Professional Documents
Culture Documents
Abstrak. Penelitian bertujuan untuk mendapatkan teknik in vitro guna perbanyakan bibit
jeruk keprok Brastepu bebas penyakit CVPD sebagai sumber bibit. Bibit digunakan untuk
mengatasi kelangkaan dan biokonservasi jeruk keprok lokal Sumatera Utara agar kekayaan
plasma nuftah tanaman jeruk Indonesia tidak berkurang. Penelitian dilakukan di
Laboratorium Biologi FMIPA USU dan Desa Bukit Kecamatan Brastagi, Kabupaten Karo,
Sumatera Utara. Penelitian merupakan gabungan eksploratif dan eksperimental. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan kultur in vitro dipengaruhi oleh pemberian zat
pengatur tumbuh (zpt) auksin NAA, sitokinin, dengan suplemen ekstrak malt, glutamin, dan
air kelapa. Teknik regenerasi yang efektif untuk perbanyakan tanaman jeruk Brastepu bebas
penyakit CVPD dalam skala laboratorium juga dipelajari sebagai dasar untuk pertumbuhan
dan perkembangan bibit jeruk yang dihasilkan melalui teknik in vitro. Kalus yang dikultur
selama 4 bulan menunjukkan hasil RAPD dengan tingkat kesamaan 100% .
Keberhasilan perbanyakan tanaman secara 252 oC. Kultur akan dipelihara selama 4
in vitro dipengaruhi oleh zat pengatur bulan sebelum dilakukan perlakuan
tumbuh (zpt), sumber nitrogen, konsentrasi lanjutan, dan pengamatan dilakukan setiap
hara dalam media tumbuh, jenis tanaman, 2 hari sekali.
eksplan dan lingkungan tumbuh, iklim.
Sebagai sumber eksplan adalah bagian HASIL DAN PEMBAHASAN
vegetatif tanaman karena mudah diperoleh.
Faktor lain yang penting adalah faktor Penggunaan teknik in vitro dapat
lingkungan seperti kelembapan, pH, suhu, dipergunakan dalam perbanyakan bibit
dan cahaya. Dengan demikian, teknik in jeruk keprok Brastagi yang bebas penyakit
vitro sangat tepat dilakukan untuk CVPD sebagai strategi biokonservasi untuk
perbanyakan bibit jeruk keprok Brastepu mengatasi kepunahan varietas jeruk lokal
bebas penyakit CVPD sebagai sumber bibit Sumatera Utara yang menjadi kekayaan
mengatasi kelangkaan jeruk lokal Brastagi plasma nuftah asli Indonesia.
untuk biokonservasi jeruk lokal Sumatera
Utara agar kekayaan plasma nuftah Kultur meristem pucuk dan sub kultur
tanaman jeruk manis Indonesia terhindar jeruk dilakukan terhadap jeruk lokal
dari kepunahan. Brastepu bertujuan untuk mengoptimalkan
teknik perbanyakan secara teknik in vitro.
METODE PENELITIAN Perbanyakan ini merupakan usaha untuk
mendapatkan bibit jeruk yang sama dengan
Prosedur penelitian terdiri atas skrining induknya dilihat dari potensi fenotip dan
tanaman induk, penyediaan media kultur, genotip, dan sekaligus menghasilkan bibit
sterilisasi eksplan dan pengkulturan yang bebas dari penyakit terutama CVPD.
mengikuti prosedur percobaan yang Kultur pucuk dan subkultur jeruk dilakukan
dijelaskan sebelumnya. Tanaman induk dengan menggunakan sumber eksplan,
yang digunakan sebagai sumber eksplan tunas muda berasal dari ranting tua jeruk
adalah jeruk keprok Brastepu CVPD. terserang CVPD yang direndam dalam air.
Bagian tanaman yang diambil dijadikan Pucuk-pucuk jeruk paling cepat muncul
sebagai sumber eksplan dalam teknik in setelah seminggu dalam perendaman.
vitro. Pucuk yang diperlukan sebanyak 200 buah
yang diperoleh dari dari 200 pohon dengan
Tunas muda tanaman jeruk keprok ukuran 15-20 cm. Beberapa batang tidak
brastepu mulai dari meristem apikal akan menghasilkan tunas. Rata-rata tunas yang
diambil lalu dicuci dengan air sabun dan tumbuh pada satu potong ranting berjumlah
dibilas dengan air kran. Tunas akan 2 buah. Tunas berkualitas baik dengan
dipotong sepanjang 10 cm dari pangkal ukuran memadai sebagai sumber eksplan
kemudian disterilasi dalam kondisi aseptik seperti diperlihatkan pada Gambar 1.
