard LD, Bainard JD, Hamel C, Gan Y. 2014. Spatial and temporal structuring of
arbuscular mycorrhizal communities is differentially influenced by abiotic factors and host
229
crop in a semi-arid prairie agroecosystem. FEMS Microbiology Ecology 88: 333–344.
Bécard G, Fortin JA. 1988. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on

Ri T-DNA transformed roots. New Phytologist 108: 211–218.
Bever J, Morton J, Antonovics J, Schultz P. Host-dependent sporulation and species

diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in a mown grassland. Journal of Ecology 84: 71–
82.
Bhadalung NN, Suwanarit A, Dell B, Nopamornbodi O, Thamchaipenet A,

Rungchuang J. 2005. Effects of long-term NP-fertilization on abundance and diversity of
arbuscular mycorrhizal fungi under a maize cropping system. Plant and Soil 270: 371–
382.
Bidartondo MI, Bruns TD, Blackwell M, Edwards I, Taylor AFS, Horton T, Zhang N,
Koljalg U, May G, Kuyper TW, et al. 2008. Preserving accuracy in GenBank. Science
319: 5870.
Błaszkowski J. 2012. Glomeromycota. Institute of Botany, Polish Academy of Sciences

1: 2–297.
Bloem J, Schouten AJ, Srensen SJ, Rutgers M, Werf A van der, Breure AM. 2005.
Monitoring and evaluating soil quality.
Börstler B, Raab PA, Thiéry O, Morton JB, Redecker D. 2008. Genetic diversity of the
arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices as determined by mitochondrial large
subunit rRNA gene sequences is considerably higher than previously expected. New
Phytologist 180: 452–465.
Börstler B, Renker C, Kahmen A, Buscot F. 2006. Species composition of arbuscular

mycorrhizal fungi in two mountain meadows with differing management types and levels
of plant biodiversity. Biology and Fertility of Soils 42: 286–298.
Börstler B, Thiéry O, Sýkorová Z, Berner A, Redecker D. 2010. Diversity of

mitochondrial large subunit rDNA haplotypes of Glomus intraradices in two agricultural
field experiments and two semi-natural grasslands. Molecular ecology 19: 1497–1511.
Breslauer KJ, Frank R, Blöcker H, Marky L a. 1986. Predicting DNA duplex stability
from the base sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 83: 3746–3750.
Brito I, Goss M, de Carvalho M. 2012a. Effect of tillage and crop on arbuscular

mycorrhiza colonization of winter wheat and triticale under Mediterranean conditions. Soil
Use and Management 28: 202–208.
Brito I, Goss MJ, de Carvalho M, Chatagnier O, van Tuinen D. 2012b. Impact of tillage
system on arbuscular mycorrhiza fungal communities in the soil under Mediterranean
conditions. Soil and Tillage Research 121: 63–67.
Brock PM, Döring H, Bidartondo MI. 2009. How to know unknown fungi: The role of a
herbarium. New Phytologist 181: 719–724.
Brundrett M. 1991. Mycorrhizas in natural ecosystems. Advances in Ecological 21: 171–

313.
Brundrett CM, Abbott KL, Jasper AD. 1999. Glomalean mycorrhizal fungi from tropical
Australia. Mycorrhiza 8: 305–314.
Cadavid L. 1980. Cadavid L LF. 1980. El uso de rocas fosfóricas en el cultivo de la yuca
(Manihot esculenta Crantz). Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT): 38.
Cadavid L. 2002. Conservación de suelos dedicados al cultivo de la yuca. En: Cultivo de

la yuca en el tercer milenio. Sistemas modernos de producción, procesamiento,
utilización y comercialización: 87.
Cadavid L. 2011. Manual de la nutrición vegetal. Una visión general de los aspectos
nutricionales del cultivo de la yuca.
Camacho-Tamayo JH, Luengas-Gómez C, Leiva FR. 2010. Análisis multivariado de

propiedades químicas en Oxisoles con diferentes niveles de intervención agrícola. Acta
Agronómica 59: 273–284.
Camenzind T, Hempel S, Homeier J, Horn S, Velescu A, Wilcke W, Rillig MC. 2014.

Nitrogen and phosphorus additions impact arbuscular mycorrhizal abundance and
molecular diversity in a tropical montane forest. Global Change Biology 20: 3646–3659.
Carneiro M, Russ C, Ross M, Gabriel S, Nusbaum C, DePristo M. 2012. Pacific

biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data.
BMC Genomics 13.
Castillo CG, Borie F, Godoy R, Rubio R, Sieverding E. 2006. Diversity of mycorrhizal

plant species and arbuscular mycorrhizal fungi in evergreen forest, deciduous forest and
grassland ecosystems of Southern Chile. Journal of Applied Botany and Food Quality-
Angewandte Botanik 80: 40–47.
Ceballos H. 2002. La yuca en Colombia y el mundo: Nueva perspectiva para un cultivo

milenario. En: http://www.clayuca.org/contenido.htm: Consultado en Junio 2013.
Ceballos I. 2016. Efecto de las diferencias genéticas de Rhizophagus irregularis sobre el

crecimiento de plantas de yuca en campo. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de
Colombia.
Ceballos I, Ruiz M, Fernandez C, Peña R, Rodriguez A, Sanders IR. 2013. The In Vitro
mass-produced model mycorrhizal fungus, Rhizophagus irregularis, significantly
increases yields of the globally important food security crop cassava. PLoS ONE 8.
Chagnon PL, Bradley RL, Maherali H, Klironomos JN. 2013. A trait-based framework
to understand life history of mycorrhizal fungi. Trends in Plant Science 18: 484–491.
Chao A. 1984. Nonparametric estimation of the numbers of classes in a population.

Scandinavian Journal of Statistics 11: 265–270.
Chao L, Colwell K, Shen T, Chazdon A. 2005. A new statistical approach for assessing
similarity of species composition with incidence and abudance data. Ecology Letters 8:
231
148–159.
Clapp JP, Fitter AH, Young JPW. 1999. Ribosomal small subunit sequence variation
within spores of an arbuscular mycorrhizal fungus, Scutellospora sp. Molecular Ecology 8:
915–921.
Clapp JP, Rodriguez A, Dodd JC. 2001. Inter- and intra-isolate rRNA large subunit
variation in Glomus coronatum spores. New Phytologist 149: 539–554.
Clapp JP, Young JPW, Merryweather JW, Fitter AH. 1995. Diversity of fungal
symbionts in arbuscular mycorrhizas from a natural community. New Phytologist 130:
259–265.
Colombo RP, Fernández Bidondo L, Silvani VA, Carbonetto MB, Rascovan N,

Bompadre MJ, Pérgola M, Cuenca G, Godeas AM. 2014. Diversity of arbuscular
mycorrhizal fungi in soil from the Pampa Ondulada, Argentina, assessed by
pyrosequencing and morphological techniques. Canadian journal of microbiology 60:
819–27.
Colwell RK, Coddington J a. 1994. Estimating Terrestrial Biodiversity through

