UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

“FRANCISCO DE MIRANDA”
ÁREA TECNOLOGÍA
COMPLEJO ACADEMICO EL SABINO
PROGRAMA DE INGENIERIA QUIMICA

OBTENCION DE ENZIMA CELULOSA POR FERMENTACIÓN EN

FASE LIQUIDA DEL DESECHO DE Zeas Mays A PARTIR DE
Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae

AUTORES

Br. Marchan M. Lizmaira C. C.I: 21.667.843

Br. Molina T. Anilex A. C.I: 21.112.120

TUTOR ACADEMICO

Ing. Navas Soreiret. C.I: 18.480.404

TUTOR INDUSTRIAL

Dr. Yegres Francisco. C.I: 2.066.979

Punto Fijo; Enero 2018

 OBTENCION DE ENZIMA CELULOSA POR FERMENTACIÓN
EN FASE LIQUIDA DEL DESECHO DE Zea mays A PARTIR DE
Aspergillus níger y Saccharomyces cerevisiae. Marchan, Lizmaira;
Molina, Anilex; Navas, Soreiret y Yegres, Francisco. Trabajo de grado
para optar al título de Ingeniero Químico ante la ilustre Universidad
Experimental “Francisco de Miranda”. Complejo Académico El Sabino.
Área de Tecnología. Programa de Ingeniería Química. Punto Fijo ,2018.

RESUMEN

El maíz es el cereal más producido en Venezuela, ocupando el

tercer país productor de este rubro en Latinoamérica, generando a su vez
desechos agrícolas negativos para el ambiente. Desde el punto de vista
ambiental la producción de celulosa y sus derivados, representa una
amenaza a los ecosistemas naturales, pues, para su producción se
requiere maderas frondosas y coníferas, las cuales constituyen los
pulmones vegetales del planeta. Tomando en cuenta, lo expuesto, se
estudió la obtención de la enzima celulosa a partir del desecho agrícola
de este cereal. Para el cumplimiento de este objetivo, se aplicaron
métodos establecidos para la obtención de la enzima, dichos métodos se
sometieron a modificaciones sujetas a las disposiciones de equipos,
reactivos y concentraciones propias de la investigación. Se estudió
fisicoquímicamente las características del desecho del Zeas mays (Maíz),
empleando diversos métodos, obteniendo como resultados una humedad
de 9,2% cenizas 1,98% carbohidratos 23,03%, grasas 0,2%, fibra 24% y
proteína 2,45%. Se realizó aislamiento de hongo y levadura, utilizando
medio Sabouraud con agar para la identificación del A. niger y S.
cerevisiae macroscópica y microscópicamente, observando en el hongo
conoideo negro y radial dividido formando columnas, y la levadura un
color blanco terciopelado. La cinética de crecimiento de los
microorganismos se efectuó de manera radial para el hongo
evidenciándose el crecimiento de este en los primeros 7dias, para la
levadura fue realizada por horas, observando la fase exponencial en las
primeras 4horas. La determinación de proteínas se ejecutó por método de
biuret, presentando el hongo a 25% de sacarosa la mayor presencia de
proteínas 0,009183ppm por lectura de absorbancia. Por fermentación en
fase liquida de los microorganismos con el sustrato en medio Czapek
Dox, se obtuvo la enzima, arrojando el hongo una mayor actividad
enzimática, con 0,2065ppm mientras la levadura 0,0458ppm.

Palabras Claves: Zea mays, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus

niger, Czapek Dox, Sabouraud con agar.

ii
 OBTAINING CELLULOSE ENZYME BY FERMENTATION IN
LIQUID PHASE OF THE WASTE OF Zeas mays FROM Aspergillus
niger and Saccharomyces cerevisiae. Marchan, Lizmaira; Molina,
Anilex; Navas, Soreiret y Yegres, Francisco. Degree work to qualify for the
title of Chemical Engineer before the illustrious "Francisco de Miranda"
Experimental University. El Sabino Academic Complex. Technology Area.
Chemical Engineering Program. . Punto Fijo, 2018

ABSTRACT
Corn is the most produced cereal in Venezuela, occupying the third
producing country of this heading in Latin America, generating in turn
negative agricultural waste for the environment. From the environmental
point of view, the production of cellulose and its derivatives represents a
threat to natural ecosystems, since, for its production, hardwood and
coniferous woods are required, which constitute the vegetable lungs of the
planet. Taking into account the above, we studied the production of the
cellulose enzyme from the agricultural waste of this cereal. For the
fulfillment of this objective, established methods were applied to obtain the
enzyme, these methods were subjected to modifications subject to the
provisions of equipment, reagents and concentrations of the research. The
characteristics of Zeas mays (corn) waste were studied physicochemically,
using different methods, obtaining as a result a humidity of 9.2% ashes
1.98% carbohydrates 23.03%, 0.2% fat, 24% fiber and protein 2.45%.
Isolation of fungus and yeast was performed, using Sabouraud medium
with agar for the identification of A. niger and S. cerevisiae
macroscopically and microscopically, observing the black and radial
conoid fungus divided into columns, and the yeast a velvety white color.
The growth kinetics of the microorganisms was carried out radially for the
fungus, evidencing the growth of this in the first 7 days, for the yeast it was
carried out for hours, observing the exponential phase in the first 4 hours.
Protein determination was carried out by the biuret method, with the
fungus at 25% sucrose showing the highest protein presence
0.009183ppm per absorbance reading. By liquid phase fermentation of the
microorganisms with the substrate in Czapek Dox medium, the enzyme
was obtained, the fungus yielding a greater enzymatic activity, with
0.2065ppm while the yeast 0.0458ppm.

Keywords: Zeas mays, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger,

Czapek Dox, Sabouraud with agar.

iii
 AGRADECIMIEMTO

A Dios por ser mi guía y ayudarme a ser constante y persistente

para lograr esta meta, gracias dios por nunca dejarme desmayar y
abandonar mi sueño a pesar de todas las adversidades.