dalam alkohol 70% selama 1 menit dan Teknik perendaman stump ranting seperti
diikuti dengan pemindahan ke dalam ini banyak dilakukan dalam air pada posisi
larutan pemutih 10% dan 20% masing- tegak dengan tidak memberikan zat hara di
masing selama 10 menit, dan 0.1% HgCl2 dalamnya.
selama 5 menit, kemudian dibilas dengan
akuades steril sebanyak 5 kali. Meristem Dengan cara ini dihasilkan tunas muda
apikal diisolasi, kemudian eksplan ditanam yang cukup cepat dan dapat tersedia sebagai
sepanjang 0.5 cm dalam media inisiasi. sumber eksplan setelah minimal umur 2
Kultur akan diinkubasi dengan penyinaran minggu (Gambar 1).
1000 lux selama 16 jam/hari, dengan suhu
Inisiasi Kultur Meristem Pucuk Jeruk Gambar 2. Kultur jeruk keprok lokal Brastepu:
keprok Brastepu (a) Pertumbuhan kultur pada media
Pertumbuhan kultur jeruk manis lokal D1B1, dan (b) Embriosomatik yang
Brastepu setelah penanaman eksplan di diperbesar 40 kali.
dalam media kultur pada variasi konsentrasi
Tabel 1. Pertumbuhan dan karakteristik kultur meristem pucuk jeruk keprok Brastepu tahap inisiasi
di dalam media MS padat yang diperkaya auksin 2,4-D dan sitokinin BAP. Angka rataan
yang diikuti oleh huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada uji jarak
Duncan (P 0.05).
Keterangan: D0 = 2,4- dichlorophenoxyacetic acid atau 2,4-D 0,0 mg/l; D1 = 2,4 -D 0,5 mg/l;
D2 = 2,4-D 1,0 mg/l; B0 = Benzyl Amino Purin atau BAP 0,0 mg/l; B1 = BAP 0,5 mg/l; B2 = BAP
1,0 mg/l; B3 = BAP 1,5 mg/l.
Pertumbuhan kalus dalam medium yang sangat sedikit, tetapi tidak dapat langsung
mengandung zat pengatur tumbuh 2,4-D 0 menghasilkan tunas. Hasil ini menunjukkan
mg/l dan BAP 0.5 mg/l (kelompok D0B1) bahwa variasi zat pengatur tumbuh di dalam
memiliki pertumbuhan kalus sedikit, tetapi medium sangat berperan di dalam
beberapa kultur dapat juga langsung pertumbuhan dan perkembangan kalus, dan
menghasilkan tunas. Sedangkan medium juga di dalam inisiasi tunas. Kelompok
kultur yang mengandung 2,4-D 1,0 mg/l perlakuan yang mengandung zat pengatur
dan tidak ada BAP (kelompok D2B0) dapat tumbuh 2,4-D 0 mg/l dan BAP 0.5 mg/l
menghasilkan kalus dalam jumlah banyak, (kelompok D0B1) dapat dipergunakan
yaitu hampir menutupi semua permukaan secara efektif untuk menginisiasi tunas pada
eksplan. Induksi kalus dalam medium kultur tahap satu jeruk masis lokal
kultur kelompok perlakuan D2B0 sangat Brasitepu. Pertumbuhan dan perkembangan
baik, tetapi tidak dapat langsung kultur di dalam medium kultur tahap 1 pada
menghasilkan tunas. Medium kultur yang variasi kelompok perlakuan diamati untuk
mengandung 2,4-D 0,5 mg/l dan tidak ada melihat pertambahan berat kalus,
BAP (kelompok D1B0) dapat memacu embrtiosomatik, jumlah tunas dan
pertumbuhan kalus dan menghasilkan kalus karakteristik pertumbuhan eksplan di dalam
dalam jumlah sedang, akan tetapi kalus media.
