PARASITOS:

Recolección. Es común que la obtención de parásitos sobre todo de

helmintos, los haga el paciente. Casi siempre llegan con el médico con un
frasco con agua o alcohol con el parásito. También se pueden recolectar
parásitos de los tamizados.

Manejo. Los parásitos se colocan en frascos con cierre hermético, se

etiqueta con los datos del paciente.

Conservación. Las soluciones preservadoras más usadas son las de

formol al 10% y la de alcohol al 70%; la que se prefiere es la última ya
que cuando se trata de proglótides de Taenia se puede proceder, aún con
el alcohol a utilizar un fijador para su posterior tinción, pues los parásitos
conservan su suavidad, mientras que con el formol se endurecen
demasiado. Existe un fijador a base de alcohol, formaldehido y ácido
acético en agua, que se puede utilizar como un excelente conservador, de
hecho, después de hacer la fijación, los especímenes se guardan en esta
solución que se conoce como AFA.
 PARASITOLOGIA
TEMA 16: TECNICAS DE LABORATORIO. Procedimientos para investigaciones
sobre el cadáver. Fijación y conservación de parásitos. Detección y diagnóstico.
Estudios coprológicos. Técnicas especiales dirigidas. Preparación y montaje.
Introducción:
El objetivo de este tema es el de facilitar las técnicas seguidas en un laboratorio de
parasitología, encaminadas a la determinación y conservación y diagnóstico de animales
parásitos. Se indican las composiciones de los diferentes líquidos conservadores, así
como métodos de preparación y utilización habitualmente seguidos. También se
exponen técnicas de examen diagnóstico para determinación de especímenes. Se
deberán emplear, individualmente, todos o alguno de estos métodos para la
preparación y determinación de sus propios ejemplares. También se enumeran algunos
"Manuales de técnicas Parasitológicas" a los que se recomienda acudir para casos
concretos.
Al cabo del presente curso, y con la suficiente experiencia en el laboratorio, el biólogo
podrá:
1.- Realizar análisis rutinarios de muestras clínicas, reconociendo las características
importantes de los parásitos presente.
2.- Calibrar y utilizar el micrómetro ocular para la medición de parásitos y sus huevos.
3.- Realizar análisis coprológicos para diagnóstico de determinadas parasitosis.
4.- Montar preparaciones frescas y permanentes de diferentes grupos de parásitos.
5.- Ejecutar técnicas de concentración de parásitos o huevos.
6.- Preparar frotis sanguíneos, de heces, delgados y gruesos.
7.- Realizar tinciones de preparaciones microscópicas.
8.- Realizar técnicas dirigidas a detecciones específicas de parásitos.
9.- Realizar recuentos de huevos en heces.
10.- Preparar diferentes los diferentes líquidos fijadores y colorantes, utilizados en
parasitología.

Bibliografía:
1. Ash, L. R. & Orihel, Th.C.1987.- Parasites: A Guide to Laboratory Procedures
and Identification. ASCP Press. American Society og Clinical Pathologists,
Chicago.
2. Blanco Torren y J. Galiano. 1989.- Atlas de Coprología, Digestión y Parásitos.
Asoc. Española de Farmacéuticos Analistas.
3. Hendrix, Ch.M. 1999.- Diagnóstico Parasitológico Veterinario. Harcourt. Brace.
Madrid.
4. Lamy L.H. Techniques de Base, Protozoaires, et helmintes parasites, recherche
et identification au laboratoire. Maloine S.A. Edit.
5. Leventhal R. y R.F. Cheadle.1992.- Parasitología Médica. Interamericana
MacGraw-Hill.
 6. Markell, E. K. , Voge, M. Y John, D. 1990.- Parasitología Médica.Interamericana
.McGraww Hill.
7. Owen D.G. 1992.- Parasites of Laboratory Animals. Laboratory Animals Hand
Books Nº 12. Laboratory nimals Ltd. by Royal Society of Medicine
ServicesLimited.
8. Schell, S.C. 1969.- Manual de Laboratorio en Parasitología. Edit. Academia
León.
9. Shore García L. y Ash L.R. Diagnóstico parasitológico , manual de laboratorio
clínico. Edit.
10. Vasallo Matilla, F. Reflexiones ante la elección de una técnica
copropararasitológica . Boletín. Contr. Cal. Vol 4 (2) Pp. 46-50. Med.
Panamericana.
11. Zaman, V. Atlas de Parasitología Clínica. Panamericana Editorial.
A. - PROCEDIMIENTOS PARA INVESTIGACIONES SOBRE EL CADÁVER.
Con mucho cuidado y adecuadamente provistos de guantes de goma, bata de
laboratorio, y en ocasiones mascarilla, ya que muchos huevecillos y larvas tienen
capacidad de infestación, se procede al estudio parasitológico del animal vivo o su
cadáver.
Para la búsqueda de parásitos externos artrópodos (pulgas, piojos, mallófagos,
ácaros.… ) se separa cuidadosamente el plumaje, pelos o escamas, en diferentes partes
de la anatomía del animal. Los parásitos localizados se conservan en líquido fijador
(alcohol 70º) indicando su ubicación sobre el hospedador.
Si el animal es matado en el laboratorio, se extrae una muestra de sangre, para la
investigación de microfilarias y otros parásitos protozoos sanguíneos, haciendo frotis
finos y gruesos, que se teñirán más tarde.
La disección de la cavidad abdominal y torácica permitirá la búsqueda de formas
enquistadas o larvarias de helmintos. Se analizarán los peritoneos parietal y visceral,
en los que se pueden encontrar filarias adultas horadando las membranas serosas.
Cada órgano extraído se colocará en un recipiente con suero fisiológico (para evitar
que el shock osmótico reviente los parásitos). Los órganos huecos (intestino,
conductos biliares, vesícula biliar, vejiga urinaria, oviductos…) se abrirán con tijeras y
se agitarán en suero fisiológico para desprender los parásitos que puedan estar
adheridos al revestimiento epitelial.
Los órganos macizos (hígado, riñones, pulmones…) se desmenuzarán con pinzas o
tijeras.