A mi mami por estar siempre a mi lado apoyándome en todo

momento, gracias mami por ser la mejor madre del mundo por todos esos
sacrificios que hiciste por mí, para que lograra realizar mi sueño hoy por
hoy puedo decir que lo logramos porque esta meta es de las dos mami,
eres mi gran ejemplo a seguir TE AMO.

A mi hermana Lingimar marchan por estar siempre a mi lado

apoyándome e impulsándome a seguir adelante esto también es para ti
hermana te quiero.

A mi Tío Luis gracias por estar presente a lo largo de toda mi

carrera como el gran padre que es, a Coca y mami Jovita gracias por ser
mis segundas madres y a toda familia gracias por apoyarme.

A los muchachos (Ronny, Cristian, Jorge, Gabriel, Chegollo, Nelson

estrella, Nelson Ramón, Jhonatan y Juan) gracias por estar siempre ahí
apoyándome y dándome palabras de aliento para seguir adelante cuando
sentía que el camino estaba muy difícil.

A las muchachas ( Yannileys , María , Osbeliz, Geo , Noryha ,

Vanessa) gracias amigas , a mi hija traidora (Adriana Andreina) por estar
pendiente y escucharme cada vez que me daba mi lloradera, a Leo Leo
(Edgledys) por llenarnos de su tranquilidad que muchas veces me
estresaba pero que fue de gran ayuda, a todas ustedes GRACIAS
MUCHACHAS !!!

A mis tutores académicos e industriales por apoyarnos en nuestro

trabajo de grado, a la profesora Wilmary, María, Nohemí, Giovanna, y el
Sr Elías. Gracias por todo el apoyo brindado.

iv
 A la profesora Patricia Navas, por su colaboración, mi más grande
agradecimiento por haber confiado en nosotras, por su paciencia y apoyo
para la conclusión de la tesis, gracias por impulsarme en el desarrollo de
mi formación profesional.

Por último pero no menos importante a mi amiga y compañera de

tesis ANILEX gracias por soportar todos mis malos humores a lo largo de
toda nuestra carrera gracias por haberme hecho reflexionar en esos
momentos en los cuales sentía que ya no podía mas, fuiste una pieza
muy importante en esta meta.

GRACIAS a todos por estar siempre a mi lado a lo largo de este

gran sueño.

Lizmaira. C. Marchan Medina

v
 AGRADECIMIENTO

A Dios, por estar presente en mi vida llenándola de bendiciones,

por ayudarme a alcanzar mi meta propuesta y por haber puesto en mi
camino personas que han sido mi soporte y compañía durante todo mi
estudio.

A mi Madre Maithe Tremont, por haberme apoyado en todo

momento, por todo el amor brindado. Por sus palabras de aliento, sus
consejos, por su motivación constante, su ejemplo de mujer luchadora y
fuerte. Por decirme en cada momento ¡Hija tu puedes, no llores! A ti mil
gracias Madre, Te Amo.

A mi tía y segunda Madre Mónica Tremont, por educarme,

cuidarme y creer en mí en cada momento, por las veces que sentí caer,
levantarme con un fuerte abrazo y siempre estar pendiente de mí con ese
¡Gorda, comiste! que me sueles decir. Por quererme y apoyarme siempre.
A ti también te debo esto mi Gorda Bella.

A mis hermanos Rousmert y Roussert, por estar conmigo y

apoyarme siempre. A mi Hermana Noryhalex Molina, por los trasnocho
junto a mí, aguantarse mis humores y llantos, por celebrar conmigo cada
triunfo y llorar cada tropiezo. A ti mi hermana muchas gracias por la
paciencia y tolerancia brindada.

A mis adorados sobrinos Frank y Roussert, para que vean en mi

un ejemplo a seguir y puedan sobrepasar mis triunfos, logrando ser
grandes personas. Los Amo.

A Todos mis Primos, Tíos y cuñada, Gracias por todo el apoyo y

cariño brindado. En especial a mi Prima-Hemana Whitny por estar
siempre a mi lado, por tu apoyo y actitud que me hacen volver a la
realidad cuando me pierdo. Mis tíos Argenis, Alfredo y Francisco por sus
consejos de estudios, paciencia y consideración.

v
 A mis amigos, por siempre estar para mí en cada triunfo y en
cada derrota, nos apoyamos mutuamente en nuestra formación
profesional, Adriana, Edgledys, Nelson José, Ramón, Gregorio, Yamil,
Gabriel, Ronny Rafael, Cristian, Jorge, Osbeliz, Vanessa, Yannileys,
Geohana, Beatriz, Argerica (negra), Juan, maría, dayannis, Jhonatan. A
todos gracias por las experiencias vividas con ustedes, por que más que
amigos, son mi segunda familia

A mi gran amiga y compañera de tesis Lizmaira, por toda la

paciencia, cariño y confianza brindada. Por estar conmigo desde el inicio
de la carrera, y por nunca dudar de nuestra amistad a pesar de tantas
peleas.

A mi novio Andrés, por estar a mi lado, y ofrecerme una luz de

amistad, confianza, amor y fe cuando hasta las esperanzas se
desvanecían.

Los Amo

A todas las personas y técnicos que nos encontramos a lo largo

de esta experiencia, en especial a las profesoras Wilmary, María, Nohemí,
Giovanna, el Sr Elías. Gracias por todo el apoyo brindado.

A nuestra asesora industrial Patricia Navas, por su colaboración

y buena vibra, por su paciencia ante nuestra inconsistencia, por su apoyo
a seguir este camino de tesis y llegar a la conclusión del mismo, antes de
usted no veíamos fin. Por eso y mucho mas, mil gracias Prof., Dios la
Bendiga

Anilex. A. Molina Tremont

vi
 DEDICATORIA

A Dios, por darme la fe que necesitaba, por guiarme en mi camino

y estar conmigo siempre, por darme fortaleza, sabiduría, inteligencia y
perseverancia para nunca darme por vencida todo mi triunfo te lo debo a ti
señor.

