Mecanismos de nivel atómico para la regulación de

fosfolambán de la bomba de calcio

L. Michel Espinoza-Fonseca , 1, * Joseph M. Autry , 1 G. Lizbeth Ramírez-Salinas , 2 y David D. Thomas 1

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Abstracto
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Introducción
La bomba de calcio (retículo sarcoplásmico Ca2 + -ATPasa (SERCA)), un miembro de la
familia P-tipo ATPasa, es una proteína de membrana integral que es responsable del
transporte activo de Ca2 + del citosol al retículo sarcoplásmico ( SR) lumen de las células
cardíacas y musculares ( 1 ). La relajación se produce cuando SERCA bombea dos iones
de Ca2 + hacia la luz SR usando la energía derivada de la hidrólisis de una molécula de ATP
y el contratransporte de dos protones ( 2,3 ). Las isoformas SERCA estrechamente
relacionadas también son responsables de bombear Ca 2+ en el retículo endoplásmico de
prácticamente todas las células que no son de músculo, potenciando una gran cantidad
de procesos de activación celular dependientes de Ca 2+ .
En el músculo cardíaco, la actividad de SERCA está regulada por el fosfolamban (PLB),
una pequeña proteína de membrana que inhibe a SERCA al disminuir su aparente afinidad
por Ca 2+ ( 4,5 ). La inhibición de SERCA se alivia fisiológicamente a niveles elevados de
Ca 2+ ( 6 ) o por fosforilación de PLB en S16 por la proteína quinasa A (PKA) ( 7 ),
invirtiendo la inhibición del transporte de calcio y aumentando en gran medida el gasto
cardíaco ( 8 ). Los intentos iniciales para modular la interacción SERCA-PLB dieron como
resultado una mejor función cardíaca en modelos animales con insuficiencia cardíaca ( 9-
13) Se necesita una comprensión más profunda de la base estructural de la regulación
SERCA por PLB para mejorar el diseño de terapias génicas y de moléculas pequeñas para
el tratamiento de la insuficiencia cardíaca humana.
La espectroscopía de alta resolución, la reticulación química modificada y la extensa
mutagénesis dirigida al sitio han demostrado que el dominio transmembrana (TM) de PLB
se une a un gran surco formado alrededor de TM helices TM2, TM4, TM6 y TM9 de
SERCA ( 14- 20 ). La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y los
estudios de espectroscopía de RMN han demostrado que en el complejo unido, el dominio
citosólico de PLB experimenta de forma nativa un equilibrio dinámico entre estados
estructurales inhibidores (T) y no inhibidores (R), y que un cambio entre estos estados es
esencial para la regulación de la actividad de SERCA ( 21-24) Aunque el equilibrio
estructural de PLB es fundamental para la regulación SERCA, los mecanismos atomísticos
mediante los cuales el estado T inhibe SERCA y el estado R inducido por fosforilación
alivia la inhibición siguen siendo desconocidos. Akin et al. ( 25,26 ) informaron
recientemente una estructura cristalina de 0,28 nm de resolución de SERCA1a unida a la
ganancia de función, PLB4 PLB mutante reticulable (N27A, N30C, L37A y V49G-PLB)
( 25 ) y en el ausencia de Ca 2+ ( 26 ). Aunque a la estructura cristalina le falta el segmento
citosólico regulador de PLB (residuos M1-Q23), se obtuvieron datos importantes sobre la
base estructural de inhibición de SERCA por el dominio TM de PLB ( 27) Por ejemplo, la
estructura cristalina también reveló que la unión de PLB4 altera la estructura de SERCA
alrededor de los residuos V795-A804, dando como resultado un sitio I de unión
de Ca2 + colapsado . En base a estas observaciones, se propuso que PLB inhibe SERCA
llenando un estado E2 eso es incompatible con la unión de iones metálicos ( 26 ).
Los investigadores han asumido tradicionalmente que PLB estabiliza SERCA en E2, como
lo sugieren la cinética, la reticulación y la coinmunoprecipitación. Sin embargo, la
suposición de que la unión de PLB4 estabiliza a SERCA en un estado E2 es problemática
por tres razones. 1) La estructura de SERCA en el complejo PLB es notablemente similar a
la estructura de SERCA unida a sarcolipina, que se asignó como un estado intermedio E1
debido a la estructura de la cabeza y la unión de Mg 2+ a los sitios de transporte ( 28,29 ). 2)
El residuo de activación E309 apunta a los residuos V304 y A305, lo que permite que los
sitios de transporte se expongan al citosol, una característica que es característica de E1,
pero no de E2 ( 30, 31 ). 3) Los estudios experimentales han demostrado que la unión de
PLB disminuye la aparente afinidad de SERCA por Ca2+ por 2 a 3 veces en el rango
submicromolar ( 32 ). Esta disminución moderada en la afinidad aparente de Ca 2+ es
incompatible con el estado de la bomba E2 milimolar-Ca 2+ de la bomba ( 33).
Se han propuesto dos modelos para describir el mecanismo físico de la regulación de PLB:
el modelo de disociación y el modelo de subunidad. De acuerdo con el modelo de
disociación, PLB se disocia de SERCA para aliviar la inhibición, mientras que en el modelo
de subunidad, la inhibición de SERCA se alivia mediante reordenamientos estructurales
dentro del complejo SERCA-PLB, no mediante disociación. Las mediciones
espectroscópicas obtenidas con sondas fluorescentes y paramagnéticas han permitido la
detección directa de la interacción SERCA-PLB en células vivas, membranas de retículo
endoplásmico y vesículas reconstituidas, apoyando el modelo de subunidad, con una
compleja redisposición compleja en la fosforilación alta de Ca 2+ o PLB ( 34). -36) Los
estudios de entrecruzamiento se han interpretado como compatibles con el modelo de
disociación, pero también son consistentes con una reorganización estructural del complejo
inhibidor ( 15,17 ). Sigue habiendo preguntas importantes con respecto a la naturaleza de
las interacciones inhibidoras entre SERCA y PLB: ¿Se resuelve el SERCA unido a PLB en
la estructura cristalina representa un estado E1 o E2 de la bomba? Cómo la unión de PLB
inhibe el Ca 2+vinculante en los sitios de transporte? ¿Qué paso (s) a lo largo del ciclo
catalítico de la bomba es inhibido por PLB? Para abordar estas cuestiones, utilizamos la
estructura cristalina de SERCA-PLB4 para obtener una estructura de longitud completa de
SERCA unido a la conformación de estado T inhibitorio de PLB de tipo salvaje (WT), es
decir, con la hélice citosólica de PLB perpendicular a la bicapa lipídica normal. Utilizamos
este modelo para realizar tres simulaciones MD independientes del complejo a 1 μs en
ausencia de Ca 2+ y en una solución que contiene concentraciones fisiológicamente
apropiadas de otros iones (100 mM K + , 3 mM Mg 2+ y 110 mM Cl -) Finalmente,
determinamos las características estructurales de SERCA unido a PLB comparando las
trayectorias del complejo con las de los estados E1 y E2 de la bomba.
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Materiales y métodos

Cálculos de proteína pKa

Usamos PROPKA 3.1 ( 37-40 ) para calcular los valores de pKa de residuos ácidos en los
sitios de transporte de SERCA. PROPKA estima los valores pKa empíricos de grupos
ionizables en proteínas y complejos proteína-ligando basados en la estructura 3D, y se
beneficia al incorporar explícitamente las interacciones Coulombic que surgen de los
residuos que se titulan mutuamente a través del procedimiento Tanford-Roxby
( 41 ). PROPKA se ha usado previamente para determinar los estados de protonación de
residuos ácidos en otras ATPasas de tipo P, por ejemplo, Na + -K + ATPasa
( 42,43 ). Calculamos los valores de pKa en el estado E1 usando ocho estructuras cristalinas
recuperadas del Protein Data Bank
(PDB): 1SU4 , 1VFp, 3W5A , 3W5B , 3AR2 , 1T5S , 4H1W y 3N8G . También realizamos
cálculos de pKa en siete estructuras cristalinas del estado
E2: 1IWO , 2AGV , 2EAR , 2EAT , 2C8K , 3W5C y 2EAU . Además, utilizamos la
estructura cristalina de SERCA-PLB (PDB: 4KYT ) para estimar los valores de pKa de los
residuos ácidos en el complejo. Una lista de los ligandos y el estado bioquímico
representado por cada estructura cristalina se puede encontrar en la Tabla S1 en el Material
de soporte..