Extrapolation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B:
Biological Sciences 345: 101–118.
Connell JH. 1978. Diversity in Tropical Rain Forests and Coral Reefs. Science 199:
1302–1310.
Corradi N, Croll D, Colard A, Kuhn G, Ehinger M, Sanders IR. 2007. Gene copy
number polymorphisms in an arbuscular mycorrhizal fungal population. Applied and
Environmental Microbiology 73: 366–369.
Corradi N, Hijri M, Fumagalli L, Sanders IR. 2004a. Arbuscular mycorrhizal fungi

(Glomeromycota) harbour ancient fungal tubulin genes that resemble those of the chytrids
(Chytridiomycota). Fungal Genetics and Biology 41: 1037–1045.
Corradi N, Kuhn G, Sanders IR. 2004b. Monophyly of beta-tubulin and H+-ATPase

gene variants in Glomus intraradices: Consequences for molecular evolutionary studies of
AM fungal genes. Fungal Genetics and Biology 41: 262–273.
Croll D, Giovannetti M, Koch AM, Sbrana C, Ehinger M, Lammers PJ, Sanders IR.
2008a. Nonself vegetative fusion and genetic exchange in the arbuscular mycorrhizal
fungus Glomus intraradices. The New phytologist: 1–14.
Croll D, Giovannetti M, Koch AM, Sbrana C, Ehinger M, Lammers PJ, Sanders IR.
2009. Nonself vegetative fusion and genetic exchange in the arbuscular mycorrhizal
fungus Glomus intraradices. New Phytologist 181: 924–937.
Croll D, Sanders IR. 2009. Recombination in Glomus intraradices, a supposed ancient

asexual arbuscular mycorrhizal fungus. BMC Evolutionary Biology 15: 9–13.
Croll D, Wille L, Gamper H a, Mathimaran N, Lammers PJ, Corradi N, Sanders IR.

2008b. Genetic diversity and host plant preferences revealed by simple sequence repeat
and mitochondrial markers in a population of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus
intraradices. New Phytologist 178: 672–887.
Daniell TJ, Husband R, Fitter AH, Young JPW. 2001. Molecular diversity of arbuscular
mycorrhizal fungi colonising arable crops. FEMS Microbiology Ecology 36: 203–209.
Davison J, Moora M, Öpik M, Adholeya A, Ainsaar L, Bâ A, Burla S, Diedhiou a G,

Hiiesalu I, Jairus T, et al. 2015. Global assessment of arbuscular mycorrhizal fungus
diversity reveals very lowendemism. Science 127: 970–973.
Davison J, Opik M, Daniell TJ, Moora M, Zobel M. 2011. Arbuscular mycorrhizal fungal
communities in plant roots are not random assemblages. FEMS microbiology ecology 78:
103–115.
Declerck S, Strullu D, Fortin A. 2005. In vitro culture of mycorrhizas. Vasa: 388.
Dumbrell AJ, Ashton PD, Aziz N, Feng G, Nelson M, Dytham C, Fitter AH, Helgason
T. 2011. Distinct seasonal assemblages of arbuscular mycorrhizal fungi revealed by
massively parallel pyrosequencing. New Phytologist 190: 794–804.
Dumbrell A, Nelson M, Helgason T, Dytham C, Fitter A. 2010. Idiosyncrasy and

overdominance in the structure of natural communities of arbuscular mycorrhizal fungi: is
there a role for stochastic processes? Journal of Ecology 98: 419–428.
Ehinger M, Koch AM, Sanders IR. 2009. Changes in arbuscular mycorrhizal fungal
phenotypes and genotypes in response to plant species identity and phosphorus
concentration. The New phytologist 184: 412–423.
FAO. 2008. Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentación.

http://www.fao.org/newsroom/es/news/2008/1000899/index.html: Consultado en
Septiembre de 2012.
FAOSTAT. 2010. Food and agricultural commodities production.

http://www.faostat.fao.org: Consultado en Febrero 20 de 2007.
Faye A, Dalpé Y, Ndung’u-Magiroi K, Jefwa J, Ndoye I, Diouf M, Lesueur D. 2013.

Evaluation of commercial arbuscular mycorrhizal inoculants. Canadian Journal of Plant
Science 93: 1201–1208.
Fellbaum CR, Gachomo EW, Beesetty Y, Choudhari S, Strahan GD, Pfeffer PE. 2012.
Carbon availability triggers fungal nitrogen uptake and transport in arbuscular mycorrhizal
symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences 109: 1–5.
Fernandez C, Ceballos I, Rodriguez A, Sanders IR. 2016. Estudio fisiologico de las

etapas fenológicas del cultivo de yuca en la región de la orinoquía Colombiana. En
preparación.
Fitzsimons MS, Miller RM, Jastrow JD. 2008. Scale-dependent niche axes of
arbuscular mycorrhizal fungi. Oecologia 158: 117–127.
Formey D, Molès M, Haouy A, Savelli B, Bouchez O, Bëcard G, Roux C. 2012.

Comparative analysis of mitochondrial genomes of Rhizophagus irregularis - syn. Glomus
irregulare - reveals a polymorphism induced by variability generating elements. New
233
Gamper HA, Walker C, Schüßler A. 2009. Diversispora celata sp. nov: Molecular
ecology and phylotaxonomy of an inconspicuous arbuscular mycorrhizal fungus. New
Garrison E, Marth G. 2012. Haplotype-based variant detection from short-read

sequencing. arXiv:1207.3907: 1–9.
Gause F. 1935. The Struggle for Existence. The Yale journal of biology and medicine 7:
609.
Gavito ME, Pérez-Castillo D, González-Monterrubio CF, Vieyra-Hernández T,

Martínez-Trujillo M. 2008. High compatibility between arbuscular mycorrhizal fungal
communities and seedlings of different land use types in a tropical dry ecosystem.
Mycorrhiza 19: 47–60.
Gazey C, Abbott LK, Robson AD. 1993. VA mycorrhizal spores from three species of
Acaulospora : germination, longevity and hyphal growth. Mycological Research 97: 785–
790.
Gee J, Giller P. 1987. Organization of communities. Past and Present. Blackweel

Scientific Publications, Oxford.
Van Geel M, Busschaert P, Honnay O, Lievens B. 2014. Evaluation of six primer pairs
targeting the nuclear rRNA operon for characterization of arbuscular mycorrhizal fungal
(AMF) communities using 454 pyrosequencing. Journal of Microbiological Methods 106:
93–100.
Gerdemann JW, Nicolson TH. 1963. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted
from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society 46:
235–244.
Gollotte A, van Tuinen D, Atkinson D. 2004. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi

colonizing roots of the grass species Agrostis capillaris and Lolium perenne in a field
experiment. Mycorrhiza 14: 111–117.
González-Cortés JC, Vega-Fraga M, Varela-Fregoso L, Martínez-Trujillo M, Carreón-