A mi mami, Pastora Medina por darme la vida, por apoyarme,

motivarme a seguir adelante y sentirse orgullosa de mis logros, de ver sus
sueños realidad su hija ser lo que quería ser, por brindarme la confianza
para ver mi meta, mi logro, mi éxito nuestro triunfo. Esto es para ti mami,
Todo lo que soy es por ti y para ti. A ti te dedico, este triunfo y todos los
que están por venir, te lo mereces por nunca desmayar, ahora estás
viendo el fruto de nuestro sacrificio.

A ti abuela Felipa que aunque ya no estés conmigo siempre te

recuerdo como una mujer guerrera y luchadora que fuiste siempre, para ti
también es esto se que desde el cielo te sentirás muy orgullosa de mi, me
tarde pero lo logre abue.

Lizmaira. C. Marchan Medina

v
 DEDICATORIA

A mi padre Alex Molina que fue mi ejemplo a seguir y desde el

cielo me cuida y bendice.

A mi madre Maithe Tremont, mi tía Mónica Tremont, porque

creyeron en mí, en gran parte gracias a ustedes hoy puedo ver alcanzada
mi meta, ya que siempre estuvieron impulsándome en los momentos más
difíciles de mi carrera, el orgullo que sienten por mí, fue lo que me hizo
llegar hasta el final. Va por ustedes, por lo que valen, porque admiro su
fortaleza y por lo que han hecho de mí. Para ustedes y por ustedes todos
mis triunfos. ¡Las Amo! A mis Sobrinos Frank y Roussert para ser su
ejemplo a seguir.

Anilex. A. Molina Tremont

vi
 ÍNDICE GENERAL

RESUMEN ................................................................................................. ii
ABSTRACT .............................................................................................. iii
AGRADECIMIEMTO ................................................................................ iv
DEDICATORIA .......................................................................................... v
ÍNDICE DE GRAFICAS ........................................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................... vi
INTRODUCCION ....................................................................................... 1
CAPÍTULO I EL PROBLEMA

1.1 Planteamiento del Problema ................................................................ 5

1.2 Objetivos de la Investigación ............................................................... 8
1.2.1 Objetivo General ............................................................................ 8
1.2.2 Objetivos Específicos .................................................................... 8
1.3 Justificación de la Investigación ........................................................... 9
1.4 Alcance de la Investigación................................................................ 11
CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes .................................................................................... 13

2.2 Bases Teóricas .................................................................................. 17
2.2.1 Maíz (Zea mays). ......................................................................... 17
2.2.2 Usos del Maíz. ............................................................................. 18
2.2.3 Producción Actual Venezolana. ............................................... 19
2.2.4 Parámetros Fisicoquímicos para Desechos Agroindustrial. ......... 20
2.2.5 Microbiología ............................................................................... 22
2.2.6 Hongos .................................................................................... 23
2.2.7 Estructura de los Hongos ............................................................ 24
2.2.8 Reproducción de los Hongos ....................................................... 25
2.2.9 Técnicas micológicas para el cultivo de hongos .......................... 25
2.2.10 Levaduras .................................................................................. 27
2.2.11 Curva de crecimiento del microorganismo ................................. 30
2.2.12 Fermentación aeróbica. ............................................................. 31

vi
 2.2.13 Enzimas ..................................................................................... 33
2.2.14 Celulosa ..................................................................................... 35
2.2.15 Celulasas totales ....................................................................... 36
2.2.16 Producción de Celulosas ........................................................... 37
2.2.17 Uso de las celulasas .................................................................. 39
2.2.18 Enzimas en Venezuela .............................................................. 40
2.3 Bases Legales ................................................................................... 41
2.4 Teminos Basicos ............................................................................... 42
CAPÍTULO III MARCO METODOLÓGICO

3.1 Tipo y Diseño de la Investigación ...................................................... 47

3.2 Población y Muestra ......................................................................... 49
3.3 Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos ........................... 50
3.4 Fases de la Investigación .................................................................. 51
Fase 1. Caracterización Fisicoquímica del desecho de maíz (Z. mays).
............................................................................................................. 51
Fase 2. Identificación de A niger y S. cerevisiae mediante el estudio
macroscópico y microscópica de sus estructura reproductora. ............ 52
Fase 3. Determinación de la cinética de crecimiento A. niger y S.
cerevisiae ............................................................................................. 53
Fase 4. Comprobar la presencia de proteínas totales en la fermentación
del desecho Z. mays a partir de A. niger y S. cerevisiae. ..................... 54
Fase 5. Determinación cuantitativa de presencia de la celulosa en la
fermentación en fase liquida del desecho de Z. mays a partir de A. niger
y S. cerevisiae. ..................................................................................... 55
CAPÍTULO IV RESULTADOS

4.1 Caracterización fisicoquímica del maíz (Zea mays) .......................... 57

4.2.Identificación de A niger y S. cerevisiae mediante el estudio
macroscópico y microscópica de sus estructura reproductora. ............... 59
4.3Dterminación de la cinética de crecimiento A. niger y S. cerevisiae ... 60
4.4 Comprobar la presencia de proteínas totales en la fermentación del
desecho Z. mays a partir de A. niger y S. cerevisiae. .............................. 62
4.5 Determinación cuantitativa de presencia de la celulosa en la
fermentación en fase liquida del desecho de Z. mays a partir de A. niger y
S. cerevisiae. ........................................................................................... 63

vii
CAPITULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES .................................................................................... 66
RECOMENDACIONES ............................................................................ 67
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................... 68
APÉNDICE .............................................................................................. 76
ANEXOS .................................................................................................. 84

viii
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Titulo Pág.