Modelado del complejo SERCA-PLB de longitud completa

El modelo atómico inicial de WT PLB unido a SERCA se construyó usando la estructura
cristalina de SERCA-PLB4 como molde ( 26 ). Aquí, modelamos el complejo en dos
etapas: primero, reconstruimos cuatro bucles de SERCA que no se resolvieron en la
estructura cristalina del complejo: E45-S48, E79-T86, A241-D245 y N280-I289. La
reconstrucción de bucle se realizó con MODELER ( 44 ). Usamos la estructura cristalina de
E1⋅Mg 2+ recombinante ( 29) como una plantilla para reconstruir los bucles faltantes de
SERCA unida a PLB4, porque la estructura del dominio TM es virtualmente idéntica entre
las dos estructuras (raíz media desviación cuadrada (RMSD) = 0.1 nm) y porque la
alineación TM con E2 era especialmente pobres en las regiones donde faltan los bucles en
la estructura cristalina de SERCA-PLB ( Fig. S1 ). Segundo, modelamos la estructura del
dominio TM de PLB de conejo usando las coordenadas del perro PLB4 unido a
SERCA. Solo los residuos A27, C30, A37 y G49 de PLB4 se cambiaron a N27, N30, L37 y
V49 para coincidir con la secuencia de PLB de conejo ( figura S2 ). Construimos la
estructura del dominio citosólico de PLB usando el modelo 14 del conjunto de RMN del
mutante AFA-PLB de conejo (PDB: 2KB7 ) ( 45) Los detalles sobre la selección de la
estructura de PLB más adecuada y el modelado de PLB de longitud completa se
proporcionan en Materiales y métodos de soporte .

Configuración de SERCA-PLB para simulación

Ajustamos los estados de ionización de los residuos ácidos de los sitios de unión de
Ca2 + para que coincidan con los resultados de nuestros cálculos de pKa. Por lo tanto, los
residuos E309 y D800 se mantuvieron ionizados, mientras que los residuos E771 y E908 se
modelaron como protonados. Además, ajustamos el pKa de otros residuos ionizables a un
valor de pH de ~7.2. El complejo se insertó en una bicapa pre-equilibrada de 12 × 12 nm de
palmitoil-2- oleoil- sn -glicerol-fosfatidilcolina (POPC). Este sistema inicial se solvó
usando moléculas de agua TIP3P con un margen mínimo de 1,5 nm entre la proteína y los
bordes de la caja periódica en el eje z . K + , Mg 2+ y Cl -se añadieron iones para producir
concentraciones de 100 mM, 3 mM y 110 mM, respectivamente. El tamaño de cada sistema
de proteína / lípido / agua / iones fue de ~220,000 átomos. Las topologías y parámetros de
campo de fuerza CHARMM36 se usaron para la proteína ( 80 ), lípido ( 81 ), agua, K + y
Cl - . Además, utilizamos un conjunto de nuevos parámetros CHARMM para
Mg 2+ desarrollado por Allnér et al. ( 82 ) Este nuevo conjunto de parámetros para Mg2 + se
eligió para corregir la tasa de intercambio de agua de Mg2 + , ya que los parámetros previos
no capturan correctamente la cinética de intercambio de agua entre la primera coraza de
coordinación y el agua a granel ( 82 ).

Configurando E2 SERCA para simulación

Usamos tres estructuras cristalinas (PDB 1IWO ( 48 ), 2AGV ( 49 ) y 3W5C ( 29 )) para
simular la dinámica estructural de E2 SERCA. Los residuos E309, E771 y E908 se
modelaron como protonados, mientras que D800 se dejó desprotonado. Ajustamos el pH
del sistema a un valor de 7.2 ajustando los estados de ionización de la cadena lateral usando
PROPKA ( 39 ). Cada sistema de proteína se insertó en una bicapa de POPC preequilibrada
de 12 x 12 nm. Este sistema inicial se solvó usando moléculas de agua TIP3P con un
margen mínimo de 1,5 nm entre la proteína y los bordes de la caja periódica en
el eje z . Finalmente, K + , Mg2+ , y los iones Cl - se agregaron en las mismas
concentraciones usadas para los sistemas SERCA-PLB. El tamaño de cada sistema de
proteína / lípido / agua / iones fue de ~220,000 átomos. Las topologías y parámetros de
campo de fuerza CHARMM36 con corrección CMAP ( 80,81 ) se usaron para la proteína,
los lípidos, el agua y los iones.

Simulaciones de dinámica molecular

Realizamos simulaciones de dinámica molecular (MD) de SERCA-PLB y E2 SERCA
utilizando el programa NAMD 2.9 ( 52 ) con condiciones de contorno periódicas ( 53 ),
malla de partículas Ewald ( 54,55 ), un corte no unido de 0,9 nm y un 2 fs paso del
tiempo El conjunto NPT se mantuvo con un termostato Langevin (310 K) y un barostato de
pistón Langevin anisotrópico (1 atm). Los sistemas completamente solvatados se
sometieron primero a la minimización de la energía, y los sistemas se calentaron
gradualmente por 200 ps. Este procedimiento fue seguido por 10 ns de equilibrio, con
átomos de la cadena principal restringidos armónicamente usando una constante de fuerza
de 1000 kcal mol -1 nm -2 . Realizamos seis 1 μ independientess simulaciones MD (tres de
SERCA-PLB y tres de E2 SERCA).

Análisis cartesiano del componente principal

Utilizamos el análisis cartesiano de componentes principales (cPCA) para comparar los
conjuntos estructurales de los estados SERCA-PLB, E1 y E2 de la bomba. cPCA utiliza la
dinámica real de la proteína para generar las coordenadas colectivas apropiadas que
capturan las características estructurales y dinámicas importantes de los estados nativos de
la proteína ( 56 ). Para cPCA, alineamos las estructuras de SERCA utilizando el dominio
TM de 10 hélices como referencia. Tuvimos tres propósitos al seleccionar el dominio TM
como referencia: 1) determinar si E1 y E2 ocupan diferentes espacios estructurales; 2) para
mostrar que E1 y E2 no se intercambian espontáneamente en las escalas de tiempo
utilizadas en este estudio; y 3) para ilustrar la dinámica estructural del casco intrínseco a los
estados E1 y E2. Usamos Carma ( 57 ) para realizar cPCA.
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Resultados

Estimación de los valores de pKa de residuos ácidos en el transporte de

SERCA unido a PLB
Los residuos ácidos E309, E771 y D800 son esenciales para la unión y la oclusión de iones
metálicos en los sitios de transporte ( 58 ). En particular, los cambios en los estados de
protonación de E309 y E771 son cruciales para la transición funcional de SERCA en
condiciones fisiológicas. Por ejemplo, se requiere la desprotonación de E309 para la
transición de E2 a E1 ( 31 , 59 , 60 ), y la ionización de E771 es necesaria para producir un
sitio de transporte I competente en E1 ( 61 ). Por lo tanto, realizamos cálculos pKa
empíricos de estos residuos utilizando la estructura cristalina de SERCA-PLB (código
PDB: 4KYT ) y comparamos los valores contra las estructuras cristalinas de alta resolución
de los estados E1 y E2 ( Tabla S1).) Aunque las estructuras cristalinas de E1 y E2 se
cristalizaron con uno o más ligandos unidos y en diferentes condiciones, los experimentos
indican que la transición E2-E1 directa e inversa está acompañada por la liberación y unión
de dos protones, respectivamente. Por lo tanto, el análisis de múltiples estructuras de cristal
debería ser capaz de capturar los estados de protonación inherentes a E1 y E2, y así ayudar
a determinar si PROPKA es lo suficientemente robusto para capturar estados de
protonación consistentes con datos experimentales. Los valores de pKa para residuos del
sitio de transporte calculados a partir de estructuras cristalinas individuales se muestran en
la Tabla S2 .
Los valores de pKa predichos de las estructuras cristalinas de E2 SERCA indican que a pH
intracelular normal (7.1-7.2 ( 62 )), los residuos E309, E771 y E908 están protonados. En el
estado E2, D800 tiene un valor pKa medio de 7,5, lo que implica que este residuo está en
equilibrio entre estados protonados y desprotonado a pH fisiológico ( Tabla 1 ). Musgaard
et al. ( 63 ) encontraron que entre los residuos cargados en los sitios de transporte, solo
D800 es probable que se desprotone en E2. Por lo tanto, realizamos cálculos adicionales de
pKa en estructuras MD-relaxed del E2. Encontramos que D800 está desprotonado en
solución, de acuerdo con los cálculos previos ( Tabla 1).) Los cálculos de pKa también
indicaron que solo los residuos E309, E771 y D800 están desprotonadas en el estado E1 de
SERCA ( Tabla 1 ). Por lo tanto, E2 está protonado en E309, E771 y E908, mientras que E1
está protonado solo en E908. Estos resultados están en excelente acuerdo con los datos
experimentales que muestran que la transición de E2 a E1 se combina con la liberación de
dos H + de los sitios de transporte ( 2 ). Estos hallazgos indican que a pesar de las
limitaciones inherentes del modelo (asignaciones aproximadas de estado de titulación /
pKa, limitaciones implícitas del disolvente y el uso de estructuras estáticas), PROPKA es lo
suficientemente robusto para predecir los estados de protonación que son característicos de
SERCA E1 y E2.

tabla 1
Valores pronosticados de pKa de residuos ácidos en los sitios de transporte de SERCA
A continuación, calculamos los valores de pKa de los residuos ácidos en los sitios de
transporte de SERCA unido a PLB. Encontramos que los residuos ácidos E908 y E771
están protonados a pH fisiológico ( Tabla 1 ). Este patrón de protonación se reprodujo en
cálculos de pKa realizados utilizando estructuras relajadas obtenidas a partir de
simulaciones independientes de 20 ns MD del complejo en un entorno completamente
solvatado ( Tabla 1 ). Durante las trayectorias de 20 ns, encontramos que la posición de los
residuos E771 y E908 se mantuvo prácticamente sin cambios en comparación con las
estructuras cristalinas (RMSD ≤ 0.07 nm). Esta observación complementa los cálculos de
pKa e indica que, en ausencia de Ca 2+, E771 y E908 son protonados en SERCA unido a
PLB.

