Método 1682: Salmonella en aguas residuales, lodos (Biosólidos) con el medio

Rappaport semisólido-Vassiliadis modificado (MSRV)

Julio de 2006

U.S. Environmental Protection Agency Office of Water (4303T) 1200 Pennsylvania Avenue, NW
Washington, DC 20460 EPA-821-R-06-14

Introducción

La aplicación de biosólidos tratados a la tierra puede ser útil como un nutriente de cultivo y
acondicionador del suelo, pero puede plantear el riesgo de liberar patógenos al medio ambiente si
no se cumplen los criterios de desinfección y uso adecuados.
Entre estos organismos se encuentran Salmonella, que son bacterias entéricas patógenas que
pueden causar salmonelosis en animales y humanos, si existen concentraciones capaces de dar
lugar a infecciones.
La densidad de Salmonella en biosólidos Clase A para uso no restringido debe ser menor a tres
número más probable (MPN) por cada cuatro gramos de sólidos totales (base de peso seco) en el
momento en que se usan los biosólidos.
El método 1682 es un método basado en el rendimiento para detectar Salmonella en biosólidos,
este requiere el cálculo de la MPN mediante enriquecimiento, con selección y confirmación
bioquímica de Salmonella. El paso de enriquecimiento utiliza caldo de soja tríptico (TSB). Después
de la incubación, el TSB se coloca sobre un medio semisólido selectivo de Rappaport-Vassiliadis
(MSRV), las colonias presuntamente identificadas se aíslan en agar xilosa-lisina desoxicolato (XLD),
y se realiza confirmación bioquímica que incluye agar de lisina-hierro (LIA), agar triples de hierro-
azúcar (TSI) y caldo de urea, seguido de serología tificandolos con antisueros O polivalentes. Los
cálculos de concentración se basan en el peso seco.

Método 1682: Salmonella en aguas residuales, lodos (Biosólidos) con el medio

Rappaport semisólido-Vassiliadis modificado (MSRV)
Julio de 2006

1. Alcance y aplicación

1.1 Este método es para la detección y enumeración de Salmonella (número de registro

CAS 68583-35-7) en biosólidos tratados por enriquecimiento, selección y
caracterización. Se pretende enumerar Salmonella para ayudar a determinar la
idoneidad de los biosólidos para la aplicación terrestre de acuerdo con el 40 Código de
Regulaciones Federales (CFR) Parte 503. Aunque el Método 1682 es similar a los
procedimientos reconocidos existentes que usan medios separados para el
enriquecimiento, selección y confirmación del organismo, está destinado a ser más
específico y tener una mayor recuperación.

1.2 Este método está diseñado para cumplir los requisitos de monitoreo para Salmonella
bajo 40 CFR Parte 503 Subparte D. La Subparte D de la Parte 503 define los requisitos
para que los biosólidos se clasifiquen como Clase A o B con respecto a los patógenos.
La clasificación de los biosólidos antes de la aplicación de la tierra proporciona un
medio para proteger la salud pública y el medio ambiente. Después del tratamiento
 apropiado, una muestra de biosólidos se clasifica como Clase A si las densidades de
Salmonella son inferiores a 3 MPN/4 gramos de sólidos totales (base de peso seco).

1.3 Aunque el reglamento de la Parte 503 no especifica el número total de muestras para
biosólidos Clase A, sugiere que un evento de muestreo se extienda por más de dos
semanas, y que al menos siete muestras sean evaluadas para confirmar que la
densidad bacteriana media de las muestras esté por debajo 3 MPN/4 g de sólidos
totales (base de peso seco). El análisis de siete muestras aumenta la precisión del
método al reducir el error estándar causado por variaciones inherentes en la calidad
del biosólido.

1.4 Aunque el Método 1682 es selectivo para la bacteria Salmonella, no diferencia entre
las especies de Salmonella.

Nota: Salmonella H2S negativa se perderá si las colonias de rosa a rojo translúcidas no son
sometido a confirmación bioquímica y serológica.

1.5 El método 1682 se sometió a validación entre laboratorios en matrices de biosólidos

de clase A. En el informe del estudio de validación (Referencia 18.2) se presenta una
evaluación exhaustiva de los resultados del estudio. Para la aplicación del método,
consulte el Título 40 del Código de Regulaciones Federales Parte 136 (40 CFR Parte
136).

1.6 Este método no está destinado para su uso en muestras de agua ni como prueba para
microorganismos distintos de Salmonella. El uso de este método y la validación
adecuada para matrices que no sean biosólidos Clase A es responsabilidad del usuario.

1.7 Cualquier modificación del método más allá de las expresamente permitidas está
sujeta a la aplicación y aprobación de procedimientos de prueba alternativos bajo 40
CFR Partes 136.4 y 136.5.

2. Resumen del método

2.1 El protocolo de medio semisólido Rappaport-Vassiliadis (MSRV) presentado en el

Método 1682 proporciona la enumeración de Salmonella en biosólidos según la técnica
del número más probable (MPN). La determinación de Salmonella implica la inoculación
del medio de enriquecimiento, caldo triptico de soja (TSB), con una cantidad medida de
muestra e incubar durante 24 horas. Después de la incubación, la TSB se coloca sobre el
medio MSRV selectivo. El medio MSRV usa novobiocina y verde de malaquita para inhibir
especies que no son de Salmonella, al tiempo que permite que la mayoría de las especies
de Salmonella crezcan. Las colonias presuntamente identificadas se aíslan en xilosa-lisina
desoxicolato agar (XLD) y se confirman usando agar de lisina-hierro (LIA), agar triples de
hierro azúcar (TSI) y caldo de urea, seguido de tipado serológico positivo usando
antisueros O polivalentes.

La determinación de sólidos totales (% de peso seco) se realiza en una muestra

representativa de biosólidos y se usa para calcular el peso seco de MPN / g. La densidad de
Salmonella se informa como MPN / 4 g de peso seco.
3. Definiciones

3.1 La Salmonella es una bacteria gramnegativa, predominantemente móvil,

facultativamente anaeróbica, con forma de bastón que comprende aproximadamente
2.000 serotipos.

3.2 Los biosólidos de Clase A son biosólidos que cumplen con los requisitos bacteriológicos
y de tratamiento estipulados en 40 CFR 503 Subparte D.

3.3 Las definiciones para otros términos se proporcionan en el glosario al final del método
(Sección 20.0).

4. Interferencias

4.1 Las estimaciones bajas de Salmonella pueden ser causadas por la presencia de un gran
número de organismos competidores o inhibidores, o sustancias tóxicas como metales o
compuestos orgánicos.

