FORM 2

Prosedur Penelitian
JUDUL KEGIATAN PENELITIAN
Kajian Kapasitas Antioksidan Terhadap DPPH
dan Kandungan Senyawa Fenolik Total Ekstrak
Alga Merah Jenis Eucheuma cottonii Dari
Perairan Sumenep.

Lokasi Penelitian : UIN Maulana Malik Ibrahim Malang

DAFTAR SEMUA BAHAN/ALAT YANG

DIPERLUKAN, TERMASUK BAHAN KIMIA,
ALAT PERLINDUNGAN DIRI, DLL
Bahan: Sampel alga merah (Eucheuma cottonii), Bahan kimia yang digunakan adalah
metanol, n-butanol, kloroform, etil asetat, n-heksan, petroleum eter, etanol 90 %, KMnO4
0,1 %, DPPH, BHT, asam askorbat, DMSO, HCl 2 N, H2SO4 pekat, asam galat, natrium
bikarbonat, Nitrogen cair, aquades, asam asetat anhidrat, kalium kromat 5 %, AgNO3 0,1
N, pereaksi Mayer dan Dragendorff, serbuk logam Mg, reagen Folin-Ciocalteu 50 %.
Alat: pisau, tabung reaksi, pipet tetes, pipet ukur 5 mL, pipet ukur 10 mL, pipet volume 5
mL, pengaduk kaca, kaca arloji, corong buchner, mortar, cawang, labu ukur 10 mL, buret,
erlenmeyer 250 mL, gelas ukur 100 mL, corong pisah, penjepit, bunsen spiritus, beaker
glass 100 mL, bola hisap, bejana pengembang, hot plate, shaker, vortex, neraca analitik,
seperangkat alat ekstraksi maserasi, botol larutan, oven, rotary evaporator, vaccum
desikator, spektroskopi UV-Vis Varian Carry.
Alat perlindungan diri: jas laboratorium, masker dan sarung tangan.

JELASKAN PROSEDUR/PROSES
PENELITIAN (STANDARD
OPERATIONAL PROCEDURE)
Penelitian ini akan dilaksakan pada bulan Juni – Juli 2012 di Laboratorium Organik dan
Laboratorium Bioteknologi UIN Maliki Malang.
Adapun tahapan penelitian yang akan dilakukan pada penelitian ini meliputi:

1. Preparasi sampel
Alga merah E. cottonii sebanyak 500 gram dicuci dengan air, kemudian dipotong kecil-
kecil, lalu dilayukan dengan menggunakan oven pada suhu 37 – 38 oC selama 24 jam,
dan dihaluskan menggunakan blender sampai menjadi serbuk, kemudian diayak dengan
ukuran 80 – 250. Hasil yang diperoleh kemudian ditimbang.

2. Analisis Kadar Air

Penentuan kadar air dilakukan dengan cara cawan porselen dipanaskan dalam oven pada
suhu 100 –105 ºC sekitar 15 menit untuk menghilangkan kadar airnya, kemudian cawan
porselen disimpan dalam vacum desikator sekitar 10 menit. Cawan tersebut selanjutnya
ditimbang dan dilakukan perlakuan yang sama sampai diperoleh berat cawan porselen
yang konstan. Kemudian sampel dimasukkan kedalam cawan dan dikeringkan
menggunakan oven pada suhu 100 – 105 ºC selama ±15 menit untuk menghilangkan
kadar air dalam sampel, kemudian sampel disimpan dalam vacum desikator sekitar ±10
 menit dan ditimbang. Sampel tersebut dipanaskan kembali dalam oven ±15 menit, lalu
disimpan dalam vacum desikator dan ditimbang kembali. Perlakuan ini diulangi sampai
berat konstan. Dihitung kadar air menggunakan rumus (AOAC, 1984):

(b−c)
Kadar air = x 100 % ..................................................................(3.1)
(b−a)
Keterangan :
a = berat konstan cawan kosong
b = berat cawan + sampel sebelum dikeringkan
c = berat konstan cawan + sampel setelah dikeringkan

100 %
Faktor koreksi = 100 %−kadar air ...........................................................(3.2)
% Kadar air terkoreksi = Kadar air – faktor koreksi.....................................(3.3)

3. Analisis Kadar Garam

Analisa kadar garam menggunakan metode Kohman. Sampel yang sudah dihaluskan
ditimbang sebanyak 5 gram, kemudian diekstrak menggunakan aquades 10 mL,
ditunggu sampai semua garam (NaCl) larut dan terpisah dengan lemak. Ekstraksi
diulang 10 kali. Cairan hasil ekstraksi ditampung dalam wadah kemudian diambil
sebanyak 5 mL lalau dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambah 3 mL kalium
kromat 5 % setelah itu dititrasi dengan AgNO3 0,1 N secara perlahan-lahan sampai
warna menjadi merah bata, titrasi diulang 3 kali. Perhitungan persentase NaCl
menggunakan persamaan (Sudarmadji, et al., 1997):

ml AgNO3 x N AgNO3 x 58,46

% NaCl = x 100 % ...........................................................(3.4)
gr bahan x 1000