Abud Y, Gavito ME. 2012. Arbuscular mycorrhizal fungal (AMF) communities and land
use change: The conversion of temperate forests to avocado plantations and maize fields
in central Mexico. Fungal Ecology 5: 16–23.
Gorzelak MA, Holland TC, Xing X, Hart MM. 2012. Molecular approaches for AM fungal
community ecology: A primer. Journal of Microbiological Methods 90: 108–114.
Gotelli NJ, Chao A. 2013. Measuring and estimating species richness, species diversity
and biotic similarity from sampling data. Encyclopedia of Biodiversity 5: 608–625.
Graham JH, Hodge NC, Morton JB. 1995. Fatty acid methyl ester profiles for
characterization of glomalean fungi and their endomycorrhizae. Applied and
Gross M. 2010. Fears over phosphorus supplies. Current Biology . 20: R386.
Guadarrama P, Castillo S, Ramos-Zapata JA, Hernández-Cuevas L V., Camargo-

Ricalde SL. 2014. Arbuscular mycorrhizal fungal communities in changing environments:
The effects of seasonality and anthropogenic disturbance in a seasonal dry forest.
Pedobiologia 57: 87–95.
Harrison MJ. 2005. Signaling in the Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis. Annual Review of
Microbiology 59: 19–42.
Hart MM, Reader RJ. 2002. Taxonomic basis for variation in the colonization strategy of
arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist 153: 335–344.
van der Heijden MGA, Martin FM, Selosse MA, Sanders IR. 2015. Mycorrhizal ecology
and evolution: The past, the present, and the future. New Phytologist 205: 1406–1423.
Van Der Heijden MGA, Streitwolf-Engel R, Riedl R, Siegrist S, Neudecker A,

Ineichen K, Boller T, Wiemken A, Sanders IR. 2006. The mycorrhizal contribution to
plant productivity, plant nutrition and soil structure in experimental grassland. New
Helgason T, Daniell TJ, Husband R, Fitter AH, Young JPW. 1998. Ploughing up the
wood-wide web? Nature 394: 431.
Helgason T, Fitter AH, Young JPW. 1999. Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal
fungi colonising Hyacinthoides non-scripta (bluebell) in a seminatural woodland.
Molecular Ecology 8: 659–666.
Helgason T, Merryweather JW, Denison J, Wilson P, Young JPW, Fitter AH. 2002.
Selectivity and functional diversity in arbuscular mycorrhizas of co-occurring fungi and
plants from a temperate deciduous woodland. Journal of Ecology 90: 371–384.
Helgason T, Merryweather JW, Young JPW, Fitter AH. 2007. Specificity and resilience
in the arbuscular mycorrhizal fungi of a natural woodland community. Journal of Ecology
95: 623–630.
Hempel S, Renker C, Buscot F. 2007. Differences in the species composition of

arbuscular mycorrhizal fungi in spore, root and soil communities in a grassland
ecosystem. Environmental Microbiology 9: 1930–1938.
Hepper CM, Azcon-Aguilar C, Rosendahl S, Sen R. 1988. Competition between three

species of Glomus used as spatially separated introduced and indigenous mycorrhizal
inocula for leek (Allium porrum L.). New Phytologist 110: 207–215.
Hershey C, Henry G, Best R, Iglesias C. 2004. Cassava in Latin America and the
Caribbean: resources for global development. A Review of Cassava in Latin America and
the Caribbean: Resources for global development.
Hijri M, Sanders I. 2005. Low gene copy number shows that arbuscular mycorrhizal fungi
inherit genetically different nuclei. Nature 433: 160–163.
Hijri I, Sýkorová Z, Oehl F, Ineichen K, Mäder P, Wiemken A, Redecker D. 2006.

235
Communities of arbuscular mycorrhizal fungi in arable soils are not necessarily low in
diversity. Molecular Ecology 15: 2277–2289.
Horn RA. 2009. Understanding the one way ANOVA. http://goo.gl/Fn4wWN: Consultado
el 01 Julio 2016.
Horn S, Caruso T, Verbruggen E, Rillig MC, Hempel S. 2014. Arbuscular mycorrhizal

fungal communities are phylogenetically clustered at small scales. The ISME Journal 8:
1–12.
Howeler R, Sieverding E. 1982. La importancia de las micorrizas en la absorción de

fósforo por la yuca. Suelos Ecuatoriales 12: 182–195.
Howeler R, Sieverding E, Saif S. 1987. Practical aspects of micorrhizal technology in

some tropical crops and pastures. Plant and Soil 100: 249–283.
Hubbell SP. 2005. Neutral theory in community ecology and the hypothesis of functional
equivalence. Functional Ecology 19: 166–172.
Husband R, Herre EA, Turner SL, Gallery R, Young JPW. 2002. Molecular diversity of
arbuscular mycorrhizal fungi and patterns of host association over time and space in a
tropical forest. Molecular Ecology 11: 2669–2678.
Ijdo M, Schtickzelle N, Cranenbrouck S, Declerck S. 2010. Do arbuscular mycorrhizal

fungi with contrasting life-history strategies differ in their responses to repeated
defoliation? FEMS Microbiology Ecology 72: 114–122.
Ipsilantis I, Samourelis C, Karpouzas DG. 2012. The impact of biological pesticides on

arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biology and Biochemistry 45: 147–155.
Janos D. 1987. VA mycorrhizas in humid tropical exosystems. Exophysiology of VA

Mycorrhizal Plants. GR Safir: 107–134.
Janoušková M, Krak K, Wagg C, Štorchová H, Caklová P, Vosátka M. 2013. Effects of

inoculum additions in the presence of a preestablished arbuscular mycorrhizal fungal
community. Applied and Environmental Microbiology 79: 6507–6515.
Jansa J, Mozafar A, Anken T, Ruh R, Sanders IR, Frossard E. 2002. Diversity and
structure of AMF communities as affected by tillage in a temperate soil. Mycorrhiza 12:
225–234.
Jansa J, Mozafar A, Kuhn G, Anken T, Ruh R, Sanders IR, Frossard E. 2003. Soil
tillage affects the community structure of mycorrhizal fungi in maize roots. Ecological
Applications 13: 1164–1176.
Jansa J, Smith FA, Smith SE. 2008. Are there benefits of simultaneous root colonization
by different arbuscular mycorrhizal fungi? New Phytologist 177: 779–789.
Javot H, Penmetsa RV, Terzaghi N, Cook DR, Harrison MJ. 2007. A Medicago
truncatula phosphate transporter indispensable for the arbuscular mycorrhizal symbiosis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104:
1720–1725.
Jin H, Germida JJ, Walley FL. 2013. Impact of arbuscular mycorrhizal fungal inoculants
on subsequent arbuscular mycorrhizal fungi colonization in pot-cultured field pea (Pisum
sativum L.). Mycorrhiza 23: 45–59.
Johnson NC. 1993. Can fertilization of soil select less mutualistic mycorrhizae?
Ecological Applications 3: 749–757.
Johnson NC. 2010. Resource stoichiometry elucidates the structure and function of
arbuscular mycorrhizas across scales. New Phytologist 185: 631–647.
Johnson D, Vandenkoornhuyse PJ, Leake JR, Gilbert L, Booth RE, Grime JP,
Young JPW, Read DJ. 2004. Plant communities affect arbuscular mycorrhizal fungal
diversity and community composition in grassland microcosms. New Phytologist 161:
503–515.
Jongman RHG, Braak CJF, Van Tongeren OFR. 1995. Data Analysis in Community
and Landscape Ecology. Cambrigede University Press: 212.
Karandashov V, Bucher M. 2005. Symbiotic phosphate transport in arbuscular

mycorrhizas. Trends in Plant Science 10: 22–29.
Katoh K, Standley DM. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7:
Improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution 30: 772–
780.
Kiers ET, Duhamel M, Beesetty Y, Mensah JA, Franken O, Verbruggen E, Fellbaum