Dinámica estructural de SERCA-PLB en solución

Realizamos tres simulaciones de DM independientes de 1 μs del complejo para determinar
la estabilidad estructural y la dinámica de SERCA unido a PLB protonado en E771 y
E908. Las estructuras de la modelo inicial como SERCA-PLB, así como la estructura del
complejo al final de cada simulación MD, se muestran en la Fig. 1 A . Calculamos la
columna vertebral RMSD para cada dominio funcional de SERCA y PLB para determinar
la dinámica estructural dependiente del tiempo del complejo en las trayectorias
de 1 μs ( figura 1 B ). Al comienzo de cada simulación, la estructura del dominio TM de 10
hélices de SERCA unida a PLB experimentó una deriva de 0,13 nm en la escala de tiempo
del picosegundo ( Fig. 1 B).) Este modesto cambio en RMSD se atribuye a la relajación del
dominio TM en un entorno de lípidos / agua. Después de este período de relajación rápida,
los valores RMSD se mantuvieron prácticamente sin cambios. Estas observaciones indican
que la disposición estructural del dominio TM observada en nuestras trayectorias es muy
similar a la determinada por la cristalografía de rayos X. Por el contrario, observamos una
gran variabilidad en los valores de RMSD para cada dominio en el casco citosólico de
SERCA-PLB ( Fig. 1 B ). Estos hallazgos están en línea con estudios previos que muestran
que el casco citosólico de SERCA es intrínsecamente flexible en condiciones fisiológicas
( 64-68 ).

Figura 1
Dinámica estructural de SERCA-PLB. ( A ) Estructuras iniciales y MD relajada del
complejo SERCA-PLB incrustado en una bicapa lipídica ( amarilla ) y agua
( azul ). SERCA se colorea de acuerdo con sus cuatro dominios funcionales: N ( verde ), P
( azul ), A ( rojo ) y TM ( gris ...
La raíz valores de la cadena principal C cuadrática media de fluctuación (RMSF) alfa átomos
de demostrar que la hélice TM de PLB en los complejos (residuos A24-L51) tiene muy baja
movilidad en el complejo ( Fig. 2 A ) y que se rellena exclusivamente una estructura de
hélice α en la escala de tiempo de microsegundos ( figura S3 ). Además, los gráficos
RMSD muestran que la hélice TM establece rápidamente una meseta alrededor de 0,2 nm
en las tres trayectorias ( figura S4 ), lo que indica que la hélice TM convergió a una
posición que es prácticamente idéntica a la de la estructura cristalina. De hecho, el 77% ±
2% de los contactos nativos encontrados en la estructura cristalina de SERCA-PLB4 están
presentes en las tres trayectorias del complejo WT PLB-bound ( Fig. 2 B) Por lo tanto,
nuestras simulaciones validan estudios bioquímicos y cristalográficos anteriores que
sugieren que PLB4 se une a SERCA de una manera similar a la observada para WT PLB
( 25,26 ).
Figura 2
Características estructurales de PLB en el complejo. ( A ) C alfaRMSFs de PLB calculados
a partir de cada trayectoria MD independiente. Los corchetes muestran la ubicación de las
hélices citosólicas y TM de PLB. ( B ) Interacciones entre los dominios TM de SERCA
(superficie ...
Encontramos que aunque la hélice citosólica de PLB (residuos E2-S16) era muy móvil
( Figuras 2 y S4 ), este segmento ocupaba una estructura de hélice α en las trayectorias de
microsegundos de longitud ( figura S1 ). Aunque la hélice citosólica se difundió a través de
la superficie bicapa viscosa en el microsegundo de tiempo, se encontró que este dominio de
PLB no interactuó con SERCA en las trayectorias ( figura 2 C ). Este hallazgo concuerda
con los experimentos de espectroscopía de RMN en estado sólido ( 22) El ángulo polar
entre la MT y las hélices citosólicas de PLB calculado sobre las tres trayectorias
combinadas es de 90 ° ± 20 °, lo que demuestra que la hélice citosólica está en contacto con
la superficie de la bicapa lipídica en todas las trayectorias.

Comparación entre conjuntos estructurales de PLB-bound, E1 y E2 SERCA

Usamos cPCA para determinar si SERCA-PLB protonado en E771 pertenece al continuo de
las estructuras E1 o E2. Encontramos que los cambios estructurales observados en las
estructuras de rayos X están bien descritos dentro de los dos primeros componentes
principales, PC1 y PC2. Una proyección 2D en PC1 y PC2 reveló la presencia de un solo
grupo que contiene las siete estructuras cristalinas y tres grupos de estructuras E1 ( Fig. 3 ).
figura 3
Comparación de los conjuntos SERCA-PLB con las estructuras de cristal y MD de E1 y
E2. Proyección de los dos primeros componentes principales obtenidos del cPCA realizado
en conjuntos de rayos X y MD de E1 y E2. El conjunto de SERCA-PLB se muestra en
magenta. ...
Aunque una comparación directa entre SERCA-PLB y las estructuras cristalinas podría ser
suficiente para determinar si el complejo cae en o cerca de E1 o E2, tal enfoque podría
proporcionar información incompleta, si no inexacta. Por ejemplo, estudios recientes han
demostrado que E1, y en menor medida E2, no se pueden representar como estructuras
únicas, porque SERCA es estructuralmente muy flexible en solución ( 64,66,67,69 ). Por lo
tanto, realizamos un cPCA de conjuntos de ambas estructuras de rayos X y MD de E1 y
E2. Generamos el conjunto MD de estructuras E1 combinando tres trayectorias MD de E1
unido a iones metálicos (E1⋅Ca 2+ , E1⋅K + y E1⋅Mg 2+ ) en una sola trayectoria. Estas
trayectorias se generaron en estudios previos realizados por nuestro grupo
(64,66 ). Además, se realizó tres 1 mu s simulaciones MD de E2 a partir de tres estructuras
cristalinas diferentes de SERCA en este estado. Encontramos que a pesar de la flexibilidad
relativa de la pieza craneal citosólica, la estructura de E2 se mantuvo sin cambios en las
trayectorias MD ( Fig. S5 ). Este hallazgo concuerda con estudios previos que muestran que
la protonación de los residuos E309, E771 y E908 es suficiente para estabilizar el estado E2
( 60,63 ). Encontramos que los datos estructurales de las simulaciones MD proporcionan un
vínculo entre las diferentes estructuras cristalinas de E1, así como una visualización más
precisa de la dinámica estructural de este estado en condiciones fisiológicas ( Fig. 3).) Del
mismo modo, encontramos que E2 rellena un conjunto de estructuras relativamente
flexibles, y que las estructuras cristalinas representan solo una posible conformación de E2
en solución ( figura 3 ).
El cPCA demostró que, a pesar de estar protonado en E771, SERCA unido a PLB no cae
dentro del espacio estructural cubierto por E2. En cambio, encontramos que el conjunto
estructural de SERCA-PLB en cada trayectoria independiente cae dentro del espacio
estructural E1 definido por MD y las estructuras cristalinas ( Fig. 3 , magenta ). Junto con
los cálculos de pKa, este análisis estructural indica que SERCA unido a PLB representa un
estado E1 de la bomba protonada en los residuos E771 y E908. Designamos este estado
como E1⋅H + 771 -PLB.

Acceso al agua a las vías citosólicas de E1⋅H + 771 -PLB

Bublitz et al. ( 30 ) analizaron recientemente el acceso al agua en estructuras cristalinas de
alta resolución de SERCA y sugirieron que el mecanismo de intercambio iónico en la
bomba incluye dos vías que conectan los sitios de transporte con el citosol: 1) una ruta N,
formada por hélices TM1 TM , TM2, TM4 y TM6, que se usa principalmente para la unión
de iones metálicos a los sitios de transporte; y 2) una ruta C formada por TM5, TM6, TM7,
TM8 y TM10, que se usa para la liberación de H + desde los sitios de transporte al citosol
después de la transición E2 a E1 de la bomba ( 30 ). El análisis de la densidad media del
agua calculada utilizando trayectorias MD mostró que, a excepción de E1⋅2Ca 2+ , donde los
sitios de transporte están casi totalmente protegidos del agua a granel ( 70), E1 se
caracteriza por una ruta N abierta y una ruta C cerrada ( figura 4 A ); por el contrario, E2 se
caracteriza por una trayectoria en C completamente abierta y una trayectoria en N
parcialmente abierta ( figura 4 B ). Sin embargo, encontramos que los iones metálicos no
pueden acceder a los sitios de transporte de E2 a pesar de la presencia de un N-path
parcialmente abierto. Además, encontramos que la ruta C en E2 no se une a los iones
metálicos, y la ruta está ocupada únicamente por moléculas de agua. Estos hallazgos
indican que la ruta C de SERCA se usa exclusivamente para el contratransporte de H +
a
través de una cadena de moléculas de agua unidas a hidrógeno (cables de agua ( 71 )).