5. Seguridad

5.1 El analista debe conocer y observar los procedimientos de seguridad normales

requeridos en un laboratorio de microbiología mientras prepara, usa y desecha medios,
cultivos, reactivos y materiales, incluida la operación del equipo de esterilización.

5.2 El personal de campo y de laboratorio que recolecta y analiza muestras ambientales

está bajo cierto riesgo de exposición a microorganismos patógenos. El personal debe
aplicar los procedimientos de seguridad utilizados para los patógenos para manejar todas
las muestras.

5.3 Este método no aborda todos los problemas de seguridad asociados con su uso. Es la
responsabilidad del laboratorio establecer prácticas apropiadas de seguridad y salud antes
del uso de este método. Un archivo de referencia de las hojas de datos de seguridad del
material (MSDS) debe estar disponible para todo el personal involucrado en los análisis del
Método 1682.

5.4 Se prohíbe pipetear con la boca.

6. Equipo y suministros

6.1 Bolsas plásticas estériles, 1 galón

6.2 Frascos estériles de plástico o vidrio con tapas, 1-L
6.3 barrena estéril (batidora o licuadora)
6.4 cucharas estériles (no use cucharones curvos)
6.5 cava de hielo
6.6 Hielo mojado
6.7 Paquetes de hielo, hielo azul
6.8 Envoltura de burbujas
6.9 paletas estériles
6.10 papel aluminio estéril o papel kraft
6.11 Contenedor estéril, como un cubo de acero inoxidable o plástico adecuado para la
recolección de muestras
6.12 Pala plana
6.13 Tubos, 25 × 150 mm, vidrio de borosilicato, con aluminio flojo, acero inoxidable o
tapas autoclavables
6.14 Tubos, 16 × 100 mm, tapón de rosca, vidrio de borosilicato, con tapas de plástico
autoclavables
6.15 Gradilla para contener tubos de cultivo estériles
6.16 Contenedor de pipeta, acero inoxidable, aluminio o vidrio de borosilicato, para
pipetas de vidrio
6.17 Pipetas, estériles, T.D. bacteriológicas o Mohr, vidrio o plástico, punta ancha del
volumen apropiado
6.18 Propipeteador, o pipeteador automático
6.19 Asas de inoculación de alambre de platino, de al menos 3 mm de diámetro en
soportes adecuados; o plástico estéril
6.20 Palitos aplicadores estériles desechables
6.21 Mechero Bunsen o quemador de alcohol
6.22 jeringa Cornwall, estéril, para administrar al menos 5 ml
6.23 Bomba dispensadora de medios
6.24 Incubadoras, tipo microbiológico, con control de humedad y con camisa de aire o de
agua, para mantener las temperaturas a 36 ° C ± 1.5 ° C y 42 ° C ± 0.5 ° C
6.25 Placas de Petri estériles de plástico, calidad microbiológica, 15 mm × 100 mm
6.26 Portaobjetos de vidrio para la prueba de aglutinación
6.27 Erlenmeyer, 1-L y 2-L
6.28 Barra agitadora
6.29 Placa de revolver
6.30 Frascos y base de la licuadora estéril
6.31 Baño de agua mantenido a 50 ° C para atemperar agar
6.32 Equipo de filtración de medios, filtros de jeringa estériles de poro de 0.22 μm.
6.33 Estereomicroscopio
6.34 Guantes de látex para el manejo de muestras y equipos de extracción
6.35 medidor de pH
6.36 Mezclador Vortex
6.37 Micropipeta
6.38 Transferpipetas para administrar 30 μL
6.39 Autoclave
6.40 Horno de secado, mantenido a 103 ° C a 105 ° C para atemperar agar
6.41 vasos, vidrio o plástico, tamaños surtidos
6.42 Tejidos sin pelusa
6.43 Bandeja de acero con agua, 30 "x 26" x 10"
6.44 Autoclave o esterilizador de vapor capaz de alcanzar 121 ° C [15 lb de presión por
pulgada cuadrada (PSI)] durante 15 minutos
6.45 Plato de evaporación de crisol o aluminio
7. Reactivos y estándares

7.1 Pureza de los reactivos: los productos químicos de grado reactivo se deben usar en
todas las pruebas. A menos que se indique lo contrario, los reactivos deben cumplir con
las especificaciones del Comité de Reactivos Analíticos de la American Chemical Society
(Referencia 18.4). El agar usado para la preparación de medios de cultivo debe ser de
grado microbiológico.

7.2 Siempre que sea posible, utilice los medios de cultivo comerciales como medio de
control de calidad. Las temperaturas y tiempos de almacenamiento para los medios y
reactivos preparados se proporcionan en la Tabla 1 en la Sección 7.16 a continuación.

7.3 Pureza del agua de reactivo: agua de calidad reactiva conforme a las especificaciones
en los Métodos estándar para el examen de agua y aguas residuales (última edición
aprobada por la EPA en 40 CFR Parte 136 o 141, según corresponda), Sección 9020
(Referencia 18.1).

7.4 Agua de dilución tamponada con fosfato

7.4.1 Composición de la solución madre de tampón fosfato:

Fosfato monopotásico (KH2PO4)…………………………………………….34 g

Agua grado reactivo ………………………………………………………………..500 ml

Preparación: Disuelva KH2PO4 en 500 ml de agua grado reactivo. Ajuste el pH de la

solución a 7.2 con NaOH 1N y lleve el volumen a 1 L con agua grado reactivo.
Esterilizar por filtración o autoclave a 121 ° C (15 PSI) durante 15 minutos.

7.4.2 Preparación de la solución madre de cloruro de magnesio (MgCl2): Añadir

38g de MgCl2 anhidro o 81.1 g de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2 •
6H2O) a 1L de agua grado reactivo. Esterilizar por filtración o autoclave a 121 ° C
(15 PSI) durante 15 minutos.

7.4.3 Después de la esterilización, almacene las soluciones madre en el

refrigerador hasta que se usen. Si aparece evidencia de moho u otra
contaminación, se debe desechar la solución madre afectada y se debe preparar
una solución nueva.

7.4.4 Agua de dilución tamponada con fosfato de trabajo: mezcle 1,25 ml del
tampón de fosfato de reserva y 5 ml de la solución de MgCl2 por litro de agua
grado reactivo. Dispense en cantidades apropiadas para diluciones y/o para usar
como tampón de enjuague. Autoclave a 121 ° C (15 PSI) durante 15 minutos. El pH
final debe ser de 7.0 ± 0.2. La cantidad de tiempo en el autoclave debe ajustarse
para el volumen de la solución amortiguadora en los contenedores y el tamaño de
la carga.
Nota: Cuando se preparan bastidores de tubos de ensayo que contienen 9,0 ml de
agua de dilución estéril, se colocan en un recipiente apto para el autoclave con
 una pequeña cantidad de agua para contener la rotura y minimizar la evaporación
de los tubos.