CR, Kowalchuk GA, Hart MM, Bago A, et al. 2011. Reciprocal rewards stablize
cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science 333: 880–882.
Kjøller R, Rosendahl S. 2000. Detection of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomales) in

roots by nested PCR and SSCP (Single Stranded Conformation Polymorphism). Plant
and Soil 226: 189–196.
Kjøller R, Rosendahl S. 2001. Molecular diversity of glomalean (arbuscular mycorrhizal)

fungi determined as distinct Glomus specific DNA sequences from roots of field grown
peas fungi. Mycological Research 105: 1027–1032.
Koch AM. 2006. Linking the population ge netics and ecology of arbuscular mycorrhizal
fungi. PhD Thesis document.: https://doc.rero.ch/record/5795/files/These_KochA.
Koch AM, Croll D, Sanders IR. 2006. Genetic variability in a population of arbuscular
mycorrhizal fungi causes variation in plant growth. Ecology Letters 9: 103–110.
Koch AM, Kuhn G, Fontanillas P, Fumagalli L, Goudet J, Sanders IR. 2004. High
genetic variability and low local diversity in a population of arbuscular mycorrhizal fungi.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101:
2369–74.
Köhl L, Lukasiewicz, E. C, Heijden van der, van der Heijden MG. 2016. Establishment
and effectiveness of inoculated arbuscular mycorrhizal fungi in agricultural soils. Plant,
Cell and Environment 39: 136–146.
237
Koske RE, Tessier B. 1983. A convenient, permanent slide mounting medium.

Mycological Society of America Newsletter 34: 59.
Koyama H, Toda T, Yokota S, Dawair Z, Hara T. 1995. Effects of Aluminum and pH on

Root Growth and Cell Viability in Arabidopsis thaliana Strain Landsberg in Hydroponic
Culture. Plant and Cell Physiology 36: 201–205.
Krajinski F, Courty P-E, Sieh D, Franken P, Zhang H, Bucher M, Gerlach N,

Kryvoruchko I, Zoeller D, Udvardi M, et al. 2014. The H+-ATPase HA1 of Medicago
truncatula Is Essential for Phosphate Transport and Plant Growth during Arbuscular
Mycorrhizal Symbiosis. The Plant cell 26: 1808–1817.
Krajinski F, Frenzel A. 2007. Towards the elucidation of AM-specific transcription in

Medicago truncatula. Phytochemistry 68: 75–81.
Krüger M. 2011. Molecular phylogeny , taxonomy and evolution of arbuscular mycorrhizal

fungi. DNA-based characterization and identification of Glomeromycota. : 176.
Krüger M, Krüger C, Walker C, Stockinger H, Schussler A. 2012. Phylogenetic

reference data for systematics and phylotaxonomy of arbuscular mycorrhizal fungi from
phylum to species level. New Phytologist 193: 970–984.
Kuhn G, Hijri M, Sanders IR. 2001. Evidence for the evolution of multiple genomes in
arbuscular mycorrhizal fungi. Nature 414: 745–748.
Leal PL, Siqueira JO, Stürmer SL. 2013. Switch of tropical Amazon forest to pasture
affects taxonomic composition but not species abundance and diversity of arbuscular
mycorrhizal fungal community. Applied Soil Ecology 71: 72–80.
Lee J, Lee S, Young JPW. 2008. Improved PCR primers for the detection and
identification of arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Ecology 65: 339–349.
Leitner W, Turner WR. 2001. Measurement and Analysis of Biodiversity. Encyclopedia of

Biodiversity, Volume 4: 178–194.
Lekberg Y, Gibbons SM, Rosendahl S, Ramsey PW. 2013. Severe plant invasions can
increase mycorrhizal fungal abundance and diversity. The ISME Journal 7: 1424–1433.
Lekberg Y, Koide RT, Rohr JR, Aldrich-Wolfe L, Morton JB. 2007. Role of niche
restrictions and dispersal in the composition of arbuscular mycorrhizal fungal
communities. Journal of Ecology 95: 95–105.
Lekberg Y, Schnoor T, Kjøller R, Gibbons SM, Hansen LH, Al-Soud W, Sørensen SJ,
Rosendahl S. 2012. 454-Sequencing Reveals Stochastic Local Reassembly and High
Disturbance Tolerance Within Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities. Journal of
Ecology 100: 151–160.
Leon D. 2015. Comunidades nativas de Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares

asociadas a yuca silvestre en la amazonía Colombiana, en época seca y lluviosa, bajo
dos tipos de paisaje (denudación y llanura aluvial). Tesis de maestría. Pontificia
Universidad Javeriana.
Lin X, Feng Y, Zhang H, Chen R, Wang J, Zhang J, Chu H. 2012. Long-term balanced
fertilization decreases arbuscular mycorrhizal fungal diversity in an arable soil in North
China revealed by 454 pyrosequencing. Environmental science & technology 46: 5764–
71.
Lin K, Limpens E, Zhang Z, Ivanov S, Saunders DGO, Mu D, Pang E, Cao H, Cha H,

Lin T, et al. 2014. Single Nucleus Genome Sequencing Reveals High Similarity among
Nuclei of an Endomycorrhizal Fungus. PLoS Genetics 10.
Lindahl BD, Nilsson RH, Tedersoo L, Abarenkov K, Carlsen T, Kjøller R, Kõljalg U,

Pennanen T, Rosendahl S, Stenlid J, et al. 2013. Fungal community analysis by high-
throughput sequencing of amplified markers--a user’s guide. The New phytologist 199:
288–99.
Lovelock CE, Andersen K, Morton JB. 2003. Arbuscular mycorrhizal communities in

tropical forests are affected by host tree species and environment. Oecologia 135: 268–
279.
Lumini E, Orgiazzi A, Borriello R, Bonfante P, Bianciotto V. 2010. Disclosing

arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a
pyrosequencing approach. Environmental Microbiology 12: 2165–2179.
Maherali H, Klironomos JN. 2007. Influence of Phylogeny on Fungal. Science: 1746–

1748.
Margalef R. 1960. Temporal succession and spatial heterogeneity in phytoplankton. In:

BUZZATI-TRAVERSO, ed. Perspectives in Marine Biology. Univeristy of California Press,
.
Marleau J, Dalpé Y, St-Arnaud M, Hijri M. 2011. Spore development and nuclear

inheritance in arbuscular mycorrhizal fungi. BMC Evol Biol: 11–51.
Mathimaran N, Ruh R, Vullioud P, Frossard E, Jansa J. 2005. Glomus intraradices

dominates arbuscular mycorrhizal communities in a heavy textured agricultural soil.
Menge J. 1983. Utilization of vesicular–arbuscular mycorrhizal fungi in agriculture.