tidak dapat langsung menghasilkan tunas. Pertumbuhan dan Perkembangan Kalus
Sedangkan medium kultur yang tidak Pada Kultur Brastepu
mengandung zat pengatur tumbuh Pertumbuhan dan perkembangan kalus
(kelompok D0B0) juga dapat menginisiasi di dalam medium kultur tahap 1 yang
kalus dan menghasilkan kalus dalam jumlah mengandung MS dan diperkaya dengan zat
pengatur tumbuh auksin 2,4-D dan sitokinin sebanyak 1,0 mg/L 2,4-D tanpa BAP pada
BAP pada variasi kelompok perlakuan kelompok D2B0 dihasilkan berat kalus
diamati untuk melihat pertambahan berat yang semakin menurun sebanyak 0,70 gram
kalus dan karakteristik pertumbuhan kalus. Dari karakteristik kalus yang
eksplan di dalam kultur seperti dirangkum berwarna putih krem dan bertekstur kasar
pada Tabel 1. Pengaruh penambahan zat juga sebagai pertanda bahwa auksin BAP
pengatur tumbuh sitokinin BAP terhadap hanya dapat menginisiasi kalus tanpa
pertumbuhan kalus di dalam media kultur menginisiasi pertambahan berat kalus yang
tahap pertama telah dilakukan dengan cara lebih tinggi.
perlakuan variasi sitokinin BAP tanpa Selanjutnya dilakukan pengamatan
kehadiran auksin 2,4-D dan diperoleh dengan melakukan kombinasi zat pengatur
karakteristik eksplan semuanya berwarna tumbuh auksin dan sitokinin agar diperoleh
hijau dan membesar sebelum terbentuk pola pertumbuhan dan perkembangan kalus
kalus. Dari hasil ini diketahui bahwa jeruk manis lokal Brastepu di dalam media
sitokinin BAP sangat berpengaruh terhadap kultur oleh pengaruh pemberian zat
petumbuhan kalus jeruk manis lokal pengatur tumbuh di dalam media padat
Brasitepu. Semakin tinggi konsentrasi yang mengandung MS. Perlakuan terhadap
sitokinin yang ditambahkan ke dalam media kultur jeruk yang diberikan auksin tanpa
kultur, maka semakin banyak jumlah kalus sitokinin BAP secara berturut-turut pada
yang dihasilkan. Secara berturut-turut pada penambahan sebanyak 0,5 mg/L 2,4-D dan
penambahan sebanyak 0,5 mg/L sitokinin variasi 0,5-1,5 mg/L BAP menghasilkan
tanpa auksin pada kelompok D0B1 karakteristik kalus semuanya berwarna
dihasilkan sebanyak 0,15 gram kalus, berat hijau muda dan bentuk kasar. Kalus ada
kalus semakin banyak pada penambahan yang bernodul dan ada juga yang tidak
sebanyak 1,0 mg/L BAP tanpa auksin pada bernodul, terutama pada pemberian
kelompok D0B2 dihasilkan sebanyak 0,21 sitokinin kadar rendah 0,5 mg/L BAP.
gram kalus, dan berat kalus tetap meningkat Pengaruh pemberian sitokinin pada
pada penambahan sebanyak 1,0 mg/L BAP konsentrasi auksin yang konstan (0,5 mg/L
tanpa auksin pada kelompok D0B3 2,4D) menunjukkan bahwa semakin tinggi
dihasilkan sebanyak 0,29 gram kalus. konsentrasi sitokinin yang ditambahkan ke
Pengamat lebih lanjut dilakukan untuk dalam medium padat yang mengandung MS
mengetahui pengaruh penambahan zat maka semakin berat kalus yang dihasilkan.
pengatur tumbuh 2,4-D terhadap Kelompok perlakuan yang diberikan auksin
pertumbuhan kalus di dalam media kultur yang konstan 0,5 mg/L 2,4-D dan 0,5 mg/L
tahap pertama telah dilakukan dengan cara BAP pada kelompok D1B1 diperoleh berat
perlakuan variasi 2,4-D tanpa kehadiran kalus 0,42 gram dengan karakteristik kalus
BAP dan diperoleh karakteristik eksplan hijau, kasar, dan bernodul. Penambahan
semuanya berwarna putih krem dan sitokinin menjadi 1,0 mg/L BAP dengan
bertekstur kasar. Dari pengamatan yang kadar auksin konstan 0,5 mg/L 2,4D pada
dilakukan diketahui bahwa penabahan kelompok D1B2 diperoleh berat kalus yang
auksin 2,4-D tidak berpengaruh terhadap semakin meningkat seberat 0,74 gram
petumbuhan kalus jeruk manis lokal dengan karakteristik kalus hijau, kasar dan
Brastepu. Kultur jeruk yang di berikan bernodul. Selanjutnya bila kadar sitokinin
auksin tanpa sitokinin BAP secara berturut- ditingkatkan menjadi 1,5 mg/L BAP pada
turut pada penambahan sebanyak 0,5 mg/L kondisi auksin konstan 0,5 mg/L 2,4-D
2,4-D tanpa BAP pada kelompok D1B0 (kelompok D1B3) diperoleh berat kalus
dihasilkan sebanyak 0,74 gram kalus, dan yang semakin meningkat 0,85 gram, dengan
selanjutnya meningkatkan kadar auksin karakteristik kalus hijau kasar dan
bernodul. Hasil ini menunjukkan bahwa Hasil ini menunjukkan bahwa kombinasi
sitokinin sangat berpengaruh terhadap auksin dan sitokinin yang tinggi sangat
pertambahan berat kalus dan juga mempengaruhi pertumbuhan dan
menentukan di dalam mempertahankan pertambahan berat kalus di dalam media
warna kalus tetap hijau. kultur padat yang mengandung media MS.