Todos los recipientes conteniendo las vísceras con las solución salina o fisiológica, se
dejarán sedimentar, eliminando el sobrenadante. (se repite la operación tantas veces
sea necesario hasta que el sedimento aparezca claro). El sedimento final se estudia
bajo el microscopio. Es más aconsejable la observación en vivo de los helmintos, que
posteriormente se fijarán según las técnicas que a continuación se exponen.
El estudio del contenido duodenal, y fecal, serán objeto de estudios coprológicos que
se detallaran posteriormente.
B.- FIJACIÓN Y CONSERVACIÓN DE PARÁSITOS.
Para conservar los parásitos de forma indefinida, a fin de que su morfología y
estructura no se alteren con el tiempo, es preciso fijar los tejidos. Dependiendo del
grupo zoológico al que pertenezca el parásito que pretendemos conservar, y la
naturaleza de sus estructuras corporales, la técnica empleada podrá variar.
En el caso de que se trate de animales blandos, musculosos o retráctiles, previamente
a la fijación se debe proceder a la relajación del animal, para que pueda permitir su
estudio y determinación sin alteraciones morfológicas.
b.1 Relajación: Los animales pueden ser dormidos o relajados con varios
procedimientos:
a) Con líquidos calientes (70-75ºC). El líquido de Travasos a 70-75ºC hace que el
cuerpo, de los Nematodos sumergidos el él, se relaje y estire, antes de que mueran.
b) Con frío: Colocando a los ejemplares en medio isotónico y enfriándolos en la nevera.
(En el caso de las duelas y otros platelmintos, da buen resultado situar los animales
entre dos láminas de cristal y mantenerlas apretadas hasta su muerte y posterior
fijación.)
c ) Colocando los ejemplares vivos en medio isotónico al que se le va añadiendo
lentamente solución alcohólica de mentol y en el que deben de permanecer una hora.
b.2 Conservación indefinida: Los parásitos se pueden conservar indefinidamente en
líquidos con base en fijadores como el formol 4% o el alcohol 70 %, dependiendo del
filo, pero conviene realizar una fijación previa con fijadores más específicos.
b.3 Etiquetado: Para que un espécimen o una muestra tengan valor y puedan servir
como base de un estudio científico debe ineludiblemente de ir acompañado de
etiquetas identificativas en la que se indiquen: Nombre específico, Nombre del
hospedador, Ubicación del parásito, Localidad de recogida, fecha, y colector.
Líquidos Fijadores: Existen diversos líquidos fijadores que preservan los tejidos
durante mucho tiempo.
Fijación de Platelmintos y Acantocéfalos:. La mayoría de ellos tienen como base el
formol, el alcohol, y el ácido acético. Cuando no se pretende realizar posteriores
estudios histológicos, el más sencillo y utilizado de los fijadores es el formol al 4 % .
Formol al 4%
Formalina (formol comercial al 40%) 1 parte
Suero fisiológico 9 partes
Cuando se desea conservar la flexibilidad de los ejemplares, se pueden emplear
satisfactoriamente para Platelmintos y Acantocéfalos los fijadores de Gilson, de
Bouin o el formol-acético- formol, cuyas composiciones a continuación se indican.
Fijador de Gilson:
Sublimado corrosivo 5 g.
Agua destilada 220 ml
Acido Nítrico 4 ml
Acido acético glacial 1 ml
Alcohol etílico 70% 25 ml
Fijador de Bouin:
Solución acuosa saturada de ácido pícrico 75 partes
Formol comercial 25 partes
Acido acético glacial 5 partes
Formol - acético - alcohol (F.A.A.)
Alcohol etílico al 95 % 50 partes
Formol comercial 10 partes
Acido acético glacial 2 partes
Agua destilada 25 partes
Fijación de Artrópodos, Nematodos, o aquellos que tengan
estructuras calcáreas: deben de fijarse en Alcohol de 70%.
En Nematodos, por su cutícula externa, los compuestos con base en formol no so los
más adecuados, por que se deben fijar en alcohol de 70%. Se puede emplear,
previamente, el líquido de Trasvasos, o una solución de glicerina y alcohol o formalina
caliente al 5%.
Líquido de Trasvasos: Solución salina fisiológica de Ringer (0.9 %) 92 partes
Formol comercial 5 partes
Acido acético glacial 3 partes.
Al cabo de una hora puede pasarse para su conservación definitiva en alcohol al 70%.
Solución de glicerina - alcohol:
Alcohol etílico de 70% 90 ml.
Glicerina 10 ml
Puede servir como conservante definitivo.
C .- DETECCIÓN Y DIAGNÓSTICO.
Los procedimientos seguidos para la determinación de los diferentes grupos de
parásitos depende de la naturaleza, localización y abundancia de los mismos, siendo
algunos más adecuados que otros.
c.1. Examen de sangre .
Condiciones generales del Laboratorio y material de Análisis: La preparación de
buenas extensiones sanguíneas dependerá en gran medida de la pulcritud de los porta
y cubreobjetos, así como del resto del material analítico, que debe de estar
perfectamente lavado en alcohol y secado, antes de preparar la extensión. Para
preparaciones permanentes se debe utilizar material nuevo.
La preparación de sangre fresca debe ser suficientemente delgada para que no queden
los parásitos enmascarados por las células sanguíneas. Se coloca una gota en un porta
(pudiendo diluirse con suero salino) y se tapa con cubre para evitar la coagulación. El
análisis de sangre fresca es práctico para la detección de trypanososmas y
microfilarias, por su característica forma de moverse. Los trypanosomas se ven con un
objetivo potente y poca iluminación. Las microfilarias se detectan con bajos aumentos.
El movimiento en vivo de los parásitos atrae la atención del observador facilitando el
trabajo. Pero para su determinación específica es necesario realizar una posterior
tinción permanente.
Preparaciones permanentes: Es preferible emplear sangre periférica (lóbulo de la
oreja, yema del huevo,...) eliminando previamente con alcohol la grasa de la piel. La
incisión debe ser limpia y profunda, sin que se precise apretar la herida para que
sangre. La extensión debe de ser rápida para evitar la coagulación. Es preferible la
sangre arterial pues la venosa distorsiona los resultados
Para el estudio de parásitos de la Malaria, Trypanosomas, Filarias y otros, se deben de
hacer frotis, tanto finos como gruesos.
c.1.1. Frotis: Es una capa de células sanguíneas regularmente distribuidas.