7.5 Solución salina fisiológica estéril (0,85% p/v)

7.5.1 Disuelva 8,5 g de NaCl en 1 l de agua grado reactivo. Dispense 5-10 ml en

tubos de ensayo con tapa de rosca de 16 × 100 mm, tapón y autoclave durante 15
minutos a 121 ° C (15 PSI). Almacenar a temperatura ambiente.

7.6 Caldo de soja tríptico (TSB)

7.6.1 Composición:
Digestión pancreática de caseína…………………………………………………….. 17.0 g
Digestión enzimática de harina de soja……………………………………………. 3.0 g
Cloruro de sodio ………………………………………………………………………………..5.0 g
Fosfato dipotásico (K 2 HPO 4) …………………………………………………………..2.5 g
Dextrosa…………………………………………………………………………………………….2.5 g
Agua grado reactivo ………………………………………………………………………1.0 L

7.6.2 Para TSB de fuerza única (1X), agregue reactivos a 1 L de agua grado reactivo,
mezcle bien y caliente para disolver. Ajuste el pH a 7.3 ± 0.2 con ácido clorhídrico
1.0 N o hidróxido de sodio 1.0 N. Dispense volúmenes de 10 ml en tubos de cultivo
de 25×150 mm. El 1X TSB se usará para volúmenes de inoculación ≤1 mL.
Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C (15 PSI).

7.6.3 Para TSB de triple potencia (3X), prepare como en la Sección 7.6.2 pero use
333 mL de agua grado reactivo en lugar de 1 L. Distribuya volúmenes de 10 mL y 5
mL en tubos de cultivo de 25 × 150 mm. Los tubos 3X TSB que contienen 10 ml de
medio se inocularán con 20 ml de muestra homogeneizada. Los tubos 3X TSB que
contienen 5 ml de medio se inocularán con 10 ml de muestra homogeneizada.
Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C (15 PSI). Deje que los medios se calienten
a temperatura ambiente antes del análisis. Nota: 3X TSB es necesario para las
inoculaciones de 20 y 10 ml para garantizar que el volumen de inoculación no
diluya excesivamente el medio.

7.7 Medio Modificado Semisólido Rappaport-Vassiliadis (MSRV)

7.7.1 Composición del medio basal:

Triptosa……………………………………………………………………………………. 4.59 g
Hidrolizado de caseína (ácido)……………………………………………………4,59 g
Cloruro sódico…………………………………………………………………………...7,34 g
Fosfato de monopotasio (KH 2 PO 4) ………………………………………….1,47 g
Cloruro de magnesio, anhidro (MgCl 2) …………………………………….10.93 g
Oxalato verde de malaquita…………………………………………..0,037 g (37 mg)
Agar………………………………………………………………………………………………2.7 g
Agua grado reactivo ………………………………………………………………….1.0 L
 7.7.2 Solución madre de novobiocina (2%):
Novobiocina sódica………………………………………………………………………. 500 mg
Agua grado reactivo…………………………………………………………………… 25 ml

7.7.2.1 Disuelva 500 mg de novobiocina sódica en 25 ml de agua grado

reactivo y esterilice por filtración pasando la solución a través de un filtro
de tamaño de poro estéril de 0.22 μm en un recipiente estéril. Alícuota 1,1
ml de la solución madre en crioviales de 2,0 ml y congele a -20 ° C.

7.7.3 Agregue los reactivos para medio basal a 1L de agua grado reactivo, mezcle
bien y caliéntese hasta que hierva para que se disuelva por completo (no lo haga
en autoclave). Ajuste el pH a 5.2 ± 0.2 con ácido clorhídrico 1.0 N o 1.0 N de
hidróxido de sodio, frío a 50 ° C, y agregue 1.0 mL de una solución madre de
novobiocina al 2% por litro de medio. Mezcle bien girando el medio.
Inmediatamente verter aproximadamente 25 ml en placas de Petri de 15×100mm.
No invierta platos para almacenar.

Nota: Si usa un suplemento antimicrobiano de novobiocina preparado

comercialmente, agregue suficiente volumen para alcanzar una concentración de
0.002% por litro.

7.8 Agar Xylose-lisina desoxicolato (XLD)

7.8.1 Composición:
Extracto de levadura……………………………………………………………………………………… 3.0 g
L-lisina…………………………………………………………………………………………………………… 5.0 g
Xilosa…………………………………………………………………………………………………………….3.75 g
Lactosa………………………………………………………………………………………………………….. 7.5 g
Sacarosa………………………………………………………………………………………………………… 7.5 g
Desoxicolato de sodio……………………………………………………………………………………. 2.5 g
Citrato de amonio férrico………………………………………………………………………………. 0,8 g
Tiosulfato de sodio………………………………………………………………………………………… 6.8 g
Cloruro de sodio……………………………………………………………………………………………. 5.0 g
Agar…………………………………………………………………………………………………………….. 15.0 g
Rojo fenol……………………………………………………………………………………………………. 0.08 g
Agua grado reactivo……………………………………………………………………………………1.0 L

7.8.2 Agregue los reactivos a 1L de agua grado reactivo, mezcle bien y caliéntese
hasta que hierva para que se disuelva completamente, evite el
sobrecalentamiento (no use autoclave). Ajuste el pH a 7.4 ± 0.2 con ácido
clorhídrico 1.0N o hidróxido de sodio 1.0N. Enfriar a 45 °C - 50 °C e
inmediatamente verter aproximadamente 12 ml en placas petri estériles de 15 ×
100 mm. Deje que los medios se calienten a temperatura ambiente antes de la
inoculación.
Nota: calentar el medio a ebullición esteriliza el medio, el sobrecalentamiento o el
autoclave pueden causar precipitación.
7.9 Agar triple de hierro y azúcar (TSI)

7.9.1 Composición:
Extracto de carne de vacuno……………………………………………………………. 3.0 g
Extracto de levadura………………………………………………………………………… 3.0 g
Digestión pancreática de caseína……………………………………………………. 15.0 g
Peptona proteica n° 3………………………………………………………………………..5.0 g
Dextrosa…………………………………………………………………………………………… 1.0 g
Lactosa……………………………………………………………………………………………. 10.0 g
Sacarosa…………………………………………………………………………………………...10.0 g
Sulfato ferroso…………………………………………………………………………………… 0.2 g
Cloruro de sodio…………………………………………………………………………………. 5.0 g
Tiosulfato de sodio……………………………………………………………………………… 0.3 g
Agar………………………………………………………………………………………………….. 12.0 g
Rojo fenol……………………………………………………………………………………….. 0.024 g
Agua grado reactivo……………………………………………………………………….. 1.0 L

7.9.2 Agregue los reactivos a 1 L de agua grado reactivo, mezcle bien y caliente
para que se disuelva por completo. Ajuste el pH a 7.4 ± 0.2 con ácido clorhídrico
1.0 N o hidróxido de sodio 1.0 N. Distribuya alícuotas de 5-7 ml en tubos de
ensayo de tapa roscada de 16 × 100 mm, tapón y autoclave a 121 ° C (15 PSI)
durante 15 minutos. Permita que el medio se solidifique en un bastidor inclinado o
en un bastidor inclinado de tal manera que el área de la superficie se divida por
igual entre la inclinación y el extremo. Deje que los medios se calienten a
temperatura ambiente antes de la inoculación.

