Professional Documents
Culture Documents
Ya existen métodos basados en la utilización de las técnicas mencionadas y está diseñada para
minimizar el uso de medios de cultivo, incubaciones de tiempos largos y extracciones por
disolventes.
Una de las técnicas más empleadas es la técnica de inmunoensayo enzimático sobre fase solida
(ELISA).
Debemos tener en cuenta que el análisis de micotoxinas requiere un altísimo grado de exactitud,
precisión y reproducción de manera consecutiva en cada ejecución experimental (soriano del
castillo).
Las técnicas analíticas más empleadas en el análisis de micotoxinas son (soriano del castillo):
- Extracción y purificación
- Técnicas de presunción o screening
- Técnicas de confirmación
Es de elección la técnica de extracción cuando la matriz es sólida, contando con una lista amplia
de disolventes (metanol, acetona, acetato de nitrilo, acetonitrilo, diclorometano y hexano); la
selección de estos disolventes se ajusta por los siguientes factores (soriano del castillo):
1.4.2.1 INMUNOENSAYOS
Muchas técnicas muchos ensayos para micotoxinas abarcan diferentes problemas como contar
con un laboratorio bien equipado, en cuanto a instrumentación y personal con experiencia en
el manejo de muestras y estándares de referencias; sin embargo, a los intentos de simplificar
estos procedimientos estos procedimientos analíticos dio lugar al desarrollo de sistemas
inmunoquímicos, que encierran una gran dificultad en su elaboración, pero simplificado de tal
manera que se adquieren en forma de “kits” que requieren el mínimo de instrumentación y la
comprensión del proceso analítico de detección (Pozas).
Las micotoxinas al no ser antigénicas, los primeros estudios realizados se pretendió lograr la
conjugación con proteínas o polipeptidos que pudieran producir anticuerpos en condiciones
óptimas para conejos y otros animales. Progresivamente avanzaba la tecnología se logró la
producción de anticuerpos monoclonales. (Perez)(Pozas)
En esta técnica consiste en añadir al medo de reacción un anticuerpo específico y una cantidad
conocida de la micotoxina marcada con isotopo radiactivo (soriano del castillo) (Pozas) (3H, 14C
o 125I) (soriano del castillo); la cual se incuba con la muestra problema. Tras un lavado del medio,
se mide la radioactividad emitida por la muestra con un contador de centelleo, siendo la medida
inversamente proporcional a la concentración de la micotoxina en la muestra problema. La
concentración de la micotoxina se determina comparando los resultados con una recta patrón
(soriano del castillo).
Cada vez se utiliza de manera decreciente por varias razones: el laboratorio debe contar con
autorización para manipular radioelementos y además los costes de los patrones y de la gestión
de los residuos es muy elevado (soriano del castillo) (pozas).
ELISA es una técnica inmunoenzimática que consiste en reacciones serológicas que utilizan
conjugados para poder visualizar la reacción antígeno-anticuerpo (Perez, Marta); está basado
en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que
directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto puede ser medido
espectrofotométricamente (Pozas, Ruben).
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto,
simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase
sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre (Perez) (Pozas).
Anticuerpos marcados:
o ELISA Directo
o ELISA Indirecto
o ELISA Sándwich:
Doble (DAS)
Heterólogo (HADAS)
Antígenos marcados
o ELISA competitivo
1.4.2.2. BIOSENSORES
Técnicas como la cromatografía en capa fina (CCF) (Thin-Layer Chromatography: TLC), ha sido
uno de los métodos de elección para la investigación y determinación de micotoxinas. Esta
técnica es extremadamente útil cuando trabajamos con extractos muy limpiosy en donde el
desarrollo en una sola dirección (CCF-unidimensional) es suficiente para la separación. A partir
de la década de los ochentas, se inició la cromatografía en capa fina de alta resolución (High-
Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC), con desarrollo bidimensional (soriano del
castillo).
Entre las ventajas más importantes que presenta la CL se encuentra la posibilidad de separar
sustancias termolábiles, no volátiles, polares y apolares con aceptables resolución entre
sustancias químicamente similares de manera rápida y reproducible. Es la técnica más habitual
para el análisis de micotoxinas acopladas a distintos detectores.
Se encuentra en la literatura diversas revisiones sobre el análisis de las micotoxinas por esta
técnica, se observa una clara preferencia de la fase reversa sobre la fase normal.
Los detectores utilizados son: el UV que es universal pero poco selectivo ya que muchas
moléculas absorben a la misma longitud de onda que las micotoxinas; fluorescencia, que por el
contrario es muy selectivo, y espectrometría de masas (EM) qué genera detecciones específicas.
La espectrometría de masas acoplada a la cromatografía líquida ha experimentado en la última
década un importante desarrollo gracias a las mejoras introducidas en las interfaces, por lo que
se ha convertido en la técnica de elección para la identificación y cuantificación de micotoxinas
termolábiles.
Sin duda el método más empleado hasta la fecha para el análisis de fumonisinas es la
cromatografía líquido-líquido de alta resolución (HPLC). Ahora bien, debido a que las
fumonisinas no presentan ningún cromoforo fuerte (sillue), no absorben en la zona del espectro
UV en la zona del visible para su análisis por estos métodos (velazquez), son necesarios técnicas
de derivatización (velazquez) (cantu) de los grupos aminos libres, que son transformados a
compuestos capaces de absorber en longitudes de onda de ultravioleta o fluorescentes (cantu).