Canadian Journal of Botany 61: 1015–1024.
Miller TE. 1982. Community Diversity and Interactions Between the Size and Frequency
of Disturbance. The American Naturalist 120: 533–536.
Molina D, Amézquita E, Hoyos P. 2003. Construcción de capas arables en suelos

oxisoles de la Altillanura colombiana. Evaluación de parámetros y procesos hidrológicos
en el suelo. VII Escuela Latinoamericana de Física de Suelos. La Serena: 113–117.
Molino JF, Sabatier D. 2001. Tree diversity in tropical rain forests: a validation of the
intermediate disturbance hypothesis. Science (New York, N.Y.) 294: 1702–1704.
Morton J, Benny G. 1990. Revised classification of arbuscular mycorrhizal fungi

(Zygomycetes) - A new order, Glomales, 2 new suborders, Glomineae and
Gigasporineae, and 2 new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an
239
emendation of Glomaceae. Mycotaxon 37:471- 491 37: 471–491.
Morton JB, Bentivenga SP, Wheeler WW. 1993. Germ Plasm in the International
Collection of Arbuscular and Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal Fungi (Invam) and
Procedures for Culture Development, Documentation and Storage. Mycotaxon 48: 491–
528.
Morton JB, Redecker D. 2001. Two new families of Glomales, Archaeosporaceae and
Paraglomaceae, with two new genera Archaeospora and Paraglomus, based on
concordant molecular and morphological characters. Mycologia 93: 181–195.
Mummey DL, Rillig MC. 2006. The invasive plant species Centaurea maculosa alters
arbuscular mycorrhizal fungal communities in the field. Plant and Soil 288: 81–90.
Munkvold L, Kjøller R, Vestberg M, Rosendahl S, Jakobsen I. 2004. High functional

diversity within species of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist 164: 357–364.
Nilsson RH, Kristiansson E, Ryberg M, Hallenberg N, Larsson KH. 2008. Intraspecific

ITS variability in the Kingdom Fungi as expressed in the international sequence
databases and its implications for molecular species identification. Evolutionary
Bioinformatics 2008: 193–201.
Oehl F, Alves a Silva G, Goto BT, Costa Maia L, Sieverding E. 2011a.

Glomeromycota: two new classes and a new order. Mycotaxon 116: 365–379.
Oehl F, Alves a Silva G, Goto BT, Costa Maia L, Sieverding E. 2011b.

Glomeromycota: two new classes and a new order. Mycotaxon 116: 365–379.
Oehl F, Laczko E, Bogenrieder A, Stahr K, Bösch R, van der Heijden M, Sieverding

E. 2010. Soil type and land use intensity determine the composition of arbuscular
mycorrhizal fungal communities. Soil Biology and Biochemistry 42: 724–738.
Oehl F, Sieverding E. 2004. Pacispora, a new vesicular arbuscular mycorrhizal fungal

genus in the glomeromycetes. Journal of Applied Botany and Food Quality-Angewandte
Botanik 78: 72–82.
Oehl F, da Silva GA, Goto BT, Sieverding E. 2011c. New recombinations in

Glomeromycota. Mycotaxon 117: 429–434.
Oehl F, Silva GA Da, Goto BT, Sieverding E. 2011d. Glomeromycota: three new genera
and glomoid species reorganized. Mycotaxon 116: 75–120.
Oehl F, Silva DKA da, Maia LC, Sousa N, lia Mirelly Ferreira de, Vieira H El, sio E,
Silva GA da. 2011e. Orbispora gen. nov., ancestral in the Scutellosporaceae
(Glomeromycetes). Mycotaxon 116: 161–169.
Oehl F, de Souza FA, Sieverding E. 2008. Revision of Scutellospora and description of

five new genera and three new families in the arbuscular mycorrhiza-forming
Glomeromycetes. Mycotaxon 106: 311–360.
Oksanen J, Blanchet FG, Kindt R, Legendre P, Minchin PR, O’Hara RB, Simpson
GL, Solymos P, Stevens MHH, Wagner H. 2015. vegan: Community Ecology Package.
R package version 2.3-1.
Olsson PA. 1999. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution
and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiology Ecology 29: 303–310.
Olsson PA, Rahm J, Aliasgharzad N. 2010. Carbon dynamics in mycorrhizal symbioses

is linked to carbon costs and phosphorus benefits. FEMS Microbiology Ecology 72: 125–
131.
Öpik Maarja M, Moora M. 2012. Missing nodes and links in mycorrhizal networks. New
Öpik M, Metsis M, Daniell TJ, Zobel M, Moora M. 2009. Large-scale parallel 454
sequencing reveals host ecological group specificity of arbuscular mycorrhizal fungi in a
boreonemoral forest. New Phytologist 184: 424–437.
Öpik M, Moora M, Liira J, Kõljalg U, Zobel M, Sen R. 2003. Divergent arbuscular

mycorrhizal fungal communities colonize roots of Pulsatilla spp. in boreal Scots pine
forest and grassland soils. New Phytologist 160: 581–593.
Öpik M, Moora M, Liira J, Zobel M. 2006. Composition of root-colonizing arbuscular

mycorrhizal fungal communities in different ecosystems around the globe. Journal of
Ecology 94: 778–790.
Öpik M, Moora M, Zobel M, Saks Ü, Wheatley R, Wright F, Daniell T. 2008. High

diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in a boreal herb‐rich coniferous forest. New
Öpik M, Vanatoa A, Vanatoa E, Moora M, Davison J, Kalwij JM, Reier A, Zobel M.

2010. The online database MaarjAM reveals global and ecosystemic distribution patterns
in arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota). New Phytologist 188: 223–241.
Öpik M, Zobel M, Cantero JJ, Davison J, Facelli JM, Hiiesalu I, Jairus T, Kalwij JM,
Koorem K, Leal ME, et al. 2013. Global sampling of plant roots expands the described
molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza 23: 411–430.
Ortas I, Sari N, Akpinar C, Yetisir H. 2011. Screening Mycorrhizae species for increased
growth and P and Zn uptake in eggplant (Solanum melongena L.) grown under
greenhouse conditions. European Journal of Horticultural Science 76: 116–123.
Pagni M, Niculita-Hirzel H, Pellissier L, Dubuis A, Xenarios I, Guisan A, Sanders IR,

Goudet J, Guex N. 2013. Density-based hierarchical clustering of pyro-sequences on a
large scale - The case of fungal ITS1. Bioinformatics 29: 1268–1274.
Palmer M. 1990. The estimation of species richness by extrapolation. Ecology 71: 1195–
1198.
Pattinson GS, Warton DI, Misman R, McGee PA. 1997. The fungicides terrazole and
terraclor and the nematicide fenamiphos have little effect on root colonisation by Glomus
mosseae and growth of cotton seedlings. Mycorrhiza 7: 155–159.
Pawlowska T, Taylor J. 2004. Organization of genetic variation in individuals of

241
arbuscular mycorrhizal fungi. Nature 427: 733–737. Nature 427: 733–737.
Pellegrino E, Bedini S, Avio L, Bonari E, Giovannetti M. 2011. Field inoculation

effectiveness of native and exotic arbuscular mycorrhizal fungi in a Mediterranean
agricultural soil. Soil Biology and Biochemistry 43: 367–376.
Pellegrino E, Turrini A, Gamper HA, Cafa G, Bonari E, Young JPW, Giovannetti M.