7.10 Agar hierro lisina (LIA)

7.10.1 Composición:
Peptona…………………………………………………………….……………………………………….. 5.0 g
Extracto de levadura…………………………………………………………….…………………….. 3.0 g
Dextrosa…………………………………………………………….……………………………………….. 1.0 g
L-lisina hidrocloruro……………………………………………….…………………………………… 10.0 g
Citrato de amonio férrico…………………………………………………………….………………… 0.5 g
Tiosulfato de sodio…………………………………………………………….………………………… 0.04 g
Purpura de bromcresol…………………………………………………………….………………… 0.02 g
Agar…………………………………………………………….………………………………………………. 15.0 g
Agua grado reactivo…………………………………………………………….……………………. 1.0 L

7.10.2 Agregue los reactivos a 1 L de agua grado reactivo, mezcle bien y caliente
para que se disuelva por completo. Ajuste el pH a 6.7 ± 0.2 con ácido clorhídrico
1.0 N o hidróxido de sodio 1.0 N. Distribuya alícuotas de 5-7 ml en tubos de
ensayo de tapa roscada de 16 × 100 mm, tapón y autoclave a 121 ° C (15 PSI)
durante 12 minutos. Permita que el medio se solidifique en un bastidor inclinado o
en un bastidor inclinado de tal manera que el área de la superficie se divida por
igual entre la inclinación y el extremo. Deje que los medios se calienten a
temperatura ambiente antes de la inoculación.
7.11 caldo de urea

7.11.1 Composición:
Extracto de levadura…………………………………………………………….………………………… 0.1 g
Fosfato de monopotasio (KH2PO4) …………………………………………………………….…… 9.1 g
Fosfato dipotásico (K2HPO4) …………………………………………………………….……………. 9.5 g
Urea…………………………………………………………….………………………………………………. 20.0 g
Rojo fenol…………………………………………………………….………………………………………. 0.01 g
Agua grado reactivo…………………………………………………………….……………………. 1.0 L

7.11.2 Agregue los reactivos a 1 L de agua grado reactivo, mezcle bien para que se
disuelva (no hierva ni esterilice en autoclave). Ajuste el pH a 6.8 ± 0.1 con ácido
clorhídrico 1.0 N o hidróxido de sodio 1.0 N. Filtrar la esterilización pasando la
solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm en un matraz estéril. Distribuir
asépticamente 3 ml en tubos de ensayo de tapa roscada de 16 × 100 mm estériles
con una pipeta estéril o una jeringa dispensadora estéril. Deje que los medios se
calienten a temperatura ambiente antes de la inoculación.

7.12 Agar infusión de corazón (HIA)

7.12.1 Composición:
Corazón de ternera, infusión de............................................. ............ …10.0 g
Bacto Triptosa................................................ ...................................... 10.0 g
Cloruro de sodio................................................ ..................................... 5.0 g
Agar Bacto................................................ ............................................ 15.0 g
Agua grado reactivo.............................................. ............................... 1.0 L

7.12.2 Agregue los reactivos a 1 L de agua grado reactivo, mezcle bien y caliente
para disolver. Ajuste el pH a 7.4 ± 0.2 con ácido clorhídrico 1.0 N o hidróxido de
sodio 1.0 N. Revuelva bien y esterilice en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
Vierta en placas Petri estériles de 15 × 100 mm. Deje que los medios se calienten a
temperatura ambiente antes de la inoculación. Se pueden usar otros medios de
crecimiento generales para propósitos de control de calidad (QA) (Sección 9.0).

7.13 Salmonella O antisuero Grupos polivalentes A-I y Vi

7.14 Controles positivos

7.14.1 Obtener un cultivo de reserva de Salmonella typhimurium ATCC # 14028

como control positivo para MSRV, XLD, TSI, LIA y antisuero O polivalente.

Nota: ATCC recomienda que no se realicen más de 5 transferencias antes de

volver al cultivo original. Esto minimizará las posibilidades de contaminación
durante las transferencias y el cambio genético de la cultura. Una sugerencia es
hacer su propio inventario de semillas congeladas al recibir el organismo que
puede usarse para futuros trabajos. Para obtener información adicional, vaya a
http://www.atcc.org.
 7.14.2 Obtener un cultivo de reserva de Proteus vulgaris ATCC # 13315 como
control positivo para la ureasa.

7.15 Controles negativos

7.15.1 Obtener un cultivo madre de Escherichia coli ATCC # 25922 como control
negativo para MSRV, XLD, TSI, LIA y antisuero O polivalente.

7.15.2 Obtener un cultivo de stock de Salmonella typhimurium ATCC # 14028

como control negativo para la ureasa.

7.16 Las temperaturas y tiempos de almacenamiento para los medios y reactivos

preparados se proporcionan en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1. Temperaturas de almacenamiento y tiempos para medios y reactivos

preparados
Almacenamiento de medios Temperatura Tiempo de almacenamiento
S fisiológico estéril (0,85% p/v)
Salino temperatura ambiente ≤3 meses
i Tubos sueltos
TSB: temperatura ambiente ≤ 2 semanas
MSRV: placas vertidas (no almacenar invertido) temperatura ambiente ≤ 48 horas
e
XLD: vertido placas (almacenar invertido) 1 °C a 5 °C ≤ 2 semanas
l
TSI, LIA, Urea caldo: tubos de tapa cerrada 1 °C a 5 °C ≤ 3 meses
HIA: placas vertidas (almacenar invertido) 1°Ca5°C ≤ 2 semanas
S
2% novobiocina -20 ° C a -10 ° C ≤ 1 año
i
Antisuero O polivalente 2 ° a 8 ° C liofilizado ≤ 3 años
S
Si el medio está refrigerado, retírelo del refrigerador 1-1.5 horas antes de la
inoculación para asegurar que alcanza la temperatura ambiente antes de utilizarlo

7.17 Milorganite® (CAS 8049-99-8) o equivalente

Milorganite® (biosólido Clase A secado al calor) es producido por el Distrito de

Alcantarillado Metropolitano de Milwaukee. Está disponible en muchos centros de
jardinería hogareña. Obtenga Milorganite® como la matriz de referencia para la
precisión inicial y la recuperación (IPR) y los análisis continuos de precisión y
recuperación (OPR). Milorganite® se utiliza como la matriz de referencia porque es
de fácil acceso, de bajo costo, generalmente no contiene el analito de interés y es
de calidad constante.