Pengamatan lebih lanjut dilakukan Semakin tinggi kadar auksin maka semakin
dengan meningkatkan kadar auksin menjadi banyak kelompok perlakuan yang
1,0 mg/L 2,4-D dengan variasi sitokinin menghasilkan kalus yang bernodul. Dengan
0,5-1,5 mg/L BAP diperoleh karakteristik demikian, di dalam kultur tahap pertama ini
kalus bervariasi, yaitu berwarna krem dan diketahui bahwa inisiasi kalus sangat
hijau, semuanya berbentuk kasar, dan ada dipengaruhi olah kehadiran dan konsentrasi
yang tidak bernodul dan ada juga yang zat pengatur tumbuh 2,4-D dan BAP.
bernodul. Kelompok perlakuan yang Analisis statistik menggunakan uji jarak
diberikan auksin yang konstan 1,0 mg/L Duncan (P 0.05) menunjukkan bahwa hasil
2,4-D dan 0,5 mg/L BAP pada kelompok rataan berat kalus tertinggi diperoleh pada
D2B1 diperoleh berat kalus 0,57 gram perlakuan D1B1, yaitu menggunakan
dengan karakteristik kalus berwarna krem, kombinasi 0,5 mg/L 2,4-D dengan 0,5 mg/L
berbentuk kasar, dan tidak bernodul. BAP, dengan berat kalus 1,83 gram, berarti
Eksplan yang ditumbuhkan pada media tidak berbeda nyata terhadap pertumbuhan
kultur dengan peningkatan kadar sitokinin dan perkembangan kalus jeruk keprok
1,0 mg/L BAP dan kondisi auksin konstan Brastepu.
1,0 mg/L 2,4-D pada kelompok D2B2 Analisis anatomi terhadap jaringan kalus
diperoleh berat kalus yang semakin yang bertumbuh di dalam medium kultur
meningkat seberat 1,34 gram dengan dilakukan dengan cara membuat awetan
karakteristik kalus berwarna krem, kalus dan membuat irisan untuk dilihat
berbentuk kasar, dan tidak bernodul. dibawah mikroskop cahayan biasa pada
Meningkatkan kadar sitokinin menjadi 1,5 perbesaran 40 kali. Dari hasil irisan kalus
mg/L BAP pada kondisi auksin konstan 1,0 dengan sel-sel parenkimatis dan
mg/L 2,4-D (kelompok D2B3) diperoleh embriosomatik stadium globular pada
berat kalus paling berat 1,52 gram, dengan permukaannya kalus yang ditunjukkan pada
karakteristik kalus berwarna hijau, Gambar 3. Gambar mikroskopi preparat seri
berbentuk kasar dan bernodul. kalus menunjukkan meristem calon tunas
permukaan kalus hanya menunjukkan sel
meristem (Gambar 3a dan 3b). Selanjutnya
terjadi differensiasi meristem membentuk
nodul calon tunas yang ditunjukkan dengan
tanda panah di dalam Gambar 3c dan 3d.
Tabel 2. Profil pita DNA menggunakan 10 Primer RAPD terhadap 20 sampel jeruk keprok
Brastepu hasil kultur embriogenesis tidak langsung.
Persentase
No Primer Jumlah Pita similatitas
similaritas
1 OPA-02 7 7 100,00
2 OPA-13 9 9 100,00
3 OPE-14 10 10 100,00
4 0PK-04 6 6 100,00
5 OPN-06 4 4 100,00
6 OPN-14 8 8 100,00
7 OPN-15 10 10 100,00
8 OPN-16 8 8 100,00
9 OPN-18 6 6 100,00
10 OPW-19 7 7 100,00
Pertumbuhan dan perkembangan sampel eksplan menghasilkan kalus hijau kasar dan
di dalam subkultur menunjukkan bahwa bernodul.