Los frotis delgados producen poca distorsión en la estructura morfológica de los
parásitos. Se usan para detectar la malaria, trypanosomas y microfilarias. Es
fundamental que la extensión sea delgada. Si la película de sangre es demasiado
gruesa no se ve la estructura del parásito.
Se coloca una gota de sangre a 2 cm del extremo de un porta; con el borde de otro
porta se contacta con la gota de sangre y se deja que se extienda la sangre por la
línea de contacto. Se desplaza el segundo porta sobre el primero con una inclinación
de 30º, haciendo una extensión uniforme y fina. Se deja secar al aire.
Posteriormente puede teñirse.
Los frotis gruesos o Preparaciones en gota gruesa se hacen colocando una gota de
sangre sobre un porta, y con la esquina de otro porta se extiende la sangre con
movimiento circular y un diámetro de 15 mm. Se deja orear toda la noche, y la sangre
se hemoliza a l colocar el portaobjetos en agua destilada. (Se puede omitir la hemolísis
si se tiñe con Giemsa 1:50).
Los frotis gruesos, aunque producen la distorsión de los parásitos, permiten analizar
mayor cantidad de sangre y aumentan la probabilidad de detectarlos, haciendo el
análisis tres veces más rápido. Sin embargo, si se hacen mal resultan inútiles.
Fijación: Se pueden sumergir en alcohol metílico absoluto, durante 30 segundos.
Coloración: A veces el colorante lleva incorporado el fijador, por lo que es simultánea.
- Coloración Wright (con alcohol metílico). De rápida acción y buenos resultados.
- Coloración Giemsa: De más precisión.
Solución Giemsa:
Giemsa en polvo 1 g
Glicerol 66 ml
Metanol absoluto 66 ml
Se muele el polvo en un mortero que contenga de 5 a 10 ml de glicerol.
Se añade el resto y calienta a 55º en baño María hasta su total
disolución. Se enfría y añade el metanol. Se deja reposar 2 o 3 semanas.
Se filtra y almacena en botella ámbar a oscuras.
Buffer de trabajo pH 7.0.: Se prepara semanalmente y filtra antes del uso.
Agua destilada 900m l
Buffer stock Nº 1 61 ml
Buffer stock Nº 2 38.9 ml
Buffer stock Nº 1:
Fosfato disódico 0.067 M 9.5 g
Agua destilada 1000 ml.
Buffer stock Nº 2:
Fosfato monosódico 0.06 M 9.2 g
Agua destilada 1000 ml
También se puede comprar dilución de solución stock de Giemsa .
Modo de tinción: Requiere un fijado previo con alcohol metílico absoluto. Se sumergen
los frotis en solución Giemsa durante tiempo variable:
o Solución Giemsa 1:100 Tiempo 2 horas.
o Solución Giemsa 1:50 Tiempo 45 mint.
o Solución Giemsa 1:20 Tiempo 20 mint.
Se enjuaga con suavidad en buffer de trabajo pH 7.0, se escurre y seca al aire en
posición vertical. Se observan con objetivo de inmersión sin cubreobjetos, con aceite
de inmersión.
Para conservar indefinidamente la preparación debe de ponerse cubreobjetos con un
medio dióptrico. (Las tinciones palidecen con el tiempo.)
c.1.2. Técnica de Knott para concentrar microfilarias: Util si se sospecha de
filariasis.
1. Se toman 2 ml de sangre venosa y se coloca en un tubo de centrífuga que
contenga 10 ml de formalina al 2%.
2. Se tapa el tubo y mezcla vigorosamente, invirtiéndolo y agitándolo. (Mata los
eritrocitos, fija los Protozoos, y engruesa el cuerpo de las filarias).
3. Se centrifuga el tubo a 1000 r.p.m., durante 5 mint. Y deja reposar. Tapado en
la nevera toda la noche.
4. Se decanta la nata.
5. Con pipeta Pasteur, se recoge el sedimento y se distribuye en capa gruesa en
un portaobjetos.
6. Se estudia húmedo , o se deja secar toda la noche para después teñir con
Giemsa durante 45 mint.
7. Se coloca en agua de pH 7.2 de 10 a 15 mint., se deja secar y se examina.
c.2. Examen de otros tejidos:
c.2.1. Improntas tisulares: Ayudan a localizar parásitos intracelulares
como Leishmania y Toxoplasma
Los nódulos linfáticos en fresco, material de biópsia hepática o médula ósea se aplican
sobre un portaobjetos limpio y se deja secar y se tiñe como una extensión sanguínea.
c.2.2.Tinción plata para Pneumocystis carinii: Las improntas tisulares de biopsia
pulmonar o de aspirado traqueal se tiñen según el método Grocott (Es complejo y tiene
Metenamina de Ag) El Pneumocistis queda en color negro.
c.3. Examen de contenido duodenal.
Debe de hacerse una disección cuidadosa con apertura del tubo digestivo mediante
incisión, y un raspado de la mucosa interior. Es el método más fiable para el estudio de
larvas de Strongyloides o Nematodos y Cestodos adultos, así como de otros parásitos
intestinales como Giardia, Isospora y Criptosporidium.
c.4. Métodos serológicos:
Son cada vez más útiles para el diagnóstico de parasitosis, en las que no se puede
llegar al diagnóstico con los análisis de sangre o coprológicos, o en estudios
epidemiológicos generalizados (Laboratorio de Sanidad Animal de Jove, Gijón.).
También sirven para confirmar diagnósticos poco seguros de amebiasis hepática,
toxoplasmosis, esquistosomiasis y toxoplasmosis.
Entre las más frecuentes se encuentran las de inmunofluorescencia, precipitina en
portaobjetos, tubo y agar, fijación de complemento, aglutinación de partículas y de
inmunoensayo de enzimas ligada (ELISA).
c.5. Estudios Coprológicos: Examen de heces. (Atención a la contaminación fecal)
Existen diversos procedimientos indicados según el tipo de parásito que se pretende
identificar, siendo importante usar la adecuada, pues de lo contrario el parásito se
hace muy difícil o imposible de identificar.