Figura 4
Mapas de densidad de agua de E1, E2 y E1⋅H + 771 -PLB. ( A ) Mapa de densidad del agua de
E1 SERCA en varios estados unidos al metal. ( B ) La densidad del agua de E2
SERCA. ( C ) Densidad del agua calculada para cada trayectoria MD individual de
E1⋅H + 771 -PLB. La superficie azul ...
Para determinar si la protonación de E771 afecta la accesibilidad del agua en los trayectos
N y C, calculamos la densidad media del agua en las trayectorias de E1⋅H + 771 -PLB ( figura
4 C ) y la comparamos con la de E2 y E1 . Encontramos que los sitios de transporte de
E1⋅H + 771 -PLB están conectados al citosol a través de un camino lleno de moléculas de
agua, lo que indica la presencia de una característica N-path abierta de otros intermedios E1
(por ejemplo, E1⋅2K + y E1 ⋅Mg 2+ ). Los mapas de densidad también revelaron la presencia
de moléculas de agua en la ruta C de E1⋅H + 771 -PLB ( Fig. 4 , By C) Sin embargo, es poco
probable que el C-path parcialmente accesible de E1⋅H + 771 -PLB se use para
el contratransporte H + como en E2, por dos razones: 1) a diferencia de E2, el lado
citosólico de la ruta C está completamente sellado en E1⋅H + 771 -PLB ( Fig. 4 , B y C ), y 2)
el cable de agua necesario para la translocación H + no existe en E1⋅H + 771 -PLB ( Fig.
S6 ). Estos hallazgos indican que el complejo no muestra características estructurales
similares a E2 como se sugirió en un estudio previo ( 26).) En cambio, es probable que las
distorsiones estructurales temporales inducidas por PLB en los sitios de transporte den
como resultado que las moléculas de agua entren en la ruta C de E1⋅H + 771 -PLB.

Unión de iones metálicos en los sitios de transporte de E1⋅H + 771 -PLB

El análisis de la accesibilidad del agua mostró que a diferencia de E2, los sitios de
transporte de E1⋅H + 771-PLB están completamente expuestos al citosol ( Fig. 4 C ). Este
hallazgo sugiere que el agua y los iones metálicos pueden acceder a los sitios de transporte
en el complejo. Por lo tanto, analizamos la ocupación de iones metálicos en los sitios de
transporte de E1⋅H + 771 -PLB. El análisis cuantitativo reveló que los sitios de transporte de
E1⋅H + 771 -PLB están ocupados por uno o dos iones K + durante 77% ± 1% y 5% ± 2% del
tiempo, respectivamente. Por el contrario, los sitios de transporte son libres de iones
metálicos solo 16% ± 5% del tiempo. Encontramos que los sitios de transporte de
E1⋅H + 771 -PLB no se unen a Mg2+ en concentraciones fisiológicas de iones, de acuerdo con
la cristalografía de rayos X ( 26 ).
A continuación, investigamos las interacciones de K + con los sitios de transporte de
E1⋅H + 771 -PLB. Encontramos que los iones K + se unen a nueve posiciones diferentes en los
sitios de transporte de E1⋅H +771 -PLB ( Figura 5 A ), y que la preferencia por un único sitio
es variable en las trayectorias ( Figura 5 B ). Por ejemplo, K + interactúa con el residuo
D800 (sitios 1, 2 y 8) durante al menos el 40% del tiempo. Estos hallazgos indican que los
iones metálicos se unen en los sitios de transporte de E1⋅H + 771 . Sin embargo, el mapa de
densidad electrónica demostró que el complejo carece de iones metálicos unidos a los sitios
de transporte ( 26).) Encontramos que aunque los sitios de transporte están ocupados por
K + al menos el 80% del tiempo, el tiempo de residencia de K + en las posiciones que se
muestran en la figura 5 A es ≤5 ns. Este valor es mucho menor que los tiempos de
residencia de K + en apo E1 (> 0,9 μs ) ( 64 ), lo que indica que K + se intercambia con
frecuencia en los sitios de transporte. Un tiempo de residencia tan bajo explica la falta de
un pico positivo en el mapa de densidad de electrones F o - F c de los sitios de transporte de
SERCA unido a PLB ( 26 ).
Figura 5
Interacciones metal-ion en los sitios de transporte de E1⋅H + 771 -PLB. ( A ) Ubicación de las
nueve posiciones diferentes ocupadas por K + ( esferas amarillas ) en los sitios de
transporte de E1⋅H + 771 -PLB; cada posición está etiquetada de 1 a 9. Los círculos
discontinuos ...
E1⋅H + 771 se une a K + , pero no es capaz de producir geometrías de sitio de transporte
competentes ( Fig. S7 ). Analizamos los cambios estructurales en los sitios de transporte
inducidos por PLB para determinar por qué la unión de K + es insuficiente para producir
una disposición estructural en los sitios de transporte asociados con la activación de
SERCA ( 64 ). Los datos cristalográficos mostraron que el residuo N34 de PLB, que juega
un papel esencial en la inhibición de SERCA ( 72 ), induce una deformación en los sitios de
transporte a través de una red de contactos intermoleculares que implican los residuos Q108
(TM2), G801 (TM8) y T805 (TM8 ) de SERCA ( 26) Analizamos el enlace de hidrógeno
por N34 porque se ha demostrado que este residuo es directamente responsable de la
inhibición de SERCA ( 73 ), mientras que el extremo C y la hélice citosólica son
importantes para la localización de PLB ( 74 ) y el alivio de la inhibición dependiente de la
fosforilación ( 21-24 ), respectivamente. Encontramos que solo las interacciones N34-G801
y N34-T805 estaban presentes en más del 80% del tiempo de simulación en las trayectorias,
y que los contactos intermoleculares entre N34 y Q108 solo estaban presentes
transitoriamente ( Fig. S8 ; ver también la Fig. 2 B , con TM2 en azul y TM8
en naranja) Para determinar cómo las interacciones N34-G801 y N34-T805 alteran la
geometría de los sitios de transporte, calculamos la distancia interresidual entre los residuos
E771 y D800 / G801. Se encontró que el PLB unión resultó en un aumento en el C α -
C α distancia entre los residuos E771 y D800 / G801, que era 0,2 nm ya que la encontrada
en E1⋅2K + ( 64 ) ( Fig. 5 C , rojo y azul líneas ). Sin embargo, este cambio relativamente
pequeño da como resultado una separación de 0,35 nm entre los grupos carboxílicos del
D800 y E771 ( Fig. 5 C , línea verde ). Este cambio estructural impide que D800 participe
en la oclusión de iones metálicos en el sitio I (Fig. 5 A ). Por lo tanto, los cambios
estructurales locales inducidos por PLB no bloquean la unión de iones metálicos, sino que
inhiben la formación de un sitio de transporte competente I.
Recientemente se propuso que la unión de PLB a SERCA facilita la interacción entre E771
y N796, lo que da como resultado la protonación de la primera ( 26 ). Para probar esta
hipótesis, trazamos las distribuciones de distancia de C δ átomos entre E771 y N796 ( Fig.
6 ). Además, calculamos el corte de distancia al que E771 y N796 interactúan a través de al
menos un enlace de hidrógeno ( línea de puntos , Fig. 6) Encontramos que este gráfico
captura tanto la separación espacial real entre estos residuos como la probabilidad de
formación de enlaces de hidrógeno entre E771 y N796. Descubrimos que E771-N796 se
encuentra en un equilibrio dinámico entre dos poblaciones. La primera población (R <0.51
nm) corresponde a E771 y N796 que interactúan por al menos un enlace de hidrógeno. La
segunda población (R> 0.51 nm) representa una separación espacial donde E771 y N796 ya
no forman enlaces de hidrógeno. Además, los cálculos de pKa mostraron que E771
permanece protonado incluso en ausencia de enlaces de hidrógeno con N796 ( Fig.
6 ). Cálculos adicionales mostraron que la unión transitoria de un K + cerca de E771 (por
ejemplo, la posición 3 en la Fig. 5 A)) no disminuye el pKa de este residuo. Para explicar
por qué E771 permanece protonado en el complejo SERCA-PLB, calculamos el pKa de
E771 usando una trayectoria de E1⋅2K + ( 64 ). En ausencia de PLB, el pKa de E771 es 3,8
± 0,3, lo que indica que este residuo se desprotona en E1⋅2K + . Una inspección más
detallada de las interacciones metal-ion en los sitios de transporte reveló que K I + coordina
simultáneamente átomos de oxígeno de D800 y E771 en E1⋅2K + , pero no en E1⋅H + 771 . La
unión del primer ion Ca 2+ entre E771 y D800 induce la rotación de TM6 y un eslabón
giratorio de cadena lateral de E309 en TM4, formando así el segundo Ca 2+sitio de unión
(N796, D800 y E309) y contabilización de la unión cooperativa de Ca2 +
de
SERCA ( 48,49 ). Estas observaciones indican que las alteraciones estructurales inducidas
por PLB en los sitios de transporte inhiben la unión simultánea de un ion metálico tanto a
D800 como a E771, manteniendo así la protonación de E771 y evitando la rotación de
TM6.