2012. Establishment, persistence and effectiveness of arbuscular mycorrhizal fungal
inoculants in the field revealed using molecular genetic tracing and measurement of yield
components. New Phytologist 194: 810–822.
Pellissier L, Pinto-Figueroa E, Niculita-Hirzel H, Moora M, Villard L, Goudet J, Guex

N, Pagni M, Xenarios I, Sanders I, et al. 2013. Plant species distributions along
environmental gradients: do belowground interactions with fungi matter? Frontiers in plant
science 4: 500.
Peña-Venegas CP, Cardona GI, Arguelles JH, Arcos AL. 2007. Micorrizas
Arbusculares del Sur de la Amazonia Colombiana y su Relación con Algunos Factores
Fisicoquímicos y Biológicos del Suelo. Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas
Sinchi 37 (3): 327–326.
Pielou E. 1977. Mathematical ecology. Wiley: 385.
Porras-Alfaro A, Herrera J, Natvig D, Sinsabaugh R. 2007. Effect of a long-term

nitrogen fertilisation on mycorrhizal fungi associated with a dominant grass in a semiarid
grassland. Plant and Soil 296: 65–75.
Powell J, Parrent J, Hart M, Klironomos J, Rillig M, Maherali H. 2009. Phylogenetic

trait conservatism and the evolution of functional trade-offs in arbuscular mycorrhizal
fungi. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences 276:
4237–4245.
Rabelo Pereira CM, Alves da Silva DK, Almeida Ferreira AC, Goto BT, Costa Maia L.
2014. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in Atlantic forest areas under different land
uses. Agriculture, Ecosystems & Environment 185: 245–252.
R Core Team. 2013. R Core Team. R: A language and environment for statistical
computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.: ISBN 3-900051-07-
0, URL http://www.R-project.org/.
Ramirez MM. 2014. Evaluación de la diversidad de Hongos Formadores de Micorrizas

Arbusculares (HFMA) y su relación con el establecimiento de simbiosis con Physalis
peruviana L. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de Colombia. Instituto.
Read DJ, Wright DP, Scholes JD. 1998. Effects of VA mycorrhizal colonization on
photosynthesis and biomass production of Trifolium repens L. Plant, Cell & Environment
21: 209–216.
Redecker D, Kodner R, Graham LE. 2000. Glomalean fungi from the Ordovician.
Science (New York, N.Y.) 289: 1920–1921.
Redecker D, Raab P, Oehl F, Camacho FJ, Courtecuisse R. 2007. A novel clade of

sporocarp-forming species of glomeromycotan fungi in the Diversisporales lineage.

Mycological Progress 6 1: 35–44.
Renker C, Blanke V, Buscot F. 2005. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in

grassland spontaneously developed on area polluted by a fertilizer plant. Environmental
Pollution 135: 255–266.
Robinson-Boyer L, Grzyb I, Jeffries P. 2009. Shifting the balance from qualitative to

quantitative analysis of arbuscular mycorrhizal communities in field soils. Fungal Ecology
2: 1–9.
Rodriguez A, Clapp JP, Dodd JC. 2004. Ribosomal RNA gene sequence diversity in
arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota). J Ecology: 986–989.
Rodriguez A, Clapp JP, Robinson L, Dodd JC. 2005. Studies on the diversity of the
distinct phylogenetic lineage encompassing Glomus claroideum and Glomus etunicatum.
Rodriguez A, Sanders IR. 2014. The role of community and population ecology in
applying mycorrhizal fungi for improved food security. The ISME journal 9: 1053–1061.
Rodriguez A, Sanders I. 2015. The role of community and population ecology in applying
mycorrhizal fungi for improved food security. ISME Journal 9: 1053–1061.
Rosendahl S, Matzen HB. 2008. Genetic structure of arbuscular mycorrhizal populations

in fallow and cultivated soils. New Phytologist 179: 1154–1161.
Ryberg M, Nilsson RH, Kristiansson E, Töpel M, Jacobsson S, Larsson E. 2008.

Mining metadata from unidentified ITS sequences in GenBank: a case study in Inocybe
(Basidiomycota). BMC evolutionary biology 8: 50.
Saks Ü, Davison J, Öpik M, Vasar M, Moora M, Zobel M. 2014. Root-colonizing and

soil-borne communities of arbuscular mycorrhizal fungi in a temperate forest understorey
1. NRC Research Press 285: 277–285.
Sánchez-Castro I, Ferrol N, Cornejo P, Barea JM. 2012. Temporal dynamics of

arbuscular mycorrhizal fungi colonizing roots of representative shrub species in a semi-
arid Mediterranean ecosystem. Mycorrhiza 22: 449–460.
Sanders IR. 2010. Designer mycorrhizas: Using natural genetic variation in AM fungi to
increase plant growth. ISME J 4: 1081–1083.
Sanders IR, Alt M, Groppe K, Boller T, Wiemken A. 1995a. Identification of ribosomal

DNA polymorphisms among and within spores of the Glomales: applcation to studies on
the genetic diversity of arbuscular mycorrhizal fungal communities. The New Phytologist
130: 419–427.
Sanders IR, Alt M, Groppe K, Boller T, Wiemken A. 1995b. Identification of Ribosomal

DNA Polymorphisms among and within Spores of the Glomales - Application to Studies
on the Genetic Diversity of Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities. New Phytologist
130: 419–427.
243
Sanders IR, Croll D. 2010. Arbuscular mycorrhiza: the challenge to understand the
genetics of the fungal partner. Annual review of genetics 44: 271–292.
Sanders IR, Rodriguez A. 2016. Aligning molecular studies of mycorrhizal fungal

diversity with ecologically important levels of diversity in ecosystems. The ISME journal:
1–7.
Schemck NC, Perez Y. 1990. Isolation and culture of VA mycorrhizal fungi. Isolation of
biotechnological organisms from nature: 237–258.
Scheublin TR, Ridgway KP, Young JPW, Van Der Heijden MGA. 2004. Nonlegumes,
legumes, and root nodules harbor different arbuscular mycorrhizal fungal communities.
Applied and Environmental Microbiology 70: 6240–6246.
Schlaeppi K, Bender SF, Mascher F, Russo G, Patrignani A, Camenzind T, Hempel