8.0 Recogida, manipulación y almacenamiento de muestras

8.1 La ubicación más adecuada para la recolección de muestras de biosólidos es el punto

previo a abandonar la planta de tratamiento de aguas residuales. Se pueden tomar
muestras de tuberías, cintas transportadoras, contenedores, pilas de compost, lechos de
secado y pilas de almacenamiento.
8.2 Recoja las muestras en recipientes de vidrio o plástico estériles y no tóxicos con tapas
a prueba de fugas. Todos los contenedores y equipos de muestreo deben estar limpios y
estériles.

8.3 Procedimiento de limpieza de equipo y contenedor

8.3.1 Lave el aparato de recolección de muestras con detergente y agua de

laboratorio.
8.3.2 Enjuague con agua del grifo
8.3.3 Enjuague con HCl al 10%
8.3.4 Enjuague con agua destilada
8.3.5 Dejar secar al aire.
8.3.6 Cubrir con papel aluminio y autoclave durante 15 minutos a 121 ° C (15 PSI).

8.4 Procedimiento de muestreo del digestor de biosólidos

8.4.1 Recoger la muestra del digestor de biosólidos de la tubería de descarga.

8.4.2 Purgue la tubería de descarga de los biosólidos viejos y caliente a la

temperatura del digestor permitiendo que los biosólidos fluyan a través de la
tubería a un contenedor o dispositivo de recolección de desechos.

8.4.3 Coloque una bolsa estéril de 1 galón debajo del flujo de modo que solo la
muestra toque el interior de la bolsa. Llene la bolsa, dejando 0.5 pulgadas de
espacio libre en la bolsa para la producción de gas. Dejar el espacio para la cabeza
es extremadamente importante cuando se toman muestras de biosólidos que han
sido digeridos anaeróbicamente.

8.5 Procedimiento para muestrear la salida de biosólidos de la cinta transportadora

8.5.1 Con una cuchara estéril, transfiera los biosólidos prensados directamente
desde el transportador a un recipiente estéril, sin mezclar ni transferir a otra área.

8.5.2 Embale la muestra en un recipiente estéril. Dejar espacio adicional en la

cabeza no es tan importante como en la Sección 8.4 porque hay menos formación
de gas.

8.6 Procedimiento para muestrear desde un contenedor, lecho de secado, plataforma de

camión o contenedor similar

8.6.1 Retire el material de la superficie (seis pulgadas superiores) y déjelo a un

lado. Divida el material subyacente que se muestreará en cuatro cuadrantes.

8.6.2 Use una cuchara o almacene la muestra con la barrena si el material es

profundo.

8.6.3 Tome una muestra de cada uno de los cuadrantes y combínelos en un

recipiente estéril.
 8.6.4 Después de que se hayan tomado todas las muestras, vierta el contenido del
envase sobre una superficie estéril y mezcle doblando la muestra sobre sí mismo
varias veces.

8.6.5 Reduzca el tamaño de la muestra "coning y quartering". Divida los

contenidos del contenedor en cuatro pilas pares. Si el tamaño de la muestra sigue
siendo demasiado grande, divida cada cuarto en cuartos y descarte la mitad. Poner
en un recipiente de muestreo de vidrio o plástico.

8.6.6 Un método alternativo para "coning y quartering" es tomar aleatoriamente

una pala plana llena de biosólidos del contenido del contenedor que se ha
colocado en una superficie estéril y colocar muestras en un contenedor de
muestreo. (Se ha demostrado que las bolas curvadas favorecen una partícula de
cierto tamaño y no deben usarse).

8.7 Registre lo siguiente en su libro de registro:

8.7.1 Nombre y ubicación de la instalación

8.7.2 Fecha
8.7.3 Hora de llegada
8.7.4 Nombre de la instalación y contacto

8.8 Registre lo siguiente en el contenedor de muestra y en el libro de registro cuando lo

sepa:

8.8.1 Número de muestra

8.8.2 Fecha y hora
8.8.3 Nombre de muestra
8.8.4 Ubicación de la muestra
8.8.5 Parámetros (por ejemplo, tipo de análisis, mediciones de campo - pH y
temperatura)
8.8.6 Volumen
8.8.7 Observaciones

8.9 Asegúrese de que el formulario de cadena de custodia esté completo.

8.10 Manipulación de la muestra: Mantenga muestras bacteriológicas a <10 ° C durante el

tránsito al laboratorio. No permita que la muestra se congele. Use contenedores aislados
para garantizar el mantenimiento adecuado de la temperatura de almacenamiento. Las
botellas de muestra deben colocarse dentro de bolsas impermeables, el exceso de aire
debe ser purgado y las bolsas selladas para garantizar que las botellas permanezcan secas
durante el tránsito o el almacenamiento. Refrigere las muestras al llegar al laboratorio y
analícelas tan pronto como sea posible después de la recolección. Lleve las muestras a
temperatura ambiente antes del análisis.

8.11 Limitaciones de tiempo y temperatura de mantenimiento: los análisis deben

comenzar inmediatamente, preferiblemente, dentro de las 2 horas de la recolección. Si es
 imposible examinar muestras en 2 horas, las muestras deben mantenerse a <10 ° C hasta
el análisis. Las muestras no deben estar congeladas. El análisis de muestras debe comenzar
dentro de las 6 horas a menos que se especifique lo contrario en el Código de
Regulaciones Federales, Parte 503. Nota: El cumplimiento de los procedimientos de
manejo de muestras y los límites de tiempo de mantenimiento es crítico para la
producción de datos válidos. Los resultados de la muestra se considerarán inválidos si no
se cumplen estas condiciones.

9.0 Control de calidad

9.1 Cada laboratorio que utiliza el Método 1682 debe operar un programa formal de
control de calidad (QA) que aborde y documente el mantenimiento de instrumentos y
equipos, la calidad y el rendimiento de los reactivos, la capacitación y certificación de
analistas y el almacenamiento y recuperación de registros. Los requisitos y
recomendaciones generales para los procedimientos de QA y control de calidad (QC) para
laboratorios microbiológicos se proporcionan en la Referencia 18.3.