Figura 6
Distribuciones de distancia entre E771 y N796 en E1⋅H + 771 -PLB. C δ -C δ se calcularon
distribuciones de distancia entre los residuos E771 y N796 para cada trayectoria (MD1-
MD3) de E1⋅H + 771 -PLB. Las distribuciones de distancia fueron ...
Para apoyar aún más la observación de que E771 debe estar protonado en SERCA-PLB, se
realizó tres 0.3 adicionales mu s simulaciones MD: SERCA-PLB con E771 desprotona, y
SERCA sin PLB con E771 protonado y desprotonado. La simulación de SERCA-PLB con
E771 modelado como desprotonado mostró que la eliminación de protones de E771 de
hecho disminuye el pKa de este residuo a un valor medio de 4,8, pero la ionización de E771
no altera la separación espacial entre C δ y C γ de E771 y D800, respectivamente ( R = 0,9 ±
0,08 nm). Además, encontramos que la desprotonación de E771 facilita la estabilización de
dos iones K + unidos a E771 y D800 ( figura S9 ). Estos K +iones tienen tiempos de
residencia en el rango de cientos de nanosegundos, y probablemente más. Este hallazgo
contrasta con los mapas de densidad electrónica que muestran que los sitios de transporte, y
en particular la región alrededor de E771 y D800, son libres de iones metálicos en SERCA-
PLB. Tras la eliminación de PLB, encontramos que el pKa de E771 disminuye a un valor
medio de 5,9. Una simulación de MD adicional comenzando desde una estructura al final
de esta trayectoria y con E771 desprotonado mostró que los sitios de transporte adoptan una
estructura competente característica de apo E1 ( R E771-D800 = 0,61 ± 0,05 nm; Fig. S9 ) ( 64)
y que el pKa de E771 disminuye aún más hasta un valor de 3.7. En conjunto, estos
conjuntos de simulaciones apoyan fuertemente las siguientes observaciones: 1) E771 está
protonado en SERCA-PLB, y 2) PLB es directamente responsable de los cambios
estructurales en los sitios de transporte que promueven la protonación de E771 en el estado
E1.

Disposición estructural del casco citosólico de E1⋅H + 771 -PLB

A continuación, se buscó determinar la dinámica de la estructura de la cabeza citosólica de
E1⋅H + 771 . Para este propósito, trazamos las distribuciones de distancia entre dominios de
E1⋅H + 771 y las comparamos contra las estructuras cristalinas de E1⋅2Ca 2+ ,
E1⋅2Ca 2+ ⋅AMPPCP y E1⋅Mg 2+ ( Fig. 7 ). Distribuciones de distancia Interdomain de NA,
NP, y dominios de AP se calcularon utilizando C α -C alpha distancias de los siguientes
pares de aminoácidos: K515-T171 (dominios NA), R489-E680 (dominios NP), y T171-
E680 (dominios AP ) Probamos modelos de distribución uno y dos gaussianos para cada
distribución de distancia, ρ ( R), De cada C α -C α par distancia. Encontramos que todas las
distancias se ajustan muy bien a una distribución de uno o dos gaussianos, con valores de
coeficientes de correlación de ≥0.95 para todas las distribuciones de Gauss.
Figura 7
Distribuciones de distancia entre los dominios N, A y P de E1⋅H + 771-PLB. Trayectorias MD
de E1⋅H + 771 -PLB ( magenta ) se utilizaron para calcular el C α -C α distribución distancia
entre ( A residuos) K515 y T171 en N y una dominios, ...
Encontramos que las distancias interdominio K515-T171 (dominios NA) en una sola
trayectoria el complejo (MD1) se ajusta a una sola distribución gaussiana con media = 2,4
nm, 0,2 nm menor que la distancia calculada a partir de la estructura cristalina de
E1⋅Mg 2+ ( Fig. 7 A , panel superior ). Las distribuciones de distancia en las trayectorias
MD2 y MD3 se ajustan a un modelo de dos Gauss, y la distancia de dominio NA de
E1⋅Mg 2+ cae dentro de estos límites de las distribuciones ( Fig. 7 A , paneles centrales e
inferiores ). A excepción de la trayectoria 2 ( Fig. 7 B , panel central ), la geometría
promedio de la interfaz NP en las trayectorias de E1⋅H+ 771 -PLB es muy similar a la
geometría observada en la estructura cristalina de E1⋅Mg 2+ ( Fig. 7 B , paneles superior e
inferior ). La distancia T171-E680 (dominios AP) de E1⋅H + 771 -PLB muestra la mayor
variabilidad entre las tres trayectorias independientes ( figura 7 C ). Estos hallazgos indican
que E1⋅H + 771 -PLB no llena una conformación de cofre compacto o abierto en solución. En
cambio, encontramos que la disposición de la cabeza de E1⋅H + 771 -PLB puebla una
estructura relativamente cerrada, que no es adecuada ni para la hidrólisis de ATP ni para el
intercambio de nucleótidos (64,66 ). Estos hallazgos complementan el análisis de cPCA que
se muestra en la Fig. 3 , que muestra que PLB cambia el equilibrio de SERCA hacia una
estructura de cabeza cerrada.
Ir:

Discusión
PLB rellena un estado E1⋅H + 771 inhibido de SERCA
En este trabajo, utilizamos cálculos de proteína pKa y simulaciones MD de microsegundos
para mostrar que la unión a PLB rellena un estado E1 protonado de SERCA,
E1⋅H + 771 . Varios estudios han demostrado que PLB se une a SERCA a lo largo de su ciclo
catalítico ( 34 , 36 , 75 ) y que la inhibición de SERCA depende de los cambios
estructurales entre los estados R y T de PLB ( 21-24 ). Por lo tanto, es posible que
E1⋅H + 771-PLB no representa el estado inhibido del complejo, porque la región citosólica de
PLB no se resolvió en la estructura cristalina del complejo. Sin embargo, descartamos esta
posibilidad por las siguientes razones: 1) El mutante PLB utilizado para obtener cristales
del complejo, PLB4, se unió a SERCA con una afinidad muy alta, comparable o incluso
mayor que la de la tapsigargina (TG) ( 25 ) Sin embargo, los experimentos FRET han
demostrado que TG y Ca 2+ disminuyen la afinidad de unión de PLB ( 34 ). Por lo tanto,
E1⋅H + 771 -PLB representa el complejo de alta afinidad porque la estructura cristalina de
SERCA-PLB4 se obtuvo en ausencia de TG y Ca 2+ ( 26 ). 2) En un estudio reciente (76 ),
los acoplamientos dipolares residuales de RMN y las simulaciones MD restringidas
mostraron que los residuos A24-Q29 están completamente desplegados en el estado R no
inhibidor de PLB. Sin embargo, los mapas de densidad electrónica en la estructura
cristalina de SERCA-PLB4 y nuestras simulaciones de MD muestran que este segmento se
pliega como una hélice α estable . Esta evidencia indica que E1⋅H + 771 -PLB representa la
estructura del complejo inhibido.

PLB no inhibe la transición E2-a-E1 de SERCA

Uno de los problemas más controvertidos en la regulación SERCA es si PLB bloquea la
transición E2-a-E1 o atrapa la bomba en un intermedio E1 unido a iones metálicos. La
primera hipótesis sugiere que PLB se une solo a SERCA en estados E2 ( 17,77 ) o E2⋅ATP
( 16,25,26 ) y bloquea la transición E2 a E1 de la bomba. La segunda hipótesis, basada en la
evidencia cristalográfica, propone que PLB se une a un intermedio de E1 unido a Mg2 + y
bloquea la progresión del ciclo hacia E1 ~ P⋅2Ca2 + ⋅ADP ( 28,29 ). Bidwell et al. ( 34)
propuso un tercer escenario basado en los resultados de los experimentos FRET en miocitos
ventriculares de conejo. Estos experimentos mostraron que el complejo SERCA-PLB no se
ve alterado por las elevaciones de calcio citosólico durante la contracción cardíaca, lo que
sugiere que PLB permanece unido al estado E1 unido a iones metálicos de la bomba,
aunque con menor afinidad ( 34 ). Sin embargo, estos experimentos no revelaron qué paso a
lo largo del ciclo catalítico se ve afectado por PLB. Nuestras simulaciones mostraron que
PLB no inhibe la transición E2-E1, porque la estructura cristalina de SERCA-PLB
representa un estado E1. Esto indica que SERCA no está bloqueado en un estado E2 de
punto muerto (por ejemplo, E2 unido al inhibidor TG), sino que ha hecho la transición a
E1. Nuestras simulaciones demuestran que la unión de PLB puebla una
E1⋅H + 771 inhibidaintermedio, lo que indica que la inhibición de PLB de SERCA se produce
principalmente en el estado E1. Los experimentos de cinética han demostrado que la PLB
interfiere con la unión de los primeros ( 47 ) y segundos ( 46 ) iones Ca 2+ a E1. Aunque
nuestras simulaciones se realizaron en ausencia de Ca 2+ , proporcionan una explicación de
estos resultados experimentales: a medida que aumenta la concentración
de Ca 2+ citosólica , es posible que el primer Ca 2+ se una a E1⋅H + 771 cerca de D800 en el
sitios de transporte (K + en la posición 1, Fig. 5 A ). Sin embargo, la distorsión estructural
en los sitios de transporte inducida por PLB inhibe el Ca 2+interactuar tanto con D800 como
con E771, lo cual es necesario para la formación de un sitio de transporte competente I
( 64 ). La incapacidad del sitio de transporte I para adoptar una geometría competente
inevitablemente dará como resultado una geometría alterada del sitio II. Por lo tanto, las
alteraciones estructurales inducidas por PLB en los sitios de transporte explican las tasas
alteradas de unión del segundo ion Ca 2+ ( 46 ). Proponemos que PLB rellena un estado E1
inhibido que interfiere con la formación de un estado E1 catalíticamente competente de la
bomba.