Examen macroscópico de heces Cracterísticas físicas de la muestra:
1- Observación de la consistencia (blandas o líquidas). Indica el tipo de organismos
que puede contener. Los trofozoitos de los Protozoos intestinales se encuentran en
heces blandas o líquidas (no se encuentran en heces con forma, mientras los quistes
nunca están en las líquidas. Los huevos y larvas de helmintos pueden encontrarse en
todo tipo de consistencias, pero en las líquidas suelen estar muy diluidos por lo que es
preciso la : concentración.
2. Búsqueda de parásitos en la superficie de la muestra: Plogótides de Cestodos,
Oxiuros adultos…
1. Desmenuzamiento de las heces para buscar nematodos adultos: Ascaris…
2. Búsqueda de sangre o moco: Puede revelar hemorragias y ulceraciones
producidas por parásitos. En el moco pueden existir trofozoitos.
3. Búsqueda del escólex, tras tratamiento con vermífugos.
El tiempo de la muestra: En la heces blandas o líquidas, para observación de
trofozoitos han de ser observadas antes de 4 horas desde su deposición. Si no es
posible, deben de fijarse. Las heces formes pueden examinarse varios días después,
recomendándose la fijación.
Fijación de la muestra: El fijador más sencillo de utilizar el formol al 4%.
El alcohol polivinílico (PVA) Debe advertirse en la etiqueta su carácter
de veneno, pues contiene Mercurio. Es rápido y versátil dando excelentes resultados
pues permite técnicas posteriores de tinción tricrómica y coloración. Puede deformar
los huevos de helmintos de cubierta fina.
Fijador de Alcohol Polivinilo (PVA):
Alcohol etílico 95% 156 ml
Cloruro mercúrico saturado 312 ml
Acido Acético Glacial 25 ml
PVA en polvo 20 ml
Glicerol 7.5 ml
Conservación de la muestra de heces: Cuando las muestras no se pueden observar en
un corto periodo de tiempo (1/2 hora para las líquidas y blandas y 4 horas para las
formes) se conservarán en la solución de MIF, con lo que preservará la muestra
algunos meses y la teñirá. No se podrá hacer una tinción, pero sí la coloración con iodo
y Mertiolato. Para posterior tinción de muestras (en el periodo de 1 mes) usar como
fijador el PVA ya indicado.
D. Técnicas de examen microscópico:
Calibración del ocular: Para poder medir los parásitos y realizar un diagnóstico
diferencial del mismo, el ocular debe de estar provisto de un micrómetro calibrado.
a. Se coloca un micrómetro bajo la lente ocular del microscopio.
b. Se coloca una escala micromética de un milímetro calibrada en centésimos, en
la platina del microscopio, con objetivo 10x, se enfoca la platina Cada uno de
0.01 mm = 10 micras.
c. Se alinea el extremo izquierdo de la escala ocular con el izquierdo de la escala
de la platina.
d- Se encuentra el lugar más lejano hacia la derecha en donde coincida una
línea del micrómetro ocular con una del micrómetro de la platina.
d. El número de micras indicado por cada división de la escala ocular se calcula
mediante la siguiente fórmula:
Nº de espacio del micrómetro x 10 micras =micras / espacio ocular. Nº
de espacios del micrómetro ocular
f- Deben de repetirse los pasos dos a seis para cada objetivo y registrar las
equivalencias de los mismos.
g- Para medir un parásito, se cuentan el número de espacios oculares
existentes entre los extremos y se multiplica por el factor adecuado.
Frotis fresco: Es el método más sencillo para investigar una posible infección
parasitaria. Permite observar la motilidad de los organismos que facilita la detección
de trofozoitos de amebas y flagelados. También permite detectar quistes y huevos de
helmintos, aunque deben de concentrarse.
Modo de proceder: Sobre un porta limpio se coloca una pequeña porción de materia
fecal y una gota de suero fisiológico. Se coloca un cubre y se observa sin teñir. Es
importante que e frotis no se a denso si no transparentes. Se repite la observación
con diferentes muestras.
Tras la observación de trofozoitos puede utilizarse tinción de Iodo que tiñe quistes y
destaca detalles (los trofozoitos mueren y resultan inidentificables).
Técnica para determinar Protozoos Ciliados: Para hacer que el movimiento de estos
seres sea más lento, se hace viscoso el medio añadiendo al porta una gota de glicerina.
E. Técnicas de concentración:
Detección de huevos larvas de helmintos y quistes de protozoos. Para facilitar el
encuentro de los elementos diagnósticos, con estas técnicas se produce la
concentración de los mismos en la muestra tomada. Tienen como objeto la separación
de quistes de Protozoos y huevos y larvas de helmintos del resto de la materia fecal,
por medio de su densidad específica: por sedimentación y por flotación.
Técnicas de Sedimentación:
o Método sin centrifugación:
1- Se emulsionan 3 gramos de heces junto a un volumen de agua 20-30 veces
superior, en un matraz ( se pueden utilizar perlas de cristal para su disgregación).
2- Se filtra a través de una gasa mojada (o una malla de diámetro calibrados, según el
tamaño del parásito que busquemos), a una copa cónica graduada de 500 ml, que se
llena con agua hasta 2.5 cm del borde. Se agita para suspender uniformemente.
3- Se deja reposar 30-40 mints. y quita el sobrenadante hasta la marca de 100 ml y se
vuelve a llenar de agua. Se repite 3- 4 veces hasta que el sobrenadante aparezca
claro.
1. Se tira el sobrenadante hasta 10 ml. Sedimentar 30 mint. Observación al
microscopio de 2-3 gotas entre porta y cubreobjetos largo ( de 40 mm).
Ventaja: Con ella se recuperan todos los huevos de helmintos, larvas de Nematodos y
quistes de Protozoo de las muestras fecales sin distorsión.
Inconveniente: No concentra las formas parasitaria y lleva mucho tiempo.
Recomendado: Para huevos de trematodos y operculados de cestodos (de gran
densidad).
 Técnica de sedimentación de Ritchie: formol-éter)
 Método con centrigugación.
Muy útil para la concentración de quistes y huevos, puede aplicarse a muestras
fijadas. (Empleada en el Ambulatorio de la Lila).
Método:
1. Se aplastan 10-20 gr. de heces (una cucharilla), y se mezclan bien con 10-12 ml
de solución salina. Se filtra a través de dos capas de gasa quirúrgica en un tubo
de centrífuga de 15 ml
2. Se centrifuga 5 min. A 1500 r.p.m.. Se decanta la nata en desinfectante. El
sedimento se vuelve a suspender y centrifugar en solución salina.