9.2 Los requisitos analíticos mínimos de control de calidad para el análisis de muestras
utilizando el método 1682 incluyen una demostración inicial de la capacidad de
laboratorio mediante la realización de los análisis iniciales de precisión y recuperación
(sección 9.3), demostración continua de la capacidad de laboratorio mediante la precisión
y precisión continuas. Análisis de recuperación (OPR) (Sección 9.4) y análisis de matriz pico
(MS) (Sección 9.5), y el análisis de rutina de controles positivos y negativos (Sección 9.6),
métodos en blanco (Sección 9.7) y verificaciones de esterilidad en medios (Sección 9.8) .
Para los análisis de IPR, OPR y MS, es necesario disparar las muestras con suspensiones de
adición preparadas en laboratorio o BioBalls como se describe en la Sección 14.0.

9.3 Precisión y recuperación inicial (IPR): los análisis de IPR se utilizan para demostrar el
rendimiento aceptable del método (recuperación y precisión) y cada laboratorio debe
realizarlos antes de utilizar el método para monitorear las muestras de campo. La EPA
recomienda, pero no exige, que cada analista lleve a cabo un IPR. Las muestras de IPR
deben ir acompañadas de un método aceptable en blanco (Sección 9.7) y verificaciones
apropiadas de la esterilidad de los medios (Sección 9.8). Los análisis de IPR se realizan de la
siguiente manera:

9.3.1 Prepare cuatro muestras de 30 g de Milorganite® y espiga cada muestra con

Salmonella typhimurium ATCC # 14028 según el procedimiento de adición en la
Sección 14.0. El pinchazo con suspensiones preparadas en laboratorio se describe
en la Sección 14.3 y el pinchazo con BioBalls se describe en la Sección 14.6.
Procese y analice cada muestra de IPR de acuerdo con los procedimientos de las
Secciones 11 y 12 y calcule la Salmonella MPN / 4 g de peso seco de acuerdo con la
Sección 13.0.

9.3.2 Calcule el porcentaje de recuperación (R) para cada muestra de IPR

utilizando la ecuación apropiada en las Secciones 14.5 o 14.8 para espigas
preparadas en laboratorio y BioBall ™, respectivamente.
 9.3.3 Utilizando las recuperaciones porcentuales de los cuatro análisis, calcule el
porcentaje medio de recuperación y la desviación estándar relativa (DER) de las
recuperaciones. El RSD es la desviación estándar dividida por la media,
multiplicada por 100.

9.3.4 Compare la recuperación media y la DSR con los criterios correspondientes

de IPR en la Tabla 2. Si la media y la DSR para la recuperación de Salmonella
cumplen los criterios de aceptación, el rendimiento del sistema es aceptable y
puede comenzar el análisis de las muestras de campo. Si la recuperación media o
la RSD quedan fuera del rango requerido para la recuperación, el rendimiento del
sistema es inaceptable. En este caso, identifique el problema evaluando cada paso
del proceso analítico, medios, reactivos y controles, corrija el problema y repita el
análisis de IPR.

Tabla 2. Criterios de aceptación iniciales y continuos de precisión y recuperación

(IPR y OPR) Prueba de rendimiento
Criterios de aceptación Criterios de aceptación de cultivos
Prueba de rendimiento
de BioBall ™ preparados por el laboratorio
Precisión inicial y
recuperación (IPR)

•Media de recuperación
porcentual 22% - 126% 0% - 254%

•Precisión (como 69% 92%

desviación estándar
relativa máxima)
Precisión y recuperación
(OPR) como porcentaje 1% - 147% 0% - 287%
de recuperación

9.4 Continua precisión y recuperación (OPR): Para demostrar el control continuo del
sistema analítico, el laboratorio debe procesar y analizar rutinariamente muestras de
Milorganite® enriquecidas. El laboratorio debe analizar una muestra OPR después de cada
20 muestras de campo y pico de la matriz o una por semana que las muestras se analizan,
lo que ocurra con mayor frecuencia. Las muestras de OPR deben ir acompañadas de un
método aceptable en blanco (Sección 9.7) y verificaciones apropiadas de la esterilidad de
los medios (Sección 9.8). El análisis OPR se realiza de la siguiente manera:

9.4.1 Aplique una muestra de 30 g de Milorganite® con Salmonella typhimurium

ATCC # 14028 de acuerdo con el procedimiento de adición en la Sección 14.0. El
cultivo con suspensiones preparadas en laboratorio se describe en la Sección 14.3
y el cultivo con BioBalls se describe en la Sección 14.6. Procese y analice cada
muestra de OPR de acuerdo con los procedimientos de las Secciones 11.0 y 12.0 y
calcule el número de MPN de Salmonella / 4 g de peso seco según la Sección 13.0.
 9.4.2 Calcule el porcentaje de recuperación (R) para la muestra OPR utilizando la
ecuación apropiada en la Sección 14.5 o 14.8 para las muestras cargadas con
suspensiones de adición preparadas en laboratorio o BioBalls, respectivamente.

9.4.3 Compare el resultado OPR (recuperación porcentual) con los criterios de

recuperación de OPR correspondientes en la Tabla 2, arriba. Si el resultado de OPR
cumple con los criterios de aceptación para la recuperación, el rendimiento del
método es aceptable y el análisis de las muestras de campo puede continuar. Si el
resultado de OPR cae fuera de los criterios de aceptación, el rendimiento del
sistema es inaceptable. En este caso, identifique el problema evaluando cada paso
del proceso analítico (medios, reactivos y controles), corrija el problema y repita el
análisis OPR.

9.4.4 Como parte del programa de garantía de calidad del laboratorio, los
resultados de las muestras de OPR e IPR deben registrarse y actualizarse para
poder supervisar el funcionamiento continuo del método. El laboratorio también
debe desarrollar una declaración de precisión para el Método 1682 calculando el
porcentaje de recuperación promedio (R) y la desviación estándar del porcentaje
de recuperación (s r). Exprese la precisión como un intervalo de recuperación de R
- 2s r a R + 2s r.