1 Principales grupos de enzimas 35
2 Microorganismos usados para la producción de 37
celulosa
3 Ensayos fisicoquímicos aplicando métodos a 52
diferentes parámetros
4 Caracterización fisicoquímica del maíz 57
5 Crecimiento radial de A.niger en medio Czapek Dox a 60
diferentes concentraciones de
6 Preparación de medio de cultivo, Czapek Dox liquido 85
a concentraciones de sacarosa (5,10 y 15)%
7 Preparación de medio de cultivo, Czapek Dox solido 86
a concentraciones de sacarosa (5,10 y 15)%

vi
 ÍNDICE DE GRAFICAS

Grafica Titulo Pág.

1 Crecimiento radial de A.niger a diferentes 61
concentraciones de sacarosa
2 Crecimiento de la levadura S.cerevisae en medio 62
Czapek Dox liquido a diferentes concentraciones de
sacarosa
3 Presencia de proteínas totales en A.niger y 63
S.cerevisae a diferentes concentraciones de
glucosa
4 Presencia de celulosa a diferentes concentraciones 64
de glucosa

vii
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Titulo Pág.

1 Curva típica de crecimiento microbiano 30
2 Reacciones química en fermentación aeróbica 32
3 Modo de acción del complejo enzimático celulosa 39

vi
 INTRODUCCION

El maíz, es el cereal con mayor importancia que conoce el ser

humano ya que en torno a él se pueden realizar gran cantidad de
preparaciones, así como también pueden obtenerse numerosos productos
derivados, por ende, este cereal posee la más amplia distribución a nivel
mundial, ocupando el tercer lugar en los estimados de producción total,
precediendo al arroz y el trigo. (Gretha Maraima, 2016). En periodo
hispano-indio la siembra del maíz fue el principal cultivo desarrollado por
los indígenas venezolanos y en los últimos años ha sido el alimento más
cultivado en Venezuela debido a su poder de adaptación y facilidad de ser
cultivada en casi todas las condiciones climáticas del país. (Yusmaira et
al, 2011).

La producción de maíz en Venezuela es de gran importancia ya que

desde el punto de vista socio-cultural justifica plenamente la necesidad de
ofrecer a los agricultores alternativas de producción económicamente
rentables, ecológicamente compatibles y socialmente aceptables; Es
importante resaltar que Venezuela es el tercer país productor de maíz de
Latinoamérica (Yusmaira et al, 2011).

Los procesos en la industria alimentaria de la producción de maíz

traen como consecuencia una serie de desechos agroalimentarios que
contrarrestan la conservación ambiental, sin embargo, estos desechos
son representativamente orgánicos que, en su gran mayoría, aumentan el
nivel de contaminación del lugar donde se procesan alimentos. Entre los
residuos orgánicos de mayor importancia y relevancia en el área
hortofrutícola se encuentran las cáscaras, la tuza y las pulpas luego del
procesamiento que no cumplen con los estándares de calidad, entre otros
(Vélez y otros, 2009), representando pérdidas sustanciales. Cabe
destacar que, según (Calvo, 2009), diversas fuentes indican que los
desechos del procesamiento contienen varios componentes como gomas
vegetales que son polisacáridos entre los cuales se pueden mencionar
pectinas, celulosas y hemicelulosa.

En los últimos años se ha llevado a cabo un crecimiento comercial

importante en la producción de derivados celulósicos, los cuales son la
base de plásticos, fibras, estabilizantes de emulsiones, lacas, hojas de
máquinas, entre otros (Jiménez, G. 2011), por lo cual su importancia en la
industria química es elevada. La mayor parte del material celulósico
utilizado para estas industrias es proveniente de las maderas coníferas y
frondosas que representan los pulmones vegetales del mundo,
produciendo de esta manera un efecto negativo de gran impacto para el
ambiente, pues se puede decir que a medida que dicha industria crece,
disminuye la calidad ambiental.

Con base en la situación expuesta anteriormente, y según lo

expresado por Hernández (2008), se han generado numerosos estudios
nacional e internacionalmente que buscan mitigar la sobre explotación de
los recursos naturales existentes, a través de la búsqueda de alternativas
ecológicas para la producción de pasta celulósica.

Venezuela no escapa de esta realidad, ya que las industrias

químicas y complejos petroquímicos más importantes demandan
elevadas cantidades de celulosa y sus derivados, los cuales en la
actualidad, el país no está en la capacidad de suministrar y por esta razón
se deben importar según lo expresado por el Ministerio de Industrias
Ligeras y Comercio en la gaceta oficial N° 38.577. Debido a la deficiencia
de divisas que presenta la nación, el suministro de estos se ha visto

2
afectado, generando deficiencias en los procesos productivos de las
industrias química. Con base en lo anterior esta investigación tiene como
finalidad obtener celulosa a partir de desechos de maíz.

En este sentido, la biotecnología resulta de gran importancia social

y ambiental, ya que, representa una solución para disminuir el volumen de
desechos orgánicos contaminantes, dándoles un uso aprovechable y
proporcionando beneficios ambientales, económicos e industriales. En
este contexto, los materiales lignocelulósicos, especialmente, los residuos
de la agroindustria, entre otras, puesto que comprenden
aproximadamente el 50 % de la biomasa en el mundo, a su vez han
servido de base para realizar diferentes investigaciones sobre todo las
relacionadas con la química, por su parte Claassenvan et al (1999),
plantea que los residuos pueden ser procesados de diferentes formas
para la obtención de una extensa variedad de productos.

A continuación se presenta un resumen estructurado del contenido

de este proyecto:

Capítulo I. El problema, se consideran los parámetros a estudiar o

desarrollar en cuanto al problema a estudiar, los cuales son:
planteamiento del problema, justificación, objetivos general y específicos
así como el alcance. Capítulo II. Marco teórico, este capítulo consta de las
investigaciones que hacen referencia a los antecedentes del problema y
las bases teóricas que respaldan el estudio. Capítulo III. Marco
metodológico, se describe el tipo y diseño de la investigación a realizar,
población y muestra, así como también la metodología a utilizar para el
logro de los objetivos planteados. Capítulo IV. Análisis de los resultados,

3
se detallan y analizan los resultados obtenidos durante las fases de la
investigación.