Papel funcional de E1⋅H + 771 en el mecanismo de regulación de SERCA por

PLB
Nuestros hallazgos sugieren que la unión de PLB no inhibe la transición E2-a-E1 de
SERCA, pero rellena un estado inhibido de E1⋅H + 771 de la bomba. ¿Cuál es la importancia
funcional de regular la actividad SERCA a través de cambios en la protonación del estado
E1? E1 existe como un amplio conjunto de estructuras separadas por pequeñas barreras de
energía, y la unión del ligando (Ca 2+ , K + y Mg 2+ ) alostéricamente desplaza este equilibrio
hacia una estructura abierta o cerrada dentro del continuo E1 ( 28,29,64). , 66 ). Los
ensayos funcionales en SERCA nativo mostraron que la activación de la bomba por
Ca 2+requiere una transición dependiente del pH, limitante de la velocidad que es más lenta
en el ácido que en el pH alcalino (transición E2 a E1) ( 60 ). En base a estas observaciones,
se propuso que la activación por Ca 2+ es más fácil si la enzima reside en el estado E1 en
lugar de en un estado de E2 protonado ( 60 ). De hecho, las simulaciones de grano grueso
mostraron que la transición de E2 a E1 tiene una barrera de energía muy grande
( 78 ). Alternativamente, la protonación / desprotonación de E1 ofrece otras ventajas
funcionales. Por ejemplo, la protonación puede cambiar la conformación y la actividad de
una proteína de una manera específica ( 79 ). Además, la protonación puede afectar los
modos de regulación, incluida la especificidad, la allostery y la cooperatividad ( 79) De
hecho, encontramos que PLB controla la dinámica de la cabeza de E1⋅H + 771 y puebla una
estructura de la cabeza que no es adecuada para la unión e intercambio de nucleótidos ( Fig.
7 ). La desprotonación de E771 después del alivio de la inhibición de SERCA debería
inducir un cambio rápido en el continuo de estructuras E1 para poblar un estado abierto,
que es necesario para el intercambio de nucleótidos ( 64 ) y un estado cerrado productivo
sobre la unión de Ca2 + ( 66 ). Por lo tanto, la regulación eficiente y rápida de la actividad
SERCA se logra mediante la creación de estados bioquímicos adicionales en el estado E1,
que sirve como una trampa cinética en las transiciones estructurales de E1. Por lo tanto,
E1⋅H + 771asegura que las transiciones estructurales asociadas con la activación de SERCA se
deprimen temporalmente, pero no se eliminan, en condiciones fisiológicas
normales. Sugerimos que este mecanismo de regulación de SERCA por PLB da como
resultado tanto una mejora rápida de la carga de SR Ca 2+ durante la diástole (relajación)
como una mayor disponibilidad de Ca 2+ durante la sístole (contracción).
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Conclusión
Hemos utilizado cálculos de proteína pKa y simulaciones MD de microsegundos en todos
los átomos para determinar si PLB inhibe los estados E1 o E2 de SERCA. Nuestras
simulaciones no solo mostraron que la conformación inhibidora de PLB se une a E1
SERCA sino que también revelaron un nuevo estado (a nuestro conocimiento) protonado de
E1, designado como E1⋅H + 771 . Encontramos que en ausencia de Ca 2+ , los iones K + se
unen a los sitios de transporte de E1⋅H + 771, aunque de forma transitoria y no específica. Sin
embargo, una deformación estructural inducida por PLB alrededor de los residuos D800 /
G801 hace que SERCA sea incapaz de producir sitios de transporte competentes. Estos
hallazgos indican que PLB no regula a SERCA al bloquear la transición de E2 a E1. En
cambio, la unión de PLB puebla un nuevo estado (a nuestro conocimiento) E1⋅H + 771 que
controla la dinámica de la cabeza y deprime las transiciones estructurales que son
necesarias para la activación dependiente de Ca2 + de SERCA. Por lo tanto, PLB es un
efector que introduce modificaciones en el panorama energético del estado E1. Proponemos
que E1⋅H + 771 es un intermedio que es necesario para Ca 2+ rápidotransporte después del
alivio de la inhibición de SERCA. Concluimos que la regulación eficiente mediada por
PLB de la actividad de SERCA en el corazón es el resultado de transiciones estructurales
que ocurren principalmente en el estado E1 de la bomba.
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Contribuciones de autor
LME-F. y DDT diseñó la investigación. LME-F. y GLR-S. realizó una investigación. GLR-
S. herramientas analíticas contribuidas. LME-F. y JMA analizó datos. LME-F., JMA y DDT
escribieron el documento.
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Expresiones de gratitud
Damos las gracias a Bengt Svensson, Jesse E. McCaffrey y Zach James por las perspicaces
discusiones, y a Octavian Cornea y Sarah Blakely por la asistencia administrativa.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Estadounidense del Corazón
(12SDG12060656 a LME-F.) Y los Institutos Nacionales de Salud (R01GM27906 a
DDT). GLR-S. es apoyado por una beca predoctoral de CONACYT (México). Este
proyecto hizo un uso extensivo de las excelentes instalaciones en el Instituto de
Supercomputación de la Universidad de Minnesota.
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Material de apoyo
Documento S1. Materiales y métodos de apoyo, 11 figuras y dos tablas:
Haga clic aquí para ver. (1.6M, pdf)
Documento S2. Artículo más material de apoyo:
Haga clic aquí para ver. (3.8M, pdf)
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Referencias
1. Palmgren MG, Nissen P. P-type ATPases. Annu. Rev. Biophys . 2011; 40 : 243-
266. [ PubMed ]
2. Yu X., Carroll S., Inesi G. H + contratransporte y electrogenicidad del retículo
sarcoplásmico Ca2 + bomba en proteoliposomas reconstituidos. Biophys. J. 1993; 64 :
1232-1242. [ PubMed ]
3. Zafar S., Hussain A., Inesi G. Especificidad de la unión del ligando a los sitios de
transporte: unión de Ca2 + a la ATPasa de transporte de Ca2 + y su dependencia de H + y
Mg2 + Arch. Biochem. Biophys. 2008; 476 : 87-94. [ PubMed ]
4. Cantilina T., Sagara Y., Jones LR Estudios comparativos de ATPasas del retículo
sarcoplásmico cardíaco y esquelético. Efecto de un anticuerpo fosfolamban sobre la
activación enzimática por Ca2 + J. Biol. Chem. 1993; 268 : 17018-17025. [ PubMed ]
5. Sahoo SK, Shaikh SA, Periasamy M. La interacción de la proteína sarcolipina con el
sarco (endo) retículo plasmático Ca2 + ATPasa (SERCA) es distinta de la proteína
fosfolambana, y solo la sarcolipina puede promover el desacoplamiento de la bomba
SERCA. J. Biol. Chem. 2013; 288 : 6881-6889. [ PubMed ]
6. Asahi M., McKenna E., MacLennan DH Las interacciones físicas entre el fosfolambano
y el sarco (endo) retículo plasmático Las Ca2 + -ATPasas se disocian por Ca2 + elevado,
pero no por la fosforilación de fosfolamban, vanadato o tapsigargina, y se potencian por el
ATP. J. Biol. Chem. 2000; 275 : 15034-15038. [ PubMed ]
7. Sasaki T., Inui M., Tada M. Mecanismo molecular de regulación de la bomba de Ca2 +
ATPasa por fosfolamban en el retículo sarcoplásmico cardíaco. Efectos de péptidos de
fosfolamban sintéticos en la bomba de Ca2 + ATPasa. J. Biol. Chem. 1992; 267 : 1674 -
1679. [ PubMed ]
8. MacLennan DH, Kranias EG Phospholamban: un regulador crucial de la contractilidad
cardíaca. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003; 4 : 566-577. [ PubMed ]
9. Minamisawa S., Hoshijima M., Chien KR La interacción crónica de la ATPasa del calcio
con el retículo fosfolambánico-sarcoplásmico es el defecto crítico del ciclo del calcio en la
miocardiopatía dilatada. Celda. 1999; 99 : 313-322. [ PubMed ]