S, Rillig MC, van der Heijden MGA. 2016. High-resolution community profiling of
arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist: 1–12.
Schnoor TK, Lekberg Y, Rosendahl S, Olsson PA. 2011. Mechanical soil disturbance
as a determinant of arbuscular mycorrhizal fungal communities in semi-natural grassland.
Schüβler A, Schwarzott D, Walker C. 2001. A new fungal phylum, the Glomeromycota:

phylogeny and evolution. Mycological Research 105: 1413–1421.
Schwarzott D, Walker C, Schussler A. 2001. Glomus, the largest genus of the

arbuscular mycorrhizal fungi (Glomales), is nonmonophyletic. Molecular Phylogenetics
and Evolution 21: 190–197.
Senés-Guerrero C, Torres-Cortés G, Pfeiffer S, Rojas M, Schüßler A. 2014. Potato-

associated arbuscular mycorrhizal fungal communities in the Peruvian Andes. Mycorrhiza
24: 405–417.
Senés-Guerrero C, Torres-Cortés G, Pfeiffer S, Rojas M, Schüßler A. 2015. Potato-

associated arbuscular mycorrhizal fungal communities in the Peruvian Andes. Mycorrhiza
24: 405–417.
Serralde A, Ramirez M. 2004. Análisis de poblaciones de micorrizas en maíz (Zea mayz)

cultivado en suelos ácidos bajo diferentes tratamientos agronómicos. Revista Corpoica
5(1): 31-4.
Shannon CE, Weaver W. 1949. Recent Contributions to the mathematical theory of

communication. University of Illinois Press 19: 1–12.
Shokralla S, Spall JL, Gibson JF, Hajibabaei M. 2012. Next-generation sequencing

technologies for environmental DNA research. Molecular Ecology 21: 1794–1805.
Sieverding E. 1989. Ecology of VAM fungi in tropical ecosystems. Agriculture,

Ecosystems and Environment 29: 369–390.
Sieverding E. 1991. Vesicular Arbuscular Mycorrhizae Management in Tropical

Agroecosystems. Eschborn.
Sieverding E, Alves G, Silva D, Berndt R, Oehl F. 2014. Rhizoglomus, a new genus of

the Glomeraceae. Mycotaxon 129: 373–386.
Sieverding E, Howeler RH. 1985. Influence of species of VA mycorrhizal fungi on

cassava yield response to phosphorus fertilization. Plant and Soil 88: 213–221.
Sieverding E, Oehl F. 2006. Revision of Entrophospora and description of Kuklospora

and Intraspora, two new genera in the arbuscular mycorrhizal Glomeromycetes. Journal
of Applied Botany and Food Quality 80: 69–81.
Simon L, Lalonde M, Bruns TD. 1992. Specific amplification of 18S fungal ribosomal
genes from vesicular-arbuscular endomycorrhizal fungi colonizing roots. Applied and
environmental microbiology. 58: 291–295.
Simpson E. 1949. Measurement of diversity. Nature 163: 688.
Smith S, Read D. 2008. The Mycorrhizal Symbiosis. San Diego: Academic Press
Elseiver e: 10–90.
Sousa WP. 1984. The Role of Disturbance in Natural Communities. Annual Review of
Ecology and Systematics 15: 353–391.
de Souza FA, Kowalchuk GA, Leeflang P, van Veen JA, Smit E. 2004. PCR-
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Profiling of Inter- and Intraspecies 18S rRNA
Gene Sequence Heterogeneity Is an Accurate and Sensitive Method To Assess Species
Diversity of Arbuscular Mycorrhizal Fungi of the Genus Gigaspora. Applied and
Spain J, Sieverding E, Oehl F. 2006. Appendicispora: a new genus in the arbuscular

mycorrhiza forming Glomeromycetes, with a discussion of the genus Archaeospora.
Mycotaxon 97: 163–182.
St-Arnaud M, Hamel C, Vimard B, Caron M, Fortin JA. 1996. Enhanced hyphal growth
and spore production of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices in an in
vitro system in the absence of host roots. Mycological Research 100: 328–332.
Stamatakis A. 2014. RAxML version 8: A tool for phylogenetic analysis and post-analysis
of large phylogenies. Bioinformatics 30: 1312–1313.
Stevens G. 1989. The latitudinal gradient in geographical range: How many species
coexist in the tropics. American Naturalist 133: 240–56.
Stockinger H, Kruger M, Schussler A. 2010. DNA barcoding of arbuscular mycorrhizal

fungi. New Phytologist 187: 461–474.
Stockinger H, Walker C, Schüßler A. 2009. ‘Glomus intraradices DAOM197198’, a

model fungus in arbuscular mycorrhiza research, is not Glomus intraradices. New
Stürmer SL, Klauberg Filho O, Queiroz MH De, Mendonça MM De. 2006. Occurrence
of arbuscular mycorrhizal fungi in soils of early stages of a secondary succession of
Atlantic Forest in South Brazil. Acta Botanica Brasilica 20: 513–521.
245
Stürmer SL, Siqueira JO. 2011. Species richness and spore abundance of arbuscular
mycorrhizal fungi across distinct land uses in Western Brazilian Amazon. Mycorrhiza 21:
255–267.
Sýkorová Z, Börstler B, Zvolenská S, Fehrer J, Gryndler M, Vosátka M, Redecker D.

2012. Long-term tracing of Rhizophagus irregularis isolate BEG140 inoculated on
Phalaris arundinacea in a coal mine spoil bank, using mitochondrial large subunit rDNA
markers. Mycorrhiza 22: 69–80.
Sýkorová Z, Ineichen K, Wiemken A, Redecker D. 2007. The cultivation bias: Different

communities of arbuscular mycorrhizal fungi detected in roots from the field, from bait
plants transplanted to the field, and from a greenhouse trap experiment. Mycorrhiza 18:
1–14.
Symanczik S, Courty PE, Boller T, Wiemken A, Al-Yahya’ei MN. 2015. Impact of water
regimes on an experimental community of four desert arbuscular mycorrhizal fungal
(AMF) species, as affected by the introduction of a non-native AMF species. Mycorrhiza
25: 639–647.
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. 2013. MEGA6: Molecular

evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725–
2729.
Tisserant E, Malbreil M, Kuo A, Kohler A, Symeonidi A, Balestrini R, Charron P,

Duensing N, Frei dit Frey N, Gianinazzi-Pearson V, et al. 2013. Genome of an
arbuscular mycorrhizal fungus provides insight into the oldest plant symbiosis.
Proceedings of the National Academy of Sciences 110: 20117–20122.
UNEP. 1992. United Nations Environment Programme. Convention on Biological

Diversity. http://www.cbd.int/doc/legal/cbd-en.pdf.
Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG.