9.5 Blanco de matriz (MS): se realizan análisis de MS para determinar el efecto de una
matriz particular en las recuperaciones de Salmonella. El laboratorio debe analizar una
muestra de EM cuando las muestras de biosólidos se reciben por primera vez de una
fuente de la que el laboratorio no ha analizado muestras previamente. Posteriormente, el
5% de las muestras de campo (1 por 20) de una fuente de biosólidos dada debería incluir
una muestra de MS. Las muestras de MS deben ir acompañadas del análisis de una
muestra de campo no administrado recolectada secuencialmente del mismo sitio de
muestreo, un método aceptable en blanco (Sección 9.7) y verificaciones apropiadas de la
esterilidad de los medios (Sección 9.8). Cuando sea posible, los análisis de EM también
deben ir acompañados de una muestra de OPR (Sección 9.4), utilizando el mismo
procedimiento de adición (suspensión de adición preparada en laboratorio o BioBalls). El
análisis de MS se realiza de la siguiente manera:

9.5.1 Prepare dos muestras de campo de 30 g que se recolectaron

secuencialmente del mismo sitio. Una muestra permanecerá sin ser analizada y se
analizará para determinar el fondo o la concentración ambiental de Salmonella
para calcular las recuperaciones de MS. La otra muestra servirá como la muestra
MS y será inyectada con Salmonella typhimurium ATCC # 14028 según el
procedimiento de adición en la Sección 14.0.

9.5.2 Seleccione diluciones basadas en resultados analíticos previos o niveles

anticipados de Salmonella en la muestra de campo para estimar con precisión la
densidad de Salmonella. Ni por encima ni por debajo del límite de detección del
método.

9.5.3 Haga una punción en la muestra de MS con una suspensión preparada en

laboratorio como se describe en la Sección 14.3 o con BioBalls como se describe en
 la Sección 14.6. Procese y analice las muestras de campo no enriquecido y
enriquecido de acuerdo con los procedimientos de las Secciones 11.0 y 12.0.

9.5.4 Para la muestra MS, calcule la MPN de Salmonella/4 g de peso seco de

acuerdo con la Sección 13.0 y ajuste la densidad (MPN/4 g de peso seco) en
función de la concentración ambiental de Salmonella observada en la muestra de
la matriz no enriquecida.

9.5.5 Calcule el porcentaje de recuperación (R) para la muestra MS (ajuste basado

en Salmonella ambiente en la muestra no filtrada) usando las ecuaciones
apropiadas Sección 14.5 o 14.8 para muestras cargadas con suspensiones de pico
preparadas en laboratorio o BioBalls, respectivamente.

9.5.6 Compare el resultado MS (recuperación porcentual) con los criterios de

rendimiento del método apropiado en la Tabla 3. Si la recuperación MS cumple los
criterios de aceptación, el rendimiento del sistema es aceptable y el análisis de las
muestras de campo de esta fuente de biosólidos puede continuar. Si la
recuperación de MS es inaceptable y el resultado de la muestra de OPR asociado
con este lote de muestras es aceptable, una interferencia de matriz puede estar
causando los malos resultados. Si la recuperación de MS es inaceptable, todos los
datos de campo asociados deberían estar marcados.

Tabla 3. Criterios de aceptación de precisión y recuperación en cultivos de matriz

Criterios de aceptación Criterios de aceptación de cultivos
Prueba de rendimiento
de BioBall ™ preparados por el laboratorio
Recuperación porcentual
para MS o MS / MSD 0% - 158% 0% - 246%
Precisión (como máxima
diferencia porcentual 177% 172%
relativa de MS / MSD)

9.5.7 Los laboratorios deben registrar y mantener un cuadro de control que

compare recuperaciones de MS para todas las matrices con resultados de
muestras OPR acumulativas y específicas analizadas utilizando el Método 1682.
Estas comparaciones deberían ayudar a los laboratorios a reconocer los efectos de
matriz en la recuperación de métodos y también pueden ayudar a reconocer
inconsistencias o efectos de matriz esporádica de una fuente particular.

9.6 Cultivos controles

9.6.1 Controles negativos: el laboratorio debe analizar los controles negativos para
garantizar que el MSRV, XLD, TSI, LIA, caldo de urea y antisuero O polivalente
funcionen correctamente. Los controles negativos deben analizarse siempre que
se use un nuevo lote de medio o reactivo. De manera continua, el laboratorio debe
realizar un control negativo cada día que se analicen las muestras. Los resultados
del control positivo y negativo se proporcionan en la Tabla 4.
 9.6.1.1 Los controles negativos se llevan a cabo inoculando MSRV, XLD, TSI,
LIA y antisuero O polivalente con un control negativo conocido (por
ejemplo, E. coli ATCC n. ° 25922) y analizando cómo se describe en la
Sección 12.

9.6.1.2 Los controles negativos se llevan a cabo inoculando caldo de urea

con un control negativo conocido (por ejemplo, Salmonella typhimurium
ATCC # 14028) y analizando como se describe en la Sección 12.0.

9.6.1.3 Si un control negativo no muestra la respuesta adecuada, verifique

y / o reemplace los medios o reactivos asociados, y / o el control negativo,
y vuelva a analizar el control negativo apropiado.

9.6.2 Controles positivos: el laboratorio debe analizar los controles positivos para
garantizar que el MSRV, XLD, TSI, LIA, caldo de urea y antisuero O polivalente
funcionen correctamente. Los controles positivos se deben analizar siempre que se
use un nuevo lote de medio o reactivo. De forma continua, el laboratorio debe
realizar un control positivo cada día que se analicen las muestras. Una muestra
OPR (Sección 9.4) puede tomar el lugar de un control positivo. Los resultados del
control positivo y negativo se proporcionan en la Tabla 4.

9.6.2.1 Los controles positivos se realizan inoculando MSRV, XLD, TSI, LIA y
antisuero O polivalente con un cultivo positivo conocido (por ejemplo,
Salmonella typhimurium ATCC # 14028) y analizando como se describe en
la Sección 12.0.

9.6.2.2 Los controles positivos se llevan a cabo inoculando caldo de urea

con un cultivo positivo conocido (por ejemplo, Proteus vulgaris ATCC #
13315) y analizando como se describe en la Sección 12.0.

9.6.2.3 Si el control positivo no muestra la respuesta adecuada, verifique y

/ o reemplace los medios o reactivos asociados, y / o el control positivo, y
vuelva a analizar el control positivo apropiado.

9.7 Método en blanco. Pruebe una muestra de agua de dilución estéril de 20 ml en el

esquema analítico para verificar la esterilidad del equipo, los materiales y los suministros.
La ausencia de crecimiento indica la libertad de contaminación del organismo objetivo. De
forma continua, el laboratorio debe realizar un método en blanco todos los días para
analizar las muestras.