variasi sampel kultur memberikan
pertumbuhan dan perkembangan yang Isolasi DNA dan Analisis RAPD Kultur
bervarias dilihat dari pertambahan berat Jeruk Keprok Brastepu
kalus, jumlah embriosomatik, jumlah tunas Isolasi DNA dari hasil kultur jeruk
dan karakteristik pertumbuhan. keprok Brastepu menghasilkan DNA bersih
Karakteristik kultur bervariasi, yaitu ada dan dipergunakan untuk deteksi CVPD dan
perubahan eksplan menjadi sedikit berkalus RAPD. Hasil DNA jeruk keprok Brastepu
putih, eksplan hijau membesar, ada juga yang murni sehingga dapat dipergunakan
untuk PCR. Sampel DNA berjumlah 12
berasal dari kultur tanpa subkultur. Dengan regeneration from epicotyls explants of
demikian, ada sebanyak 120 kali loading ponkan mandarin (Citrus reticulata
dan profil pita DNA yang semuanya sama. Blanco). In Vitro Cellular and
Dari 10 marker yang dipergunakan dalam Developmental Biology 45(5): 559-564
analisis Random Amplified Polymorphic Barnicoat, H., Cripps, R., Kendon, J., dan
DNA (RAPD) terlihat bahwa banyak pita Sarasan, V., (2011), Conservation in
yang dihasilkan bervariasi. RAPD vitro of rare and threatened ferns—case
digunakan untuk mengevaluasi kesamaan studies of biodiversity hotspot and island
genetik dan 12 sampel kultur tersebut. species, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant
Marker yang digunakan sebanyak 10 47: 37–45.
marker RAPD. Dengan demikian rataan
nilai kesamaan dari 12 sampel adalah Krishnan, P.N., Decruse, S. W., dan Radha,
100%. Profil pita DNA yang disajikan pada R. K, (2011), Conservation of medicinal
Tabel 2. menggambarkan bahwa 12 DNA plants of Western Ghats, India and its
sampel yang diamati tidak menunjukkan sustainable utilization through in vitro
perbedaan genetik. technology, In Vitro Cell. Dev. Biol.
Plant 47: 110–122.
KESIMPULAN Bove, J., dan Morel, G., (1957), La culture
de tissus de citrus, Revue Gen. Bot. 64:
Tahap awal teknik in vitro jeruk keprok 1-6.
Brastepu telah dilakukan untuk
mendapatkan bibit jeruk Brastepu. Kultur Sen, S., dan Dhawan, V., (2010),
meristem pucuk (shoot tip) dan subkultur Development of highly efficient
jeruk keprok Brastepu dapat menghasilkan micropropagation method for the citrus
bakal tanaman baru yang siap rootstock swingle citrumelo (Poncirus
dikembangkan dalam proses aklimatisasi trifoliate (L.) Raf. X C. paradise
untuk menghasilkan tanaman bebas McFaden). International Journal of
penyakit CVPD. Isolasi DNA kultur jeruk Fruit Science 10: 65-78.
keprok Brasitepu telah diperoleh DNA Terol, J., Conesa, A., Colmenero, J.M.,
murni sehingga dapat dipergunakan untuk Cercos, M., Tadeo, F., Agustí, J., Alós,
analisis PCR tanpa memerlukan purifikasi
E., Andres, F., Soler, G., Brumos, J.,
lebih lanjut. Analisis RAPD terhadap profil
pita DNA menggambarkan bahwa 12 DNA Iglesias, D.J., Götz, S., Legaz, F.,
sampel yang diamati tidak menunjukkan Argout, X., Courtois, B., Ollitrault, P.,
perbedaan genetik, dan test konfirmasi PCR Dossat, C., Wincker, P., Morillon, R.,
menunjukkan bahwa semua kultur jeruk dan Talon, M., (2007), Analysis of
keprok hasil in vitro bebas dari CVPD. 13000 unique Citrus clusters associated
with fruit quality, production and salinity
DAFTAR PUSTAKA
tolerance, BMC Genomics. 8: 31-37.
R., Chanthuru, A dan Palanivel, S., (2011), Almeida, R.P.P., Nascimento, F.E., Chau,
In vitro regeneration and conservation of J., Prado, S.S., Tsai, CW, Lopes, S.A,
rare medicinal plant Dregea volubilis dan Joao Lopes, R.S., (2008), Genetic
Benth, Journal of Plant Sciences 6(6): Structure and Biology of Xylella
225-228.
fastidiosa Strains Causing Disease in
Zeng, L., Xu, H., Zeng, Y., dan Luan, A., Citrus and Coffee in Brazil , Appl
(2009), High efficiency in vitro plant Environ Microbiol. 74(12): 3690–3701.