Además, se presentan las conclusiones y recomendaciones

basadas en los resultados obtenidos así como la bibliografía utilizada para
el desarrollo de la investigación.

4
 CAPITULO I

EL PROBLEMA

1.1 Planteamiento del Problema

El maíz es esencial para la alimentación humana y animal y fuente

de materias primas para la industria. Es usado para producir forraje así
como base para la fabricación de una gran cantidad de alimentos y de
productos farmacéuticos e industriales, entre ellos, concentrado animal,
papel, refrescos, caramelos, tintas, pegamentos, plástico biodegradable,
productos de panificación, productos lácteos, salsas, sopas, pinturas,
helados, alcohol, aceite comestible, cosméticos, sabores, y una lista casi
interminable de otros productos. (Silva, 2005).

El cultivo de maíz posee un enorme potencial de crecimiento

basado en el aumento de la demanda de alimentos y el surgimiento de
nuevos usos que abarcan desde alimento humano y forraje para las
producciones de carne o leche, hasta su procesamiento industrial en
plantas de alta complejidad cuyo producto final puede ser un alimento, un
biocombustible o una materia prima para elaborar productos químicos
como los biomateriales.

En este sentido el maíz es considerado como el cultivo más

importante del sector agrícola vegetal en Venezuela y ha sido
considerado como un rubro estratégico, dada su importancia en la dieta
diaria del venezolano. Resaltando además que Venezuela es el tercer
país productor de maíz de Latinoamérica (Rincón et al., 2011).

5
 Así mismo, el aumento de la población mundial ha provocado un
incremento del consumo de alimentos y por ende de la producción de
maíz, lo cual genera gran cantidad de desechos sólidos que contribuyen a
la contaminación ambiental, ya que en Venezuela una vez obtenido el
grano del maíz la tusa es desechada siendo recolectada en diversas
áreas, sin hacer uso de ellas (Silva, 2005).

En Venezuela, el cultivo de maíz represento el 58,13% de la

producción de cereales en el 2005 y se espera que el producto vuelva a
ser el primordial en nuestra economía. En los últimos diez años el maíz en
Venezuela se ha duplicado en su producción. (López, 2012), dado que
junto con el arroz y el trigo, el maíz es uno de los principales alimentos
del falconiano. Su uso no solo se centra en la alimentación humana sino
que forma parte de la alimentación animal por sí mismo o constituyendo
un ingrediente muy importante en la composición pastos para cerdos,
aves y vacas. (Montiel y Rodríguez, 2008). También con los trozos no
aprovechados se obtiene furfural un componente que se utiliza en la
industria del caucho, resinas, plásticos, insecticidas o líquidos para
embalsamar. (Martínez, 2012).

Con lo anterior se puede afirmar que la producción de maíz es

altamente justificable, pero que genera gran cantidad de desechos sólidos
como la tusa al ambiente.

En la actualidad, es ampliamente conocido que el papel es uno de

los productos de mayor uso en la vida del hombre. Se fabrica a partir de
materia prima renovable: las fibras de celulosa extraídas principalmente
de los árboles, pero también de otras especies vegetales, como paja,
bagazo de la caña de azúcar, bambú, algodón, lino, entre otros. Es

6
menos conocido que la celulosa se encuentra comercialmente disponible
en una gran variedad de presentaciones y se utiliza en las industrias de
los detergentes, textil y alimenticia, entre otras. (Ascensión Sanz Tejedor,
2003).

De acuerdo con la resolución Nº 195, publicada en la gaceta oficial

Nº 38.577 (2006), el Ministerio de Industrias Ligeras y Comercio, mediante
una evaluación de necesidades y requerimientos en materia de
producción, identificó los bienes de capital y sus partes utilizados en los
procesos industriales y agrícolas, materia prima e insumos no producidos
en el país y por ende la necesidad de importación de los mismos. Entre
los insumos importados se encuentran la celulosa.

La celulosa está disponible en grandes cantidades y llega a

representar por lo menos una tercera parte de toda la materia vegetal, lo
que lo convierte en el más abundante de todos los compuestos orgánicos
naturales y también uno de los más enigmáticos según Rodríguez (2009).

Sin embargo, las plantas de celulosa aumentan cada vez más en

tamaño y capacidad de producción, agravando aún más los impactos de
su proceso industrial, que de por sí presenta serios riesgos ambientales.
Las plantas actuales de pulpa de papel son unas mega fábricas cuyo solo
tamaño se convierte en un riesgo pues, los efluentes tóxicos podrán ser
pequeños comparados con los volúmenes que se procesan, pero no con
las magnitudes que la naturaleza puede soportar. (Boletín Nº 83 del
WRM, junio de 2004). Por ello surge la idea del empleo de proteínas en la
sustitución de procesos industriales en la producción de celulosa, además
que no presenta ningún tipo de contaminación ambiental

7
 Por otra parte, para la producción de celulosa existen fuentes
alternativas a la madera que en su mayoría son desaprovechados, como
es el caso de los desechos agroindustriales, entre ellos el maíz. En el
municipio Petit, estado Falcón se presenta actualmente que los desechos
del maíz cosechado, se descomponen en el terreno, o se incineran, lo que
genera contaminación del aire y suelo, afectando de esta manera la
comunidad y sus zonas aledañas, produciendo enfermedades
respiratorias y la propagación de plagas en este colectivo de escasos
recursos.

Con base en las necesidades y problemáticas mencionadas, se

propone la obtención de celulosa a partir de residuos de maíz, ya que
este es el rubro de mayor producción y por ende un gran potencial
agrícola que genera desechos que según Rodríguez (2009), pueden
utilizarse por su contenido de celulosa y su bajo contenido de lignina.

1.2 Objetivos de la Investigación

1.2.1 Objetivo General

 Obtener celulosa por fermentación en fase liquida del desecho de

Zea mays a partir de Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae

1.2.2 Objetivos Específicos

 Caracterizar fisicoquímicamente los desechos de maíz (Zea mays).