10. del Monte F., Harding SE, Hajjar RJ Dirigiéndose al fosfolamban por transferencia
genética en la insuficiencia cardíaca humana. Circulación. 2002; 105 : 904-907. [ PubMed ]
11. Iwanaga Y., Hoshijima M., Ross J., Jr. La inhibición crónica de fosfolambas previene la
disfunción cardíaca progresiva y la remodelación patológica después del infarto en ratas. J.
Clin. Invertir. 2004; 113 : 727-736. [ PubMed ]
12. Meyer M., Belke DD, Dillmann WH Un anticuerpo recombinante aumenta la
contractilidad cardíaca al imitar la fosforilación de fosfolamban. FASEB J. 2004; 18 : 1312-
1314. [ PubMed ]
13. Hoshijima M., Ikeda Y., Chien KR. Supresión crónica de la progresión de la
insuficiencia cardíaca por un mutante pseudofosforilado de fosfolamban a través de la
administración in vivo de genes rAAV cardíacos. Nat. Medicina. 2002; 8 : 864-
871. [ PubMed ]
14. Akin BL, Jones LR Caracterización de interacciones de unión a proteína Ca2 + -ATPasa
2a (SERCA2a) del retículo plasmídico de fosfolamban a sarco (endo) plasmático en
vesículas de retículo sarcoplásmico cardíaco humano mediante reticulación química. J.
Biol. Chem. 2012; 287 : 7582 - 7593. [ PubMed ]
15. Chen Z., Akin BL, Jones LR Ca2 + que se une al sitio I de la bomba cardíaca de Ca2 +
es suficiente para disociar el fosfolamban. J. Biol. Chem. 2010; 285 : 3253-
3260. [ PubMed ]
16. Chen Z., Akin BL, Jones LR. Enlace cruzado de restos C-terminales de fosfolamban a
la bomba de Ca2 + del retículo sarcoplásmico cardíaco para investigar interacciones
espaciales y funcionales dentro del dominio transmembrana. J. Biol. Chem. 2006; 281 :
14163-14172. [ PubMed ]
17. Toyoshima C., Asahi M., MacLennan DH. Modelado de la interacción inhibidora de
fosfolamban con la Ca2 + ATPasa. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2003; 100 :
467-472. [ PubMed ]
18. Zamoon J., Nitu F., Veglia G. Mapeo de la superficie de interacción de una proteína de
membrana: descubrimiento del interruptor conformacional de fosfolamban en la regulación
de la bomba de calcio. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2005; 102 : 4747-
4752. [ PubMed ]
19. Asahi M., Kimura Y., MacLennan DH Transmembrana hélice M6 en sarco (endo)
retículo plasmático Ca (2 +) - ATPasa forma un sitio de interacción funcional con
fosfolamban. Evidencia de interacciones físicas en otros sitios. J. Biol. Chem. 1999; 274 :
32855-32862. [ PubMed ]
20. Morita T., Hussain D., Maclennan DH. Sitios de interacción entre fosfolamban,
sarcolipina y el sarco (endo) retículo plasmático Ca (2 +) -
ATPasa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008; 369 : 188-194. [ PubMed ]
21. Dong X., Thomas DD FRET resuelto en el tiempo revela el mecanismo estructural de la
regulación SERCA-PLB. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014; 449 : 196-
201. [ PubMed ]
22. Gustavsson M., Verardi R., Veglia G. Regulación alostérica de SERCA mediante
desplazamiento conformacional de fosfolambano por
fosforilación. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2013; 110 : 17338-
17343. [ PubMed ]
23. Ha KN, Traaseth NJ, Veglia G. Control de la inhibición de la Ca2 + -ATPasa
sarcoplásmica ajustando la dinámica estructural de fosfolamban. J. Biol. Chem. 2007; 282 :
37205-37214. [ PubMed ]
24. Karim CB, Kirby TL, Thomas DD Dinámica estructural de fosfolamban en bicapas
lipídicas sondeada por una etiqueta de giro acoplada rígidamente a la cadena principal del
péptido. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2004; 101 : 14437-14442. [ PubMed ]
25. Akin BL, Chen Z., Jones LR Los mutantes fosfolamban superinhibidores compiten con
Ca2 + por la unión a SERCA2a al estabilizar un único estado conformacional dependiente
de nucleótidos. J. Biol. Chem. 2010; 285 : 28540-28552. [ PubMed ]
26. Akin BL, Hurley TD, Jones LR La base estructural para la inhibición de
phospholamban de la bomba de calcio en el retículo sarcoplásmico. J.
Biol. Chem. 2013; 288 : 30181 - 30191. [ PubMed ]
27. Kimura Y., Asahi M., MacLennan DH dominio Phospholamban I / citocromo b5
quimeras secuencia transmembrana no inhiben SERCA2a. FEBS Lett. 1998; 425 : 509-
512. [ PubMed ]
28. Winther AM, Bublitz M., Buch-Pedersen MJ La bomba de calcio con sarcolipina
estabiliza los sitios de calcio expuestos al citoplasma. Naturaleza. 2013; 495 : 265-
269. [ PubMed ]
29. Toyoshima C., Iwasawa S., Inesi G. Crystal estructuras de la bomba de calcio y
sarcolipina en el estado de E1 ligado a Mg2 +. Naturaleza. 2013; 495 : 260-
264. [ PubMed ]
30. Bublitz M., Musgaard M., Nissen P. Ion vías en el retículo sarcoplásmico Ca2 +
-ATPasa. J. Biol. Chem. 2013; 288 : 10759 - 10765. [ PubMed ]
31. Clausen JD, Bublitz M., le Maire M. SERCA mutante E309Q se une a dos iones Ca
(2+) pero adopta una conformación catalíticamente incompetente. EMBO J. 2013; 32 :
3231-3243. [ PubMed ]
32. Gorski PA, Glaves JP, Young HS Sarco (endo) retículo plasmático ATPasa calcio
inhibición (SERCA) por sarcolipina está codificada en su cola luminal. J.
Biol. Chem. 2013; 288 : 8456-8467. [ PubMed ]
33. de Meis L., Vianna AL Interconversión de energía por la ATPasa dependiente de Ca2 +
del retículo sarcoplásmico. Annu. Rev. Biochem. 1979; 48 : 275-292. [ PubMed ]
34. Bidwell P., Blackwell DJ, Robia SL Phospholamban se une con afinidad diferencial a
los confórmeros de la bomba de calcio. J. Biol. Chem. 2011; 286 : 35044-
35050. [ PubMed ]
35. James ZM, McCaffrey JE, Thomas DD Interacciones proteína-proteína en la regulación
del transporte de calcio sondeada por resonancia paramagnética de transferencia de
saturación de electrones. Biophys. J.2012; 103 : 1370-1378. [ PubMed ]
36. Mueller B., Karim CB, Thomas DD. Detección directa de la interacción Ca-ATPasa del
retículo fosfolambánico y del retículo sarcoplásmico en membranas utilizando la
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Bioquímica. 2004; 43 : 8754-
8765. [ PubMed ]
37. Bas DC, Rogers DM, Jensen JH Predicción y racionalización muy rápidas de los
valores de pKa para complejos proteína-ligando. Proteínas 2008; 73 : 765-783. [ PubMed ]
38. Li H., Robertson AD, Jensen JH Predicción y racionalización empírica muy rápida de
los valores de proteína pKa. Proteínas 2005; 61 : 704-721. [ PubMed ]
39. Olsson MHM, Sondergaard CR, Jensen JH PROPKA3: tratamiento consistente de
residuos internos y superficiales en predicciones empíricas de pK (a). J. Chem. Teoría
Comput. 2011; 7 : 525-537. [ PubMed ]
40. Sondergaard CR, Olsson MHM, Jensen JH Tratamiento mejorado de ligandos y efectos
de acoplamiento en el cálculo empírico y la racionalización de los valores de pK (a). J.
Chem. Teoría Comput. 2011; 7 : 2284 - 2295. [ PubMed ]
41. Tanford C., Roxby R. Interpretación de las curvas de titulación de proteínas. Aplicación
a la lisozima. Bioquímica. 1972; 11 : 2192-2198. [ PubMed ]
42. Cornelius F., Kanai R., Toyoshima C. Una visión estructural sobre la importancia
funcional de la fracción de azúcar y esteroides hidroxilos de esteroides cardiotónicos en
unión a Na, K-ATPasa. J. Biol. Chem. 2013; 288 : 6602-6616. [ PubMed ]
43. Yu H., Ratheal IM, Roux B. La protonación de residuos ácidos clave es crítica para
la selectividad K +de la bomba Na / K. Nat. Struct. Mol. Biol. 2011; 18 : 1159-
1163. [ PubMed ]
44. Fiser A., Sali A. Modeller: generación y refinamiento de modelos de estructura proteica
basados en homología. Métodos Enzymol. 2003; 374 : 461-491. [ PubMed ]
45. Traaseth NJ, Shi L., Veglia G. Estructura y topología de fosfolamban monomérico en