2012. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40: e115–e115.
Vandenkoornhuyse P, Husband R, Daniell TJ, Watson IJ, Duck JM, Fitter AH, Young
JPW. 2002. Arbuscular mycorrhizal community composition associated with two plant
species in a grassland ecosystem. Molecular Ecology 11: 1555–1564.
Vandenkoornhuyse P, Ridgway KP, Watson IJ, Fitter AH, Young JPW. 2003. Co-
existing grass species have distinctive arbuscular mycorrhizal communities. Molecular
Ecology 12: 3085–3095.
Verbruggen E, van der Heijden MGA, Rillig MC, Kiers ET. 2013. Mycorrhizal fungal
establishment in agricultural soils: Factors determining inoculation success. New
Veresoglou SD, Rillig MC. 2014. Do closely related plants host similar arbuscular
mycorrhizal fungal communities? A meta-analysis. Plant and Soil 377: 395–406.
Vierheilig H, Piché Y. 1998. A modified procedure for staining arbuscular mycorrhizal

fungi in roots. Zeitschrift für Pflanzenernährung und Bodenkunde 161: 601–602.
Violi HA, Barrientos-Priego AF, Wright SF, Escamilla-Prado E, Morton JB, Menge
JA, Lovatt CJ. 2008. Disturbance changes arbuscular mycorrhizal fungal phenology and
soil glomalin concentrations but not fungal spore composition in montane rainforests in
Veracruz and Chiapas, Mexico. Forest Ecology and Management 254: 276–290.
Voets L, De La Providencia IE, Fernandez K, Ijdo M, Cranenbrouck S, Declerck S.

2009. Extraradical mycelium network of arbuscular mycorrhizal fungi allows fast
colonization of seedlings under in vitro conditions. Mycorrhiza 19: 347–356.
Wagg C, Jansa J, Stadler M, Schmid B, Van Der Heijden MGA. 2011. Mycorrhizal
fungal identity and diversity relaxes plant-plant competition. Ecology 92: 1303–1313.
Wakelin S, Mander C, Gerard E, Jansa J, Erb A, Young S, Condron L, O’Callaghan

M. 2012. Response of soil microbial communities to contrasted histories of phosphorus
fertilisation in pastures. Applied Soil Ecology 61: 40–48.
Walker C, Sanders FE. 1986. Taxonomic concepts in the Endogonaceae. III. The
separation of Scutellospora gen. nov. from Gigaspora Gerd. and Trappe. Mycotaxon 27:
169–182.
Webb CO. 2000. Exploring the phylogenetic structure of ecological communities: an

example of rain forest trees. The American Naturalist 156: 145–155.
Webb C, Ackerly D, SW K. 2008. Phylocom: software for the analysis of phylogenetic

community structure and character evolution. Bioinformatics (Oxford, England) 24: 2098–
2100.
Wyss T, Masclaux FG, Rosikiewicz P, Pagni M, Sanders IR. 2016. Population

genomics reveals that within-fungus polymorphism is common and maintained in
populations of the mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis. The ISME journal: 1–13.
Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S, Madden TL. 2012. Primer-

BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC
Bioinformatics 13: 134.
Young P. 2012. A molecular guide to the taxonomy of arbuscular mycorrhizal fungi. New
Zhang B, He H, Ding X, Zhang X, Zhang X, Yang X, Filley TR. 2012. Soil microbial
community dynamics over a maize (Zea mays L.) growing season under conventional-
and no-tillage practices in a rainfed agroecosystem. Soil and Tillage Research 124: 153–
160.

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“Dinámica de la comunidad de Hongos

Formadores de Micorrizas Arbusculares

Yuli Marcela Ordoñez Castañeda

Universidad Nacional de Colombia

Yuli Marcela Ordoñez Castañeda

Universidad Nacional de Colombia

A Colciencias, a la Universidad Nacional de Colombia y a la fundación Suiza para la

Al grupo de Ecología y Evolución de Organismos Simbiontes de la Universidad de

A Frederic Masclaux, Lucas Villard del Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y la

A Tania Wyss y Frederic Masclaux por su apoyo en el diseño de marcadores moleculares

Al grupo de Biotecnología de Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares, de la

A mi familia, por su apoyo incondicional y permanente.

La inoculación con Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA) en sistemas

Keywords: Arbuscular Mycorrhiza Fungi, AMF communities, Rhizophagus irregularis

2. Describir la estructura de la comunidad de HFMA asociada a plantas de

3. Diseñar una estrategia metodológica para evaluar la diversidad

4. Evaluar el efecto de diferentes líneas de Rhizophagus irregularis

5. Discusión general 125

6. Conclusiones y recomendaciones 127

Figura 1. Ruta de trabajo en el análisis bioinformático para el análisis de las librerías

comunidades de HFMA inoculadas (AMF+) y no inoculadas (AMF-) con una línea

aislados de R. irregularis. Evaluadas a los 12 meses después de la inoculación, para la

En Colombia, la región denominada Llanos Orientales (26 millones de Ha) presenta

En la región de los Llanos Orientales, la yuca (Manihot esculenta Crantz). se ha escogido

Se ha observado el efecto positivo de la inoculación con HFMA sobre la productividad del

En el estudio de las comunidades de HFMA, se ha descrito su diversidad en diferentes

Consecuentemente, se han evaluado diferentes teorías ecológicas que intentan explicar

Además, se ha planteado que la distribución de las especies de HFMA está influenciada

En comunidades de HFMA, algunos estudios han evaluado el efecto del disturbio en

Respecto al disturbio biológico, la inoculación con HFMA podría incrementar la

Se ha planteado la posibilidad, de que el hongo inoculado no tenga la capacidad de

recientemente se observó la persistencia de dos cepas de Funneliformis mosseae

Se ha propuesto que la capacidad de adaptación y competencia de los HFMA puede

El hongo modelo Rhizophagus irregularis, pertenece a la familia Glomeraceae y ha sido

Diferentes estudios realizados sobre líneas de R. irregularis aisladas de suelos de

hongo esta relacionada con cambios en la comunidad local de HFMA después de la

• Hipótesis nula: La inoculación de una línea alóctona de Hongos Formadores de

• Hipótesis alterna: La inoculación de una línea alóctona de Hongos Formadores de

En este estudio se utilizaron líneas genéticamente diferentes de Rhizophagus irregularis

1.1 Biología y genética de los HFMA

Los Hongos Formadores de Micorrizas Arbusculares (HFMA), son biótrofos obligados,

Durante el establecimiento de la simbiosis micorrícica, el hongo coloniza la corteza de la

En la raíz, el hongo desarrolla un micelio conformado por arbúsculos, hifas y vesículas de

Respecto a la variabilidad genética, algunos estudios han analizado los genes

En diferentes líneas de Rhizophagus irregularis aisladas de suelos de Tanikon, Suiza, se

La variabilidad genética en el hongo modelo R. irregularis se ha explicado básicamente

Diferentes líneas de Rhizophagus irregularis se han producido in vitro, como resultado de

Las diferencias genotípicas y fenotípicas intra-específicas demostradas en las líneas de

1.2 Taxonomía de los HFMA

Inicialmente, la identificación de los HFMA estuvo basada en la morfología, el proceso de

A la fecha se aceptan tres clases (Archaeosporomycetes, Glomeromycetes y

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