4. Ekstraksi Sampel Alga Merah E. cottonii

Ekstraksi komponen senyawa aktif E. cottonii dilakukan dengan tiga tahap yaitu
ekstraksi maserasi yang kemudian dihidrolisis, setelah itu dipartisi. Langkah pertama,
rumput laut diekstraksi menggunakan ekstraksi maserasi atau perendaman. Sampel yang
telah dikeringkan ditimbang sebanyak 100 gram dan diekstraksi maserasi menggunakan
300 mL pelarut metanol selama 24 jam dan dilakukan pengocokan menggunakan shaker
dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya, ampas yang dihasilkan dimaserasi kembali
menggunakan pelarut yang sama sebanyak lima kali pengulangan dengan perlakuan
yang sama sampai filtrat yang didapatkan bening. Setelah itu dilakukan penyaringan
menggunakan vacum buchner, ketiga filtrat yang diperoleh digabung menjadi satu.
Ekstrak metanol yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator untuk
mendapatkan ekstrak kasar, setelah itu dialiri gas N2. Ekstrak kasar dimasukkan ke
dalam vacum desikator untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa. Ekstrak pekat
yang diperoleh ditimbang lalu dihitung rendemennya dengan menggunakan rumus
sebagai berikut (Khopkar, 2003):

Berat ekstrak
% Rendemen = x 100 % ................... ............................................(3.5)
Berat sampel

Ekstrak pekat metanol dibagi menjadi dua bagian, ekstrak yang pertama diuji kapasitas
antioksidan pada konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800, 1000 ppm, dan ekstrak pekat yang
kedua dihidrolisis dengan menambahkan 5 mL asam klorida (HCl) 2 N selama 1 jam
menggunakan magnetic stirrer hot plate pada suhu 40 oC lalu didinginkan. Hidrolisat
yang diperoleh ditambahkan dengan natrium bikarbonat sampai pH-nya netral, lalu 6
 gram hidrolisat dipartisi menggunakan pelarut kloroform, n-butanol, etil asetat,
petroleum eter dan n-heksan dengan perbandingan 1:1. Ekstrak hasil partisi dipekatkan
dengan rotary evaporator, ekstrak pekat yang diperoleh kemudian ditimbang dan
dihitung rendemennya. Selanjutnya ekstrak pekat yang diperoleh dari masing-masing
fraksi diuji kapasitas antioksidan pada konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800, dan 1000
ppm, untuk mengetahui ekstrak dari pelarut mana yang mengandung kapasitas
antioksidan tertinggi.

5. Uji Kapasitas Antioksidan Dengan Metode DPPH

a. Penentuan Penjang Gelombang Maksimum
Larutan DPPH 0,2 mM sebanyak 3 mL dilarutkan dengan etanol 95 % v/v. Didiamkan
± 10 menit. Dicari λmaks larutan dan dicatat hasil pengukuran λmaks untuk digunakan
pada tahap selanjutnya (Arindah, 2010).

b. Penentuan Waktu Kestabilan Pengukuran Antioksidan

Dibuat larutan ekstrak 200 ppm sebanyak 25 mL setiap pengukuran diambil sebanyak
2,25 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Ditambahkan 0,2 mM larutan
DPPH sebanyak 0,75 mL, setelah itu ditambahkan etanol 95 % v/v sampai tanda batas
dan dihomogenkan. Larutan yang diperoleh dipipet kedalam kuvet, kemudian dicari
waktu kestabilan dengan inkubasi dan tanpa inkubasi pada rentangan waktu 5 – 50
menit dengan interval 5 menit. Sampel diukur absorbansi pada λmaks yang telah
didapatkan pada tahap sebelumnya (Arindah, 2010).

c. Pengukuran Potensi Antioksidan pada Sampel

1. Absorbansi kontrol: Larutan DPPH 0,2 mM sebanyak 0,75 mL dimasukkan
kedalam labu takar 10 mL setelah itu ditambahkan etanol 95 % v/v sampai tanda
batas dan dihomogenkan. Larutan yang diperoleh, diinkubasi pada suhu 37 oC
selama waktu kestabilan yang telah didapatkan pada tahap sebelumnya, setelah itu
diukur absorbansinya dengan λmaks yang didapatkan.