8
  Identificar el Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae
mediante el estudio macroscópico y microscópico de sus estructura
reproductora.

 Determinar de la cinética de crecimiento del Aspergillus niger y

Saccharomyces cerevisiae

 Comprobar la presencia de proteínas totales presente en la

fermentación en fase liquida del desecho de Zea mays a partir de
Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae

 Determinar cuantitativamente la presencia de celulosa en la

fermentación en fase líquida del desecho de Zea mays a partir de
Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae

1.3 Justificación de la Investigación

El maíz es uno de los alimentos básicos más importantes que

conoce el ser humano ya que en torno a él se pueden realizar gran
cantidad de preparaciones así como también pueden obtenerse
numerosos productos derivados (por ejemplo, harinas, aceites, entre
otros). Subsecuentemente, el maíz es altamente utilizado como alimento
de gran parte de los ganados que luego son consumidos o utilizados
como productores de alimento.

9
 El maíz presenta un sin fin de utilidades, motivo por el cual la
generación de los desechos aumentan considerablemente, ya que el
fuerte crecimiento de la demanda nos brinda la posibilidad de desarrollar
y aumentar la producción del maíz.

Dicha investigación busca aprovechar el residuo del maíz que se

genera en su consumo, respondiendo a la necesidad de crear una
alternativa para hacer un mejor uso de los restos generados,
contribuyendo así con la mejora del ambiente, a través de la disminución
del almacenamiento de estos en áreas verdes y demás espacios del
ecosistema.

Así mismo en la presente investigación busca no competir con el

ámbito alimenticio y demás sectores dependientes del maíz, sino disponer
de mejor manera el desecho que se genera de su consumo e
implementarlo en una nueva aplicación.

Uno de los beneficios que los residuos orgánicos, tal como el de

maíz presentan, es el crecimiento de microorganismos a través de ellos,
que muy bien pueden aprovecharse para nuevas aplicaciones, tal es el
caso de la presente investigación, que pretende la obtención de celulosa.
La cual es el componente fundamental de la pared de las células
vegetales en plantas, madera y fibras naturales (Ascensión Sanz Tejedor,
2003).

El uso de los desechos agrarios como materia prima en la

obtención de derivados celulósicos (papel, acetato de celulosa,
carboximetilcelulosa) podría generar una variedad de beneficios a esta
industria, como diversificar la disponibilidad de material fibroso para la

10
fabricación de estos derivados, y a su vez aumentar el aprovechamiento
integral y valorización económica de residuos lignocelulósicos, los que
según Caparrós, S. (2009), se encontraban en toda o en su mayor parte,
por ensayar. De esta manera se estaría produciendo un uso eficiente de
recursos naturales y mejorando la economía del cultivo al darle valor
agregado.

En diferentes países se han estudiado una variedad de residuos

para la obtención de derivados celulósicos tales como el bagazo de zábila
(Hurtado, et al., 2005), desechos de café (Moya, M. et al., 1990), tallos de
girasol (Garrote, G. et al., 2005), sarmientos de vid (Angulo, V 2005) y
desechos del banano (Canché, G., Et al 2005). La continuidad de estudios
con la temática mencionada estimula el desarrollo investigativo de
Venezuela, país que presenta escasez de publicaciones en esta área de
estudio, la cual tiene la capacidad de ser un motor de arranque para la tan
anhelada independencia económica.

Además, la ejecución de la investigación permite generar

soluciones puntuales al control del desecho del maíz y por ende la
disminución de su impacto en la acumulación de desechos sólidos al
ambiente y dar disposición adecuada a lo que se considera actualmente
como un desecho.

1.4 Alcance de la Investigación

Esta investigación, tuvo como fundamento la obtención de celulosa

mediante uso del desecho del Zea Mays por fermentación en fase liquida
con Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae. Con la finalidad de dar
uso a los desechos alimenticios de la comunidad. Dichos desechos

11
utilizados fueron recolectados en Pueblo Nuevo, Municipio Petit del
estado Falcón. Las muestras que se realizaron y se analizaron en dicha
investigación fueron ejecutadas en los laboratorios de la Universidad
Nacional Experimental “Francisco de Miranda”, teniendo en cuenta que la
presente investigación se realizó en un lapso de siete meses (7) y los
mismos están comprendidos desde el mes de febrero de 2017 hasta el
mes de septiembre de 2017. Los cuales fueron:

 Laboratorio de investigación y apoyo docente (LIADSA) ciencias de

la salud ubicada en la calle Zamora edificio santa Ana 2do piso.

 Laboratorio de Química Orgánica del Complejo Académico El

Sabino.

12
 CAPITULO II

MARCO TEORICO

2.1 Antecedentes

Yegres y otros (2003). Revista de la Sociedad Venezolana de

Microbiología “Saccharomyces cerevisiae en la fabricación del licor
Cocuy”.

Este artículo se trató sobre trabajo de investigación en el proceso

de fermentación y destilación del mosto extraído de agave cocuy,
realizándose estudios de las levaduras fermentadoras, la optimización de
la producción de etanol y la utilización del residuo de la destilación
(vinaza) como medio de cultivo. Se estudió el efecto de la adición de
azúcar de las levaduras con mayor capacidad fermentativa
seleccionándolos e identificándolos mediante parámetros morfológicos y
metabólicos, la comparación de los niveles de consumo de azúcar de las
levaduras con mayor capacidad fermentativa; confirmándose el papel de
la S. cerevisiae UNEFM 16 en el proceso fermentativo espontáneo. En
esta investigación facilitó la levadura S. cerevisiae y además se pudo
conocer cómo se preparan los medios de cultivo en Sabouraud sólido y
líquido.

13
De Silva y Álvarez (2010), Utilizaron Saccharomyces cerevisiae para
la obtención de biomasa microbiana a partir de los residuos del
mesocarpo de naranja criolla (Citrus sinensis (L.) Osbeck).