membranas lipídicas determinado por una solución híbrida y enfoque de RMN en estado
sólido. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2009; 106 : 10165-10170. [ PubMed ]
46. Trieber CA, Afara M., Young HS Efectos de los mutantes fosfolamban transmembrana
sobre la afinidad del calcio, la actividad máxima y la cooperatividad de la bomba de calcio
del retículo sarcoplásmico. Bioquímica. 2009; 48 : 9287 - 9296. [ PubMed ]
47. Mahaney JE, Autry JM, Jones LR Estudios de cinética de la Ca-ATPasa cardíaca
expresada en células Sf21: nuevos conocimientos sobre la regulación de Ca-ATPasa por
fosfolamban. Biophys. J. 2000; 78 : 1306-1323. [ PubMed ]
48. Toyoshima C., Nomura H. Cambios estructurales en la bomba de calcio que acompañan
a la disociación del calcio. Naturaleza. 2002; 418 : 605-611. [ PubMed ]
49. Obara K., Miyashita N., Toyoshima C. Papel estructural del contratransporte revelado
en la estructura cristalina de la bomba de Ca (2+) en ausencia de Ca
(2+) Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2005; 102 : 14489-14496. [ PubMed ]
50. Referencia eliminada en la prueba.
51. Referencia eliminada en la prueba.
52. Phillips JC, Braun R., Schulten K. Dinámica molecular escalable con NAMD. J.
Comput. Chem. 2005; 26 : 1781-1802. [ PubMed ]
53. Weber W., Hünenberger PH, McCammon JA Simulaciones de dinámica molecular de
un octapéptido de polialanina en condiciones de frontera ewald: influencia de la
periodicidad artificial en la conformación de péptido. J. Phys. Chem. B. 2000; 104 : 3668-
3675.
54. Darden T., York D., Pedersen L. Malla de partículas Ewald: un método N · log (N) para
sumas de Ewald en sistemas grandes. J. Chem. Phys. 1993; 98 : 10089-10092.
55. Essmann U., Perera L., Berkowitz ML Un método Ewald de malla de partícula lisa. J.
Chem. Phys. 1995; 103 : 8577-8593.
56. Amadei A., Linssen AB, Berendsen HJ Dinámica esencial de las
proteínas. Proteínas 1993; 17 : 412-425. [ PubMed ]
57. Noticias y actualizaciones de Glykos NM Software. Carma: un programa de análisis de
dinámica molecular. J. Comput. Chem. 2006; 27 : 1765-1768. [ PubMed ]
58. Clarke DM, Loo TW, MacLennan DH Ubicación de sitios de unión de Ca2 + de alta
afinidad dentro del dominio transmembrana predicho del retículo sarcoplásmico Ca2 +
-ATPasa. Naturaleza. 1989; 339 : 476-478. [ PubMed ]
59. Inesi G., Lewis D., de Meis L. Fluctuaciones conformacionales de la Ca2 + -ATPasa en
el entorno de la membrana nativa. Efectos del pH, temperatura, sustratos catalíticos y
tapsigargina. J. Biol. Chem. 2008; 283 : 1189-1196. [ PubMed ]
60. Lewis D., Pilankatta R., Tadini-Buoninsegni F. Características distintivas de los
mecanismos catalíticos y de transporte en el retículo sarco-endoplásmico de mamíferos Ca2
+ ATPasa (SERCA) y Cu + (ATP7A / B) ATPasas. J. Biol. Chem. 2012; 287 : 32717 -
32727. [ PubMed ]
61. Liu Y., Pilankatta R., Moncelli MR. Expresión heteróloga de alto rendimiento de Ca
(2+) ATPasa de tipo salvaje y mutante: caracterización de sitios de unión de Ca (2+)
mediante transferencia de carga. J. Mol. Biol. 2009; 391 : 858-871. [ PubMed ]
62. Steenbergen C., Deleeuw G., Williamson JR Efectos de la acidosis y la isquemia en la
contractilidad y el pH intracelular del corazón de la rata. Circ. Res. 1977; 41 : 849-
858. [ PubMed ]
63. Musgaard M., Thøgersen L., estados Schiøtt B. protonación de importantes residuos
ácidos en las Ca centrales 2+ sitios de unión de iones de la Ca 2 + -ATPasa: un estudio de
modelado molecular. Bioquímica. 2011; 50 : 11109-11120. [ PubMed ]
64. Espinoza-Fonseca LM, Autry JM, Thomas DD Simulaciones de dinámica molecular
de microsegundos de los estados intermedios de Mg 2+ y K + de la bomba de calcio. Más
uno. 2014; 9 : e95979. [ PubMed ]
65. Das A., Gur M., Roux B. Exploración de las transiciones conformacionales de sistemas
biomoleculares usando un modelo de red anisotrópico simple de dos estados. PLOS
Comput. Biol. 2014; 10 : e1003521. [ PubMed ]
66. Espinoza-Fonseca LM, Thomas DD Caracterización a nivel atómico del mecanismo de
activación de SERCA por calcio. Más uno. 2011; 6 : e26936. [ PubMed ]
67. Winters DL, Autry JM, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia
Interdominio Thomas DD en SERCA sondeada por proteína cian-fluorescente fusionada al
dominio actuador. Bioquímica. 2008; 47 : 4246-4256. [ PubMed ]
68. Pallikkuth S., Blackwell DJ, Robia SL El fosfolamban fosforilado estabiliza una
conformación compacta de la ATPasa cálcica cardíaca. Biophys. J. 2013; 105 : 1812-
1821. [ PubMed ]
69. La bomba de calcio de 2 colores Hou Z., Hu Z., Robia SL revela el cierre del casco
citoplasmático con unión de calcio. Más uno. 2012; 7 : e40369. [ PubMed ]
70. Sugita Y., Ikeguchi M., Toyoshima C. Relación entre la afinidad de Ca2 + y el blindaje
de agua a granel en la bomba de Ca2 + a partir de simulaciones de dinámica
molecular. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 2010; 107 : 21465-
21469. [ PubMed ]
71. Nagle JF, Morowitz HJ Mecanismos moleculares para el transporte de protones en
membranas. Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS. 1978; 75 : 298-302. [ PubMed ]
72. Kimura Y., Kurzydlowski K., MacLennan DH La función inhibidora del fosfolambán se
activa por despolimerización. J. Biol. Chem. 1997; 272 : 15061-15064. [ PubMed ]
73. Trieber CA, Douglas JL, Young HS Los efectos de la mutación en las propiedades
reguladoras del fosfolamban en membranas co-reconstituidas. Bioquímica. 2005; 44 : 3289-
3297. [ PubMed ]
74. Los restos C-terminales de fosfolamban de Abrol N., Smolin N., Robia SL son
determinantes críticos de la estructura y función del complejo regulador de calcio
ATPasa. J. Biol. Chem. 2014; 289 : 25855-25866. [ PubMed ]
75. Negash S., Yao Q., Squier TC Phospholamban permanece asociado con la ATPasa
dependiente de Ca ^ {2+} y Mg ^ {2+} después de la fosforilación por la proteína quinasa
dependiente de cAMP. Biochem. J.2000; 351 : 195-205. [ PubMed ]
76. De Simone A., Gustavsson M., Vendruscolo M. Estructuras de los estados excitados de
fosfolamban y cambios en sus poblaciones después de la
fosforilación. Bioquímica. 2013; 52 : 6684 - 6694. [ PubMed ]
77. Waggoner JR, Huffman J., Mahaney JE Phospholamban inhibe los cambios
conformacionales de Ca-ATPasa que implican al intermediario E2. Bioquímica. 2007; 46 :
1999-2009. [ PubMed ]
78. Nagarajan A., Andersen JP, Woolf TB Las simulaciones de grano grueso de las
transiciones en las conformaciones E2-a-E1 para Ca ATPasa (SERCA) muestran
compensación de entropía-entalpía. J. Mol. Biol. 2012; 422 : 575-593. [ PubMed ]
79. Schönichen A., Webb BA, Barber DL. Considerando la protonación como una
modificación postraduccional que regula la estructura y la función de la
proteína. Annu. Rev. Biophys. 2013; 42 : 289-314. [ PubMed ]
80. Best RB, Zhu X., Mackerell AD, Jr. Optimización del aditivo CHARMM con campo de
fuerza de proteína atómica dirigida a un muestreo mejorado de los ángulos diédricos phi,
psi y cadena lateral chi (1) y chi (2). J. Chem. Teoría Comput. 2012; 8 : 3257-
3273. [ PubMed ]
81. Klauda JB, Venable RM, Pastor RW Actualización del campo de fuerza aditiva todo-
átomo de CHARMM para lípidos: validación en seis tipos de lípidos. J.
Phys. Chem. B. 2010; 114 : 7830-7843. [ PubMed ]
82. Allnér O., Nilsson L., Villa A. Coordinación e intercambio de ion-agua de magnesio en
simulaciones biomoleculares. J. Chem. Teoría Comput. 2012; 8 : 1493-1502. [ PubMed ]