2. Ekstrak kasar metanol dilarutkan dalam pelarutnya sebanyak 10 mL dengan

konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800, dan 1000 ppm. Kemudian tiap-tiap konsentrasi
diambil 2,25 mL dimasukkan kedalam labu takar 10 mL setelah itu ditambahkan
0,2 mM DPPH sebanyak 0,75 mL (perbandingan larutan DPPH : ekstrak 1:3)
setelah itu ditambahkan etanol 95 % v/v sampai tanda batas dan dihomogenkan.
Kemudian diinkubasi dengan suhu 37 oC pada waktu kestabilan yang didapatkan
pada tahap sebelumnya, kemudian dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur
absorbansinya pada λmaks. Tiap sampel dilakukan pengukuran tiga kali (triplo).
Data absorbansinya yang diperoleh dari tiap konsentrasi pada masing-masing
ekstrak dihitung nilai persen (%) kapasitas antioksidannya. Nilai tersebut
diperoleh dengan rumus (Arindah, 2010):
𝐴𝑜−𝐴𝑐
% Kapasitas antioksidan = 𝐴𝑜 x 100 %.....................................................(3.6)
Keterangan :
Ao= Absorbansi kontrol
Ac = Absorbansi sampel

3. Sampel ekstrak kloroform, n-butanol, etil asetat, petroleum eter dan n-heksan
dilarutkan dalam akuades sebanyak 10 mL kemudian ditambahkan 1 mL DMSO
30 % setelah itu dimasukkan kedalam labu takar 50 mL ditambahkan aquades
sampai tanda batas dan dihomogenkan. Larutan yang dibuat sesuai dengan
konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800, dan 1000 ppm. Kemudian tiap-tiap konsentrasi
 diambil 2,25 mL dan dimasukkan kedalam labu takar 10 mL. Setelah itu
ditambahkan 0,2 mM DPPH sebanyak 0,75 mL (perbandingan larutan DPPH :
ekstrak 1:3), ditambahkan etanol 95 % v/v sampai tanda batas dan dihomogenkan.
Kemudian diinkubasi dengan suhu 37 oC pada waktu kestabilan yang didapatkan
pada tahap sebelumnya, kemudian dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur
absorbansinya pada λmaks. Tiap sampel dilakukan pengukuran tiga kali (triplo).
Data absorbansinya yang diperoleh dari tiap konsentrasi pada masing-masing
ekstrak dihitung nilai persen (%) kapasitas antioksidannya. Nilai tersebut
diperoleh dengan rumus (Arindah, 2010):
𝐴𝑜−𝐴𝑐
% Kapasitas antioksidan = 𝐴𝑜 x 100 %.....................................................(3.7)
Keterangan :
Ao= Absorbansi kontrol
Ac = Absorbansi sampel

Setelah didapatkan persen (%) kapasitas antioksidanya, selanjutnya masing-masing

ekstrak dihitung nilai EC50 nya dengan menggunakan program “GraphPad prism5
software, Regression for analyzing dose-response data”.

4. Pembanding BHT dan asam askorbat (Vitamin C) diperlakukan seperti sampel

akan tetapi sampel diganti dengan larutan BHT dan asam askorbat (vitamin C)
yang dilarutkan dengan etanol, Apabila % kapasitas antioksidan sampel sama atau
mendekati nilai % kapasitas antioksidan pembanding maka dapat dikatakan bahwa
sampel berpotensi sebagai salah satu alternatif antioksidan.
Kapasitas antioksidan tertinggi dilakukan uji reagen untuk mengetahui golongan
senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak.

6. Uji Kandungan Senyawa Aktif dengan Uji Reagen

Ekstrak yang memiliki kandungan senyawa dengan kapasitas antioksidan tertinggi dari
uji antioksidan, diuji kandungan senyawa yang dominan menghasilkan antioksidan
terbesar, yaitu menggunakan uji reagen (uji fitokimia) dengan diketahuhi hasilnya
secara kualitatif. Uji reagennya diantaranya yaitu uji alkaloid, flavonoid,
triterpenoid/steroid dan Identifikasi Asam Askorbat (Indrayani, dkk., 2006).
1. Uji Alkaloid
Ekstrak rumput laut dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 0,5 mL
HCl 2 %, selanjutnya larutan dibagi dalam dua tabung. Tabung I ditambahkan 2 – 3
tetes reagen Dragendorff, tabung II ditambahkan 2 – 3 tetes reagen Mayer. Jika tabung I
terbentuk endapan jingga dan pada tabung II terbentuk endapan kekuning-kuningan,
menunjukkan adanya alkaloid (Indrayani, dkk., 2006).

2. Uji Flavonoid
Ekstrak kasar 5 mg ditambahkan dengan 1 – 2 mL air panas dan sedikit serbuk Mg.
Kemudian ditambahkan 4 – 5 tetes HCl 37 % dan etanol 95 % dengan volume yang
sama lalu dikocok. Jika menunjukkan warna merah atau jingga maka ekstrak kasar
positif mengandung flavonoid (Indrayani, dkk., 2006).