3. Se lava el sedimento y se mezcla con 10 ml de formalina al 10 % (= formol al
4%), se deja reposar 5 mint. (Así se matan y preservan los Protozoos, larvas y
mayor parte de huevos)
4. Se agrega 3 ml de éter (cuidado con las llamas, vapores explosivos), y se coloca
un tapón (no soluble en éter) . Se invierte y agita con fuerza y centrifuga 2
mint. A 1.500 r.p.m. (Aquí se extraen las grasas de las heces y disminuye el
volumen de las mismas). Se quita con cuidado el tapón (Atención, al salir los
vapores de éter pueden arrastras y salpicar de restos fecales). Puede
 sustituirse el éter por acetato de etilo, que no es inflamable, además aumenta
la obtención de huevecillos de Himenolepis nana y de quistes de Giardia lamblia.
5. Se despega la capa superior de los restos con un aplicador de madera y toda la
nata se decanta en desinfectante. Se invierte totalmente el tubo desde la
centrifugadora con un movimiento suave, pero en un solo tiempo. Se mezcla una
gota del sedimento fecal y una tintura de Iodo en el portaobjetos.
6. Se coloca un cubreobjetos y se pasa al microscopio , buscándose los parásitos.
También debe de observarse sin teñir, ya que los quistes se ven mejor de ésta
manera.
Técnicas de flotación:
Los resultados se mejoran en la separación de los parásitos, basados en
la diferencia del peso específico entre los huevos de helmintos, larvas y
quistes de protozoos y la solución utilizada (cuya densidad oscila entre
1.18 y 1.20) por lo que los huevos de los Nematodos flotan. (Los de los
Trematodos, y Cestodos Pseudofilineos , no).
Los huevos pueden concentrarse en la superficie
por centrifugación (estratificación según diferencias de densidades) o
por ascensión. (Tubos verticales en la gradilla durante 1 hora) .
 Flotación directa con centrífuga (F.D.C.):
Solución concentrada de sacarosa ( Sheather)
A 0.5 ó 1 gr. De heces formes, (1 ó 2 ml de líquidas) se echa en un tubo
de centrífuga con 7-8 ml de Sheather’ sugar. Se mezcla . Se centrifuga
a 500 r.p.m. durante 5 min.. Se toma un poco de la superficie y se coloca
en portaobjetos y cubreobjetos. Se observa con contraste de fases.
También se utiliza una solución concentrada de Cl Na , que se prepara
hirviendo una solución con exceso de sal, se enfría y se filtra.
Método: Se mezclan 2-3 g de heces con agua para formar una
suspensión gruesa, a la que se añaden 25-30 ml de la solución salina
concentrada. Se mezcla bien y se hace pasar por una gasa doblada en un
embudo a un tubo de centrífuga de 15 ml., que se llena hasta 0.5 cm del
borde. Se coloca el tubo en la centrífuga, y se llena con nueva solución
salina, hasta formar un menisco convexo en la superficie, sobre el que se
adhiere un cubre de 22 mm, sin que se formen burbujas. Se centrifuga a
900/1000 r.p.m durante 3-5 mints.
Se toma el cubreobjetos horizontalmente y se coloca sobre un porta. Se
observa al microscópio.
 Flotación Indirecta con Centrífuga (F.I.C.): Como en la técnica anterior,
pero en éste caso se llena el tubo de centrífuga hasta 0.5 del borde y
centrifuga 3-4 mint. A 900/1000 (r.p.m.). De la capa superficial, se toma una
muestra con un asa de 1 cm de diámetro. (o con una barra de vidrio). Se coloca
entre porta y cubre y se examina.
Técnica de la ascensión:
 Con tubos de ensayo normales colocados verticales en una gradilla, se
llenan con solución salina concentrada y la suspensión de heces.
Al cabo de 1 hora, como en la técnica F.D.C. se coloca un cubre sobre el menisco, o
como en la técnica F.I.C., se toma una muestra de la superficie.
Observación al microscopio: Tras la concentración por cualquiera de los métodos se
lleva una gota del material obtenido al portaobjetos y se añade una gota de colorante
de Iodo para teñir los quistes de los protozoos que puedan existir.
Técnica de migración ( baermann-wetzel):
Con este método se pueden observar larvas de: Dictyocaulus(l-i),
Protostrongylidos (l-i), etc. Se emplea para la determinación de larvas
de nematodos broncopulmonares, sobre todo en rumiantes.
 Se pesan 10 g de heces de ovino, o 20 g de heces de bovino.
 Se hace una torunda con las heces previamente maceradas.
 Las heces se introducen en un aparato de BAERMAN que consiste en un
embudo soportado en posición vertical al que se le añade en su extremo una
goma tubular que se cierra con una pinza.
 Se colocan las heces en el embudo y se llena de agua templada.
- Debe permanecer aproximadamente 12 horas, tras este tiempo las
larvas, por gravedad, se disponen en la parte inferior del tubo de goma.
- Recoger 5-10 ml en un tubo de ensayo y centrifugar a 1.500-2.000
rpm., 5 min.
 Se elimina el sobrenadante para observar las larvas en el concentrado.
 Los 2 ml de centrifugado se pasan a una cámara de FAVATI para su recuento
para ponerlos en relación a la cantidad de heces iniciales.
F.Técnica de recuento de huevecillos:
Sirve para el control de la eficacia del tratamiento empleado, ya que con su
conocimiento se puede inferir la magnitud de la infestación del parásito, y si este
responde al mismo, ya que existen datos numéricos de la cantidad de huevos que
diariamente liberan cada hembra adulta de helminto. Se debe evaluar un peso conocido
de heces , aunque existen muchas variables que pueden influir en la alteración de los
datos (malas digestiones, tipo de dieta, ciclos de producción de los huevos,
consistencia de las heces..)
Método:
1. Se llena una probeta graduada de 100 ml con 56 ml de N OH
2. Con un depresor lingual, Se añaden heces hasta elevan el volumen a 60 ml.
3. Se añaden 10 cuentas de vidrio y agita fuertemente para disgregar las heces. (
En caso de heces muy compactas es preciso que pasen varias horas en la nevera
hasta que se ablanden)
4. Cuando estén totalmente disueltas se agita y de inmediato se toman 0.075 ml
de la suspensión que se pasa a un portaobjetos, que se tapa con cubre de 22
mm.