La caracterización fisicoquímica del mesocarpo, arrojó: 68,07 % de

humedad; 0,58 % de cenizas; 7,96 % de fibra; 0,25 % de grasa; 24,31 %
de azúcares totales y 1,81 % de proteína. El residuo fue hidrolizado con
H2SO4 (9 % v/v), una relación S/L de 1/10, 11 durante 6 horas a reflujo
total. Las levaduras fueron cultivadas en medio hidrolizado a pH 5,5 y a
30°C, encontrándose en fase exponencial y 9,1x107 cel/mL. El
crecimiento microbiano presentó rendimiento de 0,14; bajo condiciones
aeróbicas, durante 24 horas a 200 rpm, utilizando concentración de
inóculo del 20 % del medio. El bioproceso registró consumo de sustrato
de 26,51 g/L y producción de biomasa de 3,77 g/L. Se caracterizó la
biomasa, obteniendo un 48,9 % de humedad, 1,11 % de carbohidratos y
49,88 % de proteína. Este estudio sirvió como referencia metodológica
para la caracterización fisicoquímica del residuo del Maíz.

Campos y Navarro (2014). Obtención de concentrado proteico de

origen microbiano a partir del desecho del maíz (Zeas mays) como
sustrato.

Los desechos de maíz fueron procesados hasta obtener una

harina, a la cual se determinaron parámetros fisicoquímicos: pH, cenizas,
proteína, extracto etéreo, lignina, celulosa, hemicelulosa y carbohidratos
totales; posteriormente se sometió a hidrólisis ácida con H2SO4 (6% v/v)
a una relación sólido/líquido 1/30, durante 2 h para extraer los azúcares
reductores, este hidrolizado sirvió de sustrato a las cepas de levadura. Se
utilizó la cepa UNEFM-16 y una cepa autóctona aislada del desecho del

14
maíz. El proceso de fermentación aeróbica se ajustó a una concentración
de inoculo de 20%, pH 6 y 30°C, durante 5 días. La biomasa microbiana
producida se estimó por métodos gravimétricos. El concentrado proteico
se obtuvo mediante extracción alcalina y precipitación isoeléctrica. El
desecho de maíz arrojó un porcentaje de cenizas de 2,62 %, 3,58 % de
proteínas, 2,38 % de extracto etéreo, 32,75 % lignina, 10,31 % celulosa,
30,80 % hemicelulosa y 27,94 % carbohidratos totales. El contenido de
azúcares reductores en el hidrolizado fue 0,69 %. La levadura aislada de
los desechos de maíz correspondió a una cepa del género
Saccharomyces cerevisiae. La biomasa microbiana obtenida arrojó 39,75
% de proteínas y rendimiento de 4 g/L. El concentrado proteico producido
reportó 67,17 % de proteína cruda. El aporte que dicha investigación
facilitó fue el desarrollo de la primera fase donde se estudió las
características fisicoquímicas de la harina del residuo de maíz. De igual
manera, esta investigación aportó información sobre la fermentación
aeróbica

Colina y Revilla (2014).Obtención de etanol a partir del mesocarpio

de la parchita (passifloraedulis) mediante el proceso de la
fermentación con Saccharomyces cerevisiae.

Se buscó obtener etanol a través del proceso de fermentación

alcohólica, usando como materia prima el mesocarpio de la parchita
(Passifloraedulis), preparándose dicho mesocarpio en forma de harina el
mismo se le hizo diversos ensayos analíticos con el fin de caracterizar sus
propiedades fisicoquímicas, arrojando como resultado de humedad 3,52
%, de cenizas 5,97%, de pH 6,04 y de 5ºbrix, al realizar el ensayo
cualitativo de Fehling se evidenció la presencia de glucosa.
Posteriormente se realizó la curva de crecimiento de la levadura, donde
se usó la levadura (Saccharomyces cerevisiae), determinándose como
tiempo de crecimiento optimo al tercer día de sembrar dicha cepa en un

15
medio de crecimiento Sabouraud liquido; seguidamente se prepararon 4
medios con harina en una disolución con agua destilada, y se procedió a
aplicar sobre cada medio, una hidrolización ácida, con el fin de romper las
cadenas de pectinas y obtener los azucares monosacáridos y disacáridos.
Para promover la fermentación se adicionó azúcar blanca comercial, de
esta manera se aumentan los grados Brix a un estándar adecuado para
que la fermentación se realice, ya que los grados Brix registrados en la
muestra no eran suficientes para que se realizase. se ajustó un pH de 4,5
y se procedió a evaluar las concentraciones de azucares de los medios
por refractómetro (Brix), a continuación se dispuso a preparar los medios
de fermentación adicionándose la cepa en el momento determinado de
crecimiento optimo, luego se puso a incubar por 5 días a una temperatura
de 34 º C, donde se procedió a destilar cada medio de fermentación,
aplicando a cada destilado los ensayos orgánicos respectivos para
conocer la naturaleza del alcohol obtenido, dándose como resultado
etanol (alcohol del tipo primario) a partir del mesocarpio de la parchita
(Passifloraedulis), donde se obtuvo un grado alcohólico de 67º y un pH de
4.6, por lo que se encuentra dentro del rango establecido a un alcohol
crudo bajo la norma COVENIN 3370-98 lo que resultó en un rendimiento
de 37,58 % para el proceso. Mediante el presente trabajo de grado se
obtuvo material metodológico correspondiente a las actividades
adecuadas para la siembra y crecimiento de la levadura (Saccharomyces
cerevisiae).

Jiménez y Lugo (2015). Evaluación de la capacidad

biotransformadora del Aspergillus SPP, por la actividad celulolìtica
del complejo enzimático celulasa, sobre papel bibliográfico, cartón y
celofán.