3. Uji Triterpenoid dan Steroid

Ekstrak rumput laut diambil 5 mg, dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian
dilarutkan dengan kloroform sebanyak 0,5 mL lalu ditambah dengan 0,5 mL asam asetat
anhidrat. Campuran ini selanjutnya ditambah dengan 1 – 2 mL H2SO4 pekat melalui
dinding tabung tersebut. Jika hasil yang diperoleh berupa cincin kecoklatan atau violet
pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan jika terbentuk
 warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid (Indrayani, dkk., 2006).

4. Identifikasi Asam Askorbat

Ekstrak kasar diambil 5 mg, dilarutkan dalam aquades 5 mL, kemudian ditambahkan 10
mL larutan KMnO4 0,1 %. Jika terbentuk warna cokelat maka menunjukkan adanya
asam askorbat (Indrayani, dkk., 2006).
Hasil dari uji reagen yang merupakan golongan senyawa dari ekstrak yang memilki
kapasitas antioksidan tertinggi dilakukan uji kadar fenolik total.

7. Pengukuran Kadar Fenolik Total

1. Pembuatan Larutan Standar Asam Galat
Larutan stok asam galat 1000 ppm dibuat dalam 10 mL aquades, kemudian untuk
mendapatkan larutan kerja dengan kadar 10 ppm, dipipet sebanyak 1 mL kedalam labu
takar 100 mL, ditambahkan aquades sampai tanda batas dan dihomogenkan. Selanjutnya
dibuat serangkaian larutan standar dengan konsentrasi 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 7,5
ppm asam galat sebanyak 10 mL.
Dari masing-masing konsentrasi dipipet 0,2 mL kedalam beaker gelas 50 mL.
Kemudian ditambahkan 0,8 mL reagen Folin-Ciocalteu 50 % lalu diaduk. Selanjutnya
larutan didiamkan selama 2 menit, ditambahkan 3 mL larutan Na2CO3 20 % dan diaduk,
lalu dimasukkan kedalam labu takar 10 mL, ditambahkan akuabides sampai tanda batas
dan dihomogenkan. Kemudian didiamkan selama 1 jam pada suhu kamar, lalu diukur
serapannya pada panjang gelombang 765 nm. Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi
hubungan antara konsentrasi asam galat (ppm) dengan nilai absorbansinya (Singleton
dan Rossi, 1965).

2. Pengukuran Absorbansi Ekstrak Sampel

Kandungan total fenol diukur dengan uji Folin-Ciocalteu menggunakan asam galat
sebagai standard. Sampel ekstrak yang memilki kapasitas antioksidan tertinggi dari
konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800, dan 1000 ppm, dilakukan uji fenolik total. Ekstrak
diambil 0,2 mL ditambahkan aquades 3 mL, kemudian ditambahkan 0,8 mL larutan
Folin-Ciocalteu 50 % dan 3 mL Na2CO3 20 %, divortex dan diinkubasikan selama 8
menit pada suhu kamar. Kemudian dimasukkan dalam labu takar 10 mL, ditambahkan
aquades sampai tanda batas dan dihomogenkan. Larutan didiamkan selama 2 jam pada
suhu ruang. Kemudian diukur serapanya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 765 nm yang akan memberikan komplek berwarna biru, kemudian
ditentukan kadar fenol dalam ppm, dimana kandungan total fenol dinyatakan dengan
asam galat ekuivalen (mg GAE/g sampel) (Singleton dan Rossi, 1965).

8. Analisis Data
Analisis data pada penelitian ini dilakukan dengan menghitung % kapasitas antioksidan
yang diperoleh dari data absorbansi dari masing-masing ekstrak kasar dan pembanding
asam askorbat (Vitamin C) dan BHT pada konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800, dan 1000
ppm. Setelah didapatkan data % kapasitas antioksidan pada masing-masing konsentrasi
sampel dan pembanding, kemudian dilakukan perhitungan nilai EC50 dengan
menggunakan persamaan regresi. Dibandingkan nilai EC50 pada masing-masing sampel.
Sampel yang mempunyai nilai EC50 terendah menunjukkan bahwa sampel tersebut
memiliki kemampuan sebagai antioksidan yang tinggi. Selanjutnya, membandingkan
nilai EC50 pada masing-masing sampel dengan pembanding untuk mengetahui
keefektifan antioksidan alami dengan antioksidan sintetik.
Sebelum melaksanakan penelitian ini, perlu mengetahui akan bahaya dan
penanganan bahan B3 yaitu dengan cara mengetahui MSDS dari setiap bahan yang
digunakan dalam penelitian ini. Jika listrik padam, maka semua kegiatan yang
membutuhkan aliran arus listrik dihentikan dan semua bahan disimpan pada tempat
yang aman. Limbah dari hasil penelitian ini dibuang pada pembuangan limbah
sementara yang telah disediakan di lab riset.