9.8 Verificación de esterilidad de los medios. Para evaluar la esterilidad de los medios,
incube una porción representativa de cada lote a 36 ° C ± 1.5 ° C (TSB, XLD, TSI, LIA, HIA y
caldo de urea) o 42 ° C ± 0.5 ° C (MSRV) durante 24 ± 2 horas y observar para el
crecimiento. Un lote se define como un tubo / placa de 50 en cada lote, o un tubo / placa
si el lote contiene menos de 50 tubos / placa
 Tabla 4. Resultados de los controles positivo y negativo

Medio Resultado de Reacción positiva Reacción Negativa

Salmonella Método 1682 Método 1682
Caldo de soja Positivo Turbiedad Sin turbidez
tríptico (TSB)
Medio Semisólido Positivo Las células migradas El medio permanece
Rappaport- se ven como una azul-verde
Vassiliadis zona turbia blanco- alrededor de las
Modificado (MSRV) grisácea (halo) que inoculaciones sin
se extiende desde zona turbia gris-
las inoculaciones blanca (halo) (E. coli
tiene marcada
inhibición)
Agar Xylosa lisina Positivo Colonias rosadas a Otros colores con o
desoxicolato (XLD) rojas con centros sin centros negros
negros (ej.E .coli es amarillo
sin centro negro)
Triple sugar iron Positivo crecimiento con Otras
agar (TSI) inclinación alcalina combinaciones de
(rojo) con tope color ( ej., E. coli es
ácido (amarillo) con amarillo inclinado y
o sin producción de trasero)
H2S (que puede dar
como resultado un
extremo negro)
Lisina hierro agar Positivo Inclinación alcalina Otras
(LIA) (violeta) con punta combinaciones de
alcalina (púrpura) color (por ejemplo,
con o sin producción E. coli es de color
de H2S (que puede rojo a rojo / púrpura
dar como resultado inclinado y a tope
un coágulo negro) sin producción de
aglutinación H2S )
Caldo de Urea Positivo Rosa Sin cambio de color
(Salmonella es
ureasa negativa)
Polivalente O Negativo Aglutinación Sin aglutinación
positiva

10.0 Calibración y estandarización de equipos

10.1 Verifique las temperaturas en incubadoras/baños de agua dos veces al día,

con un mínimo de cuatro horas de diferencia, para asegurar que la operación se
encuentre dentro de los límites establecidos del método y registre las mediciones
diarias en el libro de registro de la incubadora.

10.2 Verifique las temperaturas en los refrigeradores/congeladores al menos una

vez al día para asegurar que la operación esté dentro de los límites establecidos
del método. Registre las mediciones diarias en el libro de registro del
refrigerador/congelador.
 10.3 Calibre termómetros e incubadoras semestralmente contra un termómetro
certificado por NIST o uno que cumpla con los requisitos de la monografía NIST SP
250-23 (Referencia 18.1). Verifique las columnas de mercurio para los descansos.

10.4 Calibre el medidor de pH antes de cada uso con dos estándares (pH 4.0, 7.0 y
10.0) más cercanos al rango que se está probando.

10.5 Calibre los balanzas de carga superior una vez al mes con pesos de referencia
de la Clase ASTM.

11.0 Preparación de la muestra

11.1 Homogeneización Los procedimientos de homogeneización de la muestra se

basan en si la muestra es líquida o sólida. Si la muestra es alcalina estabilizada
(líquida o sólida), ajuste el pH como se describe en la Sección 11.1.3. Las muestras
líquidas generalmente se definen como muestras que contienen # 7% de sólidos
totales (peso seco).

11.1.1 Muestras líquidas: homogeneice 300 ml de muestra en una licuadora estéril

a alta velocidad durante uno o dos minutos. Ajuste el pH a 7.0-7.5 agregando ácido
clorhídrico 1.0 N o hidróxido de sodio 1.0 N, si es necesario. Esta es la muestra
"homogeneizada". Al ajustar el pH, no exceda el volumen de la muestra
homogeneizada en más del 5% (15 ml).

11.1.2 Muestras sólidas: pesa 30.0 g ± 0.1 g de muestra bien mezclada en un plato
estéril. Siempre que sea posible, la muestra analizada debe contener todos los
materiales que se incluirán en el biosólido. Por ejemplo, si las astillas de madera
son parte del compost de biosólidos, puede ser necesario mezclarlas o molerlas
para lograr homogeneidad antes de realizar las pruebas. Las piezas grandes de
madera que no se muelen fácilmente pueden desecharse antes de
homogeneizarlas. Transfiera la muestra a una licuadora estéril. Use 270 ml de agua
de dilución tamponada estéril (Sección 7.4) para enjuagar cualquier muestra
restante en la licuadora. Alternativamente, la muestra puede pesarse
directamente en el recipiente de la licuadora estéril. Cubra y mezcle a alta
velocidad de uno a dos minutos. Esta es la muestra "homogeneizada". Un volumen
de 10 ml de la muestra "homogeneizada" contiene 1,0 g de la muestra original.
Ajuste el pH a 7.0-7.5 agregando ácido clorhídrico 1.0 N o hidróxido de sodio 1.0 N,
si es necesario. Al ajustar el pH, no exceda el volumen de la muestra
homogeneizada en más del 5% (15 ml).

Nota: No suspenda las bacterias en agua de dilución durante más de 30 minutos a

temperatura ambiente. Enfríe sobre hielo húmedo o a 4 ° C ± 1 ° C para ralentizar
la replicación entre las muestras de adición.

11.1.3 Estabilizado alcalinamente: las muestras de biosólidos estabilizadas

alcalinamente tienen generalmente un pH de aproximadamente 12. Antes del
análisis, la muestra de biosólido estabilizado alcalina debe neutralizarse a un pH de
aproximadamente 7,5. No agregue púas o BioBalls preparados en laboratorio a las
muestras antes del ajuste del pH.

11.1.3.1 El ajuste del pH debe realizarse en una campana extractora. Antes de

ajustar el pH de la muestra, calibre / estandarice el pHmetro con los tampones de
pH 7.0 y 10.0. Pesar 30 g de muestra en un vaso de precipitados estéril de 600 ml,
agregar 250 ml de agua de dilución tamponada estéril y una barra de agitación
magnética estéril. Coloque el vaso de precipitados en un plato mezclador, inserte
la sonda de pH en la mezcla, comience a remover y tome una lectura inicial de pH.
Para minimizar la cantidad de volumen agregado a cada muestra, el pH debe
ajustarse usando 10 N HCl. Nota: La adición de 10 N HCl producirá humos, no se
alarme. La adición del ácido se debe hacer de forma incremental para garantizar
que el pH no baje instantáneamente por debajo de 5,0. Se recomienda que el
ajuste del pH se complete dentro de 10-15 minutos y se monitoree durante 15
minutos adicionales para garantizar que la muestra