5. Con aumento x100 se buscan huevecitos por toda la preparación y se recuentan.
 6. Se repite el muestreo dos veces utilizando partes alícuotas de 0.075 ml. (En
total 0.15 ml)
7. Cálculo: Si la disolución fecal es de 1/ 15 ( 4 ml / 60 ml) Y el nº de huevecitos
se contó en un volumen de 0.15 ml, la cantidad de huevos por ml de heces es
igual a : Nº de huevos recontados x 100.
8. Si la cantidad de heces diarias es de 100 gr. è El nº de huevos se obtiene
multiplicando la cantidad anterior por 100.
9. Se divide el nº de huevos recontados entre el nº de huevos conocidos que
produce al día cada hembra en las diferentes especies es: Necator:
7.000, Ascaris: 200.000, Trichuris: 7.500
10. El cociente se multiplica por dos ya que se estima que existe una hembra por
cada macho.
Recuento en cámara de Mcmaster:
Se pueden contar con esta técnica los huevos de Fasciola y Dicrocoelium, y así
determinar el grado de infestación del paciente.
La cámara posee dos celdillas cuyo volumen es de 0.15 ml (en total 0.30 ml) . Si hemos
encontrado, por ejemplo, 5 huevos en cada una de ellas y sabemos que el tubo con el
sedimento tenía un volumen de 10 ml debemos hacer el siguiente cálculo:
10 huevos ____________ 0.30 ml 333.3 huevos __________ 3 g de heces
x ____________ 10 ml x __________ 1 g de heces
X = 333.3 huevos X = 111.1 huevos por cada g de heces

Tecnica de bailenger:
Es un método rápido, económico y sencillo adecuado para observar huevos de Taenia,
Toxocara, Toxascaris, Dipylidium caninum, Trichuris, Capilaria, Moniezia. . Pero resulta
poco representativo (falsos negativos).
Modo de proceder:
Emplea 3 g de heces y 30 ml de SOLUCION TAMPON formada por:
15 g de ACETATO SODICO CRISTALIZADO 0.18 M.
6 g de ACIDO ACETICO 0.10 M (5-7 ml).
1000 ml de AGUA DESTILADA
Se mezclan las cantidades indicadas y se filtra a través de una gasa hasta la mitad de
un tubo de 10 ml la otra mitad se completa con ETER DE PETROLEO que, por su menor
densidad quedará en la parte superior del tubo. Se debe agitar esta mezcla y
rápidamente introducir el tubo en la centrífuga, durante 3-5 min a 1.500-2.000 rpm.
Finalizada la centrifugación se rechaza todo menos el sedimento inferior que está
pegado al tubo. Se deposita una gota de este sedimento y otra de agua destilada
sobre un porta, se coloca un cubreobjeto y se observa al microscopio.
G. TÉCNICAS ESPECIALES DIRIGIDAS.
Técnica de Grahan del papel de celofán adhesivo:
Con cinta adhesiva transparente, se coloca con la cara adhesiva sobre el extremo
cerrado de un tubo de ensayo, presionando sobre la mucosa perianal y se adhiere a un
 portaobjetos para su observación en el microscopio con una gota de agua o de xilol.
Está indicado para la detección de huevos de Enterobius y Taenia.
Identificación de tenias a partir de muestras fecales:
Si se encuentras proglotis maduros deben de lavarse con agua del grifo. Se colocan
entre 2 portaobjetos e intenta su aplastamiento con bandas elásticas en sus
extremos. Las ramas uterinas se ven por transparencia bajo lupa a pocos aumentos. Se
mejora el contraste con la inyección de tinta china a través del orificio genital. (Este
procedimiento funciona mejor en proglotis frescos que fijados.)
Diagnóstico de microfilarias : Por no ser nuestro país área de distribución geográfica
de filarias, nos remitimos a la cita bibliográfica, sin describirlas en estos apuntes.
Diagnóstico de larvas musculares de Trichinella:
a) Trichineloscopía: Se comprimen trozos de 2mm de músculo entre dos cristales.
Pueden ser dos portas. Se observa al microscopio por transparencia, y se observa
entre los paquetes de fibras musculares.
b. Digestión de músculos infestados:
Montar un aparato usando un embudo de 12-15 cm de diámetro y una
pieza circular de malla de alambre inserte 2-3 cm por debajo del borde
del embudo. Se cierra el borde del tubo de goma con una pinza de
presión. Picar el músculo hasta que quede como una hamburguesa , y por
cada 50 gr de carne, se añade la siguiente cantidad de líquido de
digestión.
Líquido digestivo:
Agua 600 ml
Pepsina 5 g
Acido Clohídrico concentrado 10 ml.
Procedimiento: Se llena el embudo con líquido de digestión hasta 1,5 cm
del borde. Se colocan 4-5 capas de gasa sobre la malla del alambre y
sobre ella la carne picada, digeriendo de 24-48 horas a 35-37ºC en
solución salina fisiológica. Pasado ese tiempo recoger las larvas del
fondo el embudo abriendo la pinza a presión. Las larvas se mantienen
bien de 30 a 35 ºC en suero fisiológico.
¡¡¡¡¡ Atención: LAS LARVAS SON INFESTANTES. cuidado no
contaminarSE las manos ni la ropa de laboratorio.!!!!
Aislamiento de nematodos del suelo o heces.
 Técnica del vaso de papel:
Indicado para separar larvas de Nematodos pulmonares, ancilostómidos y estróngylos
equinos del suelo o heces, o para el aislamiento de fitoparásitos del suelo.
Quitar el fondo a un vaso (desechable) de papel encerado o plástico, que será
sustituido por una triple capa de gasa y ajustado por medio de una goma elástica.
Colocar tierra o heces en su interior, e introducirlo en otro vaso con 15-20 ml de
agua, durante 24-36 horas. Los Nematodos atravesarán las gasas, pasando al fondo
del vaso exterior.
  Método de Baermann- Wetzel.
El aparato de Baermann se monta como indica la figura. Es adecuado, cuando la
muestra a examinar en de cierto tamaño. Se coloca la tierra o las heces sobre la gasa
y se llena el embudo con agua. Encima se coloca una fuente de calor. La recogida de
los Nematodos se realiza abriendo la pinza de presión y derramando parte del agua
en un vaso de precipitados.

Incubación y aislamiento de larvas de nematodos.

 Técnica del carbón:
Se mezclan una parte de heces con dos partes de carbón animal, disponiendo la mezcla
en el fondo de una placa Petri. Se coloca ésta en el interior de un cristalizador, con 1
cm de agua, tapado por una lámina de cristal. Se incuba a temperatura del ambiente. Las
larvas emigraran desde la placa al agua del cristalizador, de donde se recogen tomando
el agua, que se pasa a un vaso, sedimentando en éste las larvas limpias y libres de
residuos.
Si tenemos mezclados larvas infestantes y de Nematodos libres, se pueden separar
colocándolas en una solución de ClH. (1 parte de ClH en 30 de Agua destilada).
 Técnica del frasco:
Se coloca en un frasco de boca de rosca, semitapado, heces hasta una altura de 2-5
cm, y ponerlo a incubar a temperatura del ambiente, en la oscuridad durante 6-8
días.
Llenar el frasco con agua e invertirlo sobre una placa de Petri. Llenar la placa hasta la
mitad con agua y dejar el dispositivo durante la noche, con lo que las larvas emigrarán
al agua de la placa.
H. Preparación y Montaje
1.- Preparaciones semipermanentes de huevos de helmintos:
A partir de heces: Se toman 1-2 gr. de heces en una pequeña cantidad de agua. Se
filtra la suspensión a través de una gas. Se mezcla el filtrado con un volumen igual de
formol al 4%. Se centrifuga y elimina el sobrenadante. Se agita el sedimento y se
toma una gota que se coloca sobre un cubre circular de 22 mm. Sobre éste se coloca,
concéntricamente; otro de 18 mm. Cuando la solución comienza a secarse por los
bordes, se coloca una gota de solución ligera de resina damar en el centro del cubre
pequeño y se invierte, apoyándolo sobre un portaobjetos , por lo que la resina se
distribuirá sellando el borde del cubre pequeño. Los huevos de la suspensión fecal en
formol al 4% quedan entre los dos cubreobjetos. Al cabo de un mes se puede sellar al
preparación con asfalto, Murrayita o laca de uñas.
Tinciones permanentes: Las preparaciones frescas, coloraciones con iodo y
concentración de la muestra facilitan la primera aproximación al tipo de parásitos,
permitiendo la detección de quistes y huevos. Pero la determinación exacta de los
mismos solo se logra con preparaciones permanentes, en las que los detalles
citológicos se revelan con claridad.
Modo de proceder: Con varilla se extiende sobre un porta limpio una fina capa de
heces. (En las heces muy duras es preciso añadir una gota de suero fisiológico) Las
heces frescas es preciso fijarlas después de realizar el frotis. Si se secan no son
útiles.
Cuando la muestra está fijada con PVA, se revuelve la muestra, se filtra por gasa y
tras sedimentación se toma una pequeña porción con varilla., colocándola sobre papel
absorbente para eliminar el exceso de PVA. Se extiende sobre el porta y deja secar a
Tª ambiente durante 2 horas. Posteriormente se puede teñir.
Número de muestras a examinar: Dependiendo de lo que se pretenda buscar.
Presencia o ausencia de helmintos parásitos: 1 o 2 exámenes con técnicas de
concentración.
Infecciones amebianas: 6 análisis para el 90% de certeza.
2.- de animales de pequeño tamaño ("in toto").
Los pequeños ejemplares fijados, que por sus especiales características de
transparencia, serán estudiados bajo lupa o microscopio, deberán ser montados en
portaobjetos de cristal realizando así preparaciones permanentes.
Procedimiento básico:
1. Fijación: Con formol, o alcohol, según el tipo de animal.
2. Coloración: En ocasiones resulta indicado, para resaltar las estructuras
internas que se ven por transparencia, una coloración sencilla con carmín, iodo,
u otros colorantes.
3. Deshidratación: Se hace pasar por baños sucesivos de alcoholes de gradación
creciente
( 70%à 90%à absolutoà absoluto) El tiempo se fija según tamaño.
4. Intermediario: Una vez escurrido el alcohol, y sin que el ejemplar se seque,
se coloca sobre el portaobjetos y se añade una gota de xilol.
5. Aclarado: Se puede añadir una gota de creosota de haya, que vuelve
transparente la preparación.
6. Inclusión: Escurrido el xilol ( y sin que nunca se seque) se pone la resina
necesaria para el montaje (Bálsamo de Canadá, resina damar, o resinas
sintéticas como Eukit, , etc). Sobre la resina se coloca el cubreobjetos,
procurando que no queden burbujas de aire. (Apoyando el borde del mismo
sobre el porta con un ángulo de 40 º, y se deja caer suavemente). Se dejan
secar en posición horizontal en estufa durante 24 horas.
7. Etiquetado: En una etiqueta adhesiva de tamaño adecuado se identifica la
preparación indicando: Nombre del especimen; Hospedador,Ubicación,
Procedencia; Autor del montaje y fecha.
3.- Aclaración de los Nematodos:
La impermeabilidad de su cutícula hace que los colorantes no penetren con facilidad,
por lo que, para el estudio de sus órganos internos, deben de hacerse transparentes y
montarse provisionalmente en glicerina, glicerina-gelatina, fenol al 88% o lactofenol.
Los ejemplares deben de estar en alcohol 70%, calentado a 70 ºC. Si estuvieran
fijados en formol, deberán pasarse a una mezcla a partes iguales de formol y alcohol
70% durante 3 horas y luego se hacen otros dos pases de 3 h. Por alcohol 70%.
a. Glicerina: En una placa, con tapa no ajustada, se coloca glicerina al 10% en
alcohol de 70%. para que la evaporación lenta del alcohol permita el aclarado
por la glicerina. (Puede tardar varios días)
b. Glicerogelatina:
Gelatina incolora (Knox u otra) 8 g
Agua destilada 52 ml
Glicerina 50 ml
Albúmina de huevo (freca) 5 ml
Cristales de fenol 0.1 g
Modo de preparación: Remojar la gelatina en agua 1 hora. Disolver calentando
ligeramente. Añadir la glicerina y la clara de huevo, agitar hasta mezclar por
completo y después calentar a 75 º C durante 30 mint. Filtrar a través de
varias capas de franela fina. Añadir cristales de fenol al filtrado y mantener en
frasco de boca ancha firmemente cerrado.
Modo de empleo: Para montar el jemplar, transferirlo de la glicerina a un porta
y cubrirlo con 2- 3 gotas de gliceroglatina fundida . Colocar un cubreobjetos
circular. Cuando se haya endurecido, se colocan unas gotas de Permount encima
de cubreobjetos y se coloca otro cubreobjetos, más grande, cuadrado. Se sella
la preparación rebordeando.
Éste método es excelente para las preparaciones permanentes de huevos de
helmintos.
c. Fenol al 88%: (Atención es corrosivo de metales y piel!!!!) El aclarado es más
rápido si desde alcohol al 70% se pasa a fenol al 88%. Los ejemplares grandes
se colocan en una placa , mientras que los pequeños se puede hacer en un porta
excavado con un cubre. El tiempo del aclarado es aproximadamente de 5 a 10
minutos.
Una vez terminada la observación se elimina el fenol con varios pasos por
alcohol de 70%, donde se conservarán o en alcohol-glicerina.
d. Lactofenol: Aunque menos rápido tamién es menos cáustico y más seguro de
usar que el fenol.
Fenol licuado…… 1 parte.
Acido láctico…… 1 parte
Glicerina ………. 2 partes
Agua destilada…. 1 parte
Si se utiliza en caliente, el aclarado es más rápido y existe menos distorsión.
4.- Preparaciones semipermanentes de Nematodos.
Una alternativa al procedimiento anterior que sirve para el montaje in toto tanto de
Nematodos como de pequeños artrópodos.
Líquido de Hoyer:
 Goma arábiga….. 30 g.
Agua destilada…. 50 ml
Glicerina……….. 20 ml.
Hidrato de coral… 200g.
Mezclar en el orden indicados y filtrar a través de 8-10 capas de gasa.
Empleo: Se coloca una gota de líquido de montado en un portaobjetos, orientando los
ejemplares, y aplicando un cubreobjetos. Para extender los ejemplares vivos se
calienta la preparación en la llama de alcohol. Al cabo de un mes se puede sellar los
bordes, con goma de asfalto de Murrayita, o laca de uñas.
5.- Preparaciones permanentes teñidas de Platelmintos y Acantocéfalos.
El estudio de pequeños animales montados enteros, se facilita, si previamente son
coloreadas algunas de sus estructuras con diversos procedimientos.
 Hematoxilina de Herlich:
Hematoxilina…. 2 g.
Alcohol etílico 100ml
Glicerina 100 ml
Acido acético glacial 10 ml
Sulfato alumínico-potásico 10 g.
Solución madre: Se mezcla la hematoxilina con el alcohol y se añade la glicerina y el
ácido acético. El sulfato Al-K, se disuelve en agua destilada templada, y se añade
lentamente agitando. Se deja madurar 3-4 semanas en un frasco semitapado. Para
teñir se emplea una parte de solución madre en 3-4 partes de alcohol a 35%.
Método de empleo: Los ejemplares, conservados en alcohol 70%, se pasan a alcohol
35% durante 10 a 15 minutos., tiñéndolos con una disolución de hematoxilina durante
10-15 mint. Se decoloran con alcohol 70% (solo quedan rosa las gónadas). Se alcaliniza
con alcohol 70% con bicarbonato sódico, durante 20 mint. Deshidratación con
alcoholes de gradación creciente, (20 minutos en cada uno). Se aclaran con aceite de
clavo o metilsalicilato. Se montan en resina.
 Carmín acético de Semichon:
Acido Acético glacial 1 parte
Agua destilada 1 parte
Polvo de Carmín exceso
Solución madre: En un matraz Erlenmeyer, se mezclan en proporciones iguales: Acido
acético glacial y Agua destilada, añadiendo en exceso polvo de carmín. Se calienta al
baño María (95-100 ºC) durante 15 minutos. Se enfría rápidamente al grifo y se deja
sedimentar el carmín no disuelto, filtrando el sobrenadante. Par teñir se diluye una
parte en 2-3 de alcohol al 70%.
Método: Los ejemplares conservados en alcohol, se transfieren directamente a la
solución tintórea. tienen (dependiendo del tamaño) durante 5 a 15 minutos. Se
decoloran con alcohol clohídrico ( alcohol de 70% con un 1% de ácido clorhídrico),
hasta que solo queden rasa claro las gónadas. Se alcaliniza con alcohol 70% con
bicarbonato durante 20 minutos. Se deshidratan con pases por alcohol de 95% y
absoluto. Se montan en resina sintética.
6.- Preparación y conservación de Artrópodos.
Dípteros: Las larvas y pupas se matan metiéndolas en agua hirviendo, y
pasándolas al cabo de 1 o 2 minutos a alcohol de 70%, donde se
conservan..
Imagos de mosquitos y moscas, se matan en un frasco con cianuro o
cloroformo, conservándose posteriormente en alcohol de 70%, o
debidamente pinchados con alfiler entomológica y extendidos.
Siphonaptera: (Pulgas). Para aclararlas se sumergen en solución acuosa
de Hidróxido potásico al 10%, durante 24-36 horas. Se pasan después a
agua acidificada con unas gotas de clohídrico. Se deshidratan con pases
de 30 minutos en alcoholes de gradación creciente, se aclara en
creosota de haya, quitando su exceso con xilol y se montan en goma de
damar o resina sintética.
Garrapatas y piojos: Se matan con agua hirviendo (unos segundos). Se
estiran las patas, (con pinzas o agujas), se pasan a alcohol de 70%. Para
su montado en portas, se sigue el procedimiento empleado con las
pulgas, omitiendo el paso por Hidróxido sódico.
Ácaros: Pueden montarse vivos o a partir de alcohol de 70% en líquido
de Hoyer.
Piezas bucales de Artrópodos picadores-chupadores: Para hacer la
disección de la boca de un artrópodo, 1s e coloca la cabeza en una gota
de glicerina. bajo lupa y con agujas, se separan los músculos que unen las
piezas quitinizadas.
Si se quiere una preparación duradera, se puede montar en líquido de
Hoyer, como los ácaros