Se realizó el aislamiento de hongos filamentosos y levaduras,

siguiendo por muestreo directo utilizando medio solido PDA. Se obtuvo un

16
total de 79 aislados por observación de las características macroscópicas
y microscópicas de la colonia. Los hongos más frecuentes fueron: 43,03%
penicillium monoverticilado y 39,24% Aspergillus niger, seguido por un
10,3%Rhizopusspp, 3,8% de Aspergillus fumigatus, 2,53% Rhodotorula
spp y 1,27%Penicillium spp. Mediante técnicas cualitativas de la actividad
celulolíticas y proteolíticas, y cuantitativas mediante la liberación de
azucares reductores, permite la colonización de estos hongos
deteriorantes utilizando distintas fuentes de carbono (papel bibliográfico,
cartón y celofán). Este estudio se tomó como referencia para la
identificación macroscópica y microscópica del hongo Aspergillus niger,
así como también para la realización de la fermentación enzimática.

2.2 Bases Teóricas

2.2.1 Maíz (Zea mays).

El Maíz (Zea mays) es un cereal, una gramínea caracterizada por

poseer tallos en forma de caña, aunque macizos en su interior a
diferencia del resto de miembros de su familia que los tienen huecos
(Martínez, 2012).

Destaca fundamentalmente por su inflorescencia femenina llamada

mazorca, en donde se encuentran las semillas (granos de maíz)
agrupadas a lo largo 13 de un eje. La mazorca está cubierta por brácteas
de color verde y textura papirácea y termina en una especie de penacho
de color amarillo oscuro, formado por los estilos (Martínez, 2012).

17
 2.2.2 Usos del Maíz.

El Maíz constituye, junto con el arroz y el trigo, uno de los

principales alimentos cultivados en el mundo. Su uso no solo se centra en
la alimentación humana sino que forma parte de la alimentación animal
por sí mismo o constituyendo un ingrediente muy importante en la
composición de piensos para cerdos, aves y vacas. Los tallos de maíz,
una vez separada la mazorca, se pueden utilizar como forraje (Martínez,
2012).

Maíz, además de sus granos, se extrae harina para la confección

de pan de maíz, de tortas de maíz, arepas u otros productos de
repostería. También se obtiene aceite de usos alimentario o para la
industria de fabricación de pinturas o jabón (Martínez, 2012).

Desde un punto de vista industrial, esta planta es interesante,

además, para la obtención de endulzantes alimentarios (sirope de maíz) y
de alcohol que se produce por fermentación de su azúcar. Este se utiliza
en la fabricación de gasohol o carburol un combustible formado por
gasolina y alcohol. De esta manera, se consigue hacer funcionar los
vehículos con un carburante más barato que la simple gasolina (Martínez,
2012).

A partir de las partes no aprovechables, se obtiene furfural un

componente que se utiliza en la industria del caucho, resinas, plásticos,
insecticidas o líquidos para embalsamar (Martínez, 2012).

18
 2.2.3 Producción Actual Venezolana.

El maíz es el cultivo más importante del sector agrícola vegetal en

Venezuela y ha sido considerado como un rubro estratégico, dada su
importancia en la dieta diaria del venezolano (Yusmaira et al., 2011).

La producción de maíz en Venezuela es de gran importancia ya

que desde el punto de vista socio-cultural justifica plenamente la
necesidad de ofrecer a los agricultores alternativas de producción
económicamente rentables, ecológicamente compatibles y socialmente
aceptables; es decir, que de acuerdo con los principios de la agricultura
sostenible se aumente la diversidad genética para minimizar la
dependencia y se combinen prácticas tradicionales con tecnología
moderna. Es importante resaltar que Venezuela es el tercer país
productor de maíz de Latinoamérica (Yusmaira et al, 2011).

La producción de maíz en Venezuela experimentó un incremento

del 89% en el período 1995-2005, con valores de 1.160.000 y 2.200.000
toneladas, respectivamente. Para el año 2007, la meta del MPPAT fue
alcanzar las 2.500.000 toneladas, lo cual equivaldría a cosechar 750.000
hectáreas y un rendimiento de 3300 Kg. por hectárea. El valor real reflejó
la cosecha de 740.372 hectáreas, con un rendimiento de 3.472 Kg. por
hectárea y una producción de 2.570.869 toneladas (Yusmaira et al.,
2011).

19
 2.2.4 Parámetros Fisicoquímicos para Desechos
Agroindustrial.

 Cenizas

Es el residuo que se obtiene por incineración total de una muestra

a temperaturas superiores a 500°C durante 48h. Las cenizas representan
la fracción mineral del material original (González, 1989).

 Grasas

Es la masa total de sustancias extraídas mediante solventes de un

material orgánico, constituida en su mayor parte por triglicéridos de ácidos
grasos. El método consiste en la extracción de la grasa presente en la
muestra mediante el empleo de hexano, bajo condiciones prefijadas
(Norma COVENIN 1162, 1979).

 Azúcares Reductores

Los azúcares reductores son los monosacáridos o disacáridos que

pueden ceder electrones a otras moléculas y puede, por tanto, actuar
como agente reductor. La presencia de un grupo cetona (-CO-) o aldehído
(-CHO) libre permite a la mayoría de los monosacáridos y polisacáridos
actuar como azúcares reductores (De Jaime, 2011).

La determinación de azúcares se efectúa utilizando el reactivo de

Fehling, el cual, es una solución descubierta por el químico alemán
Herman Von Fehling. Las pruebas de Fehling, se basan en la capacidad
de los azúcares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+) y aportan
un ensayo sencillo para reconocer azúcares que pueden existir como
aldehído o cetona libre. Los azúcares que reaccionan se llaman azúcares

20
reductores, que pueden unirse de forma inespecífica a otras moléculas;
los que no reaccionan, son los denominados azúcares no reductores
(Pomeranz y Meloan, 2000).

Cuando un azúcar reductor se calienta en condiciones básicas se

degrada y algunos de los productos de degradación reducen los iones
cúpricos para formar oxido cuproso (Pomeranz y Meloan, 2000).

Una amplia variedad de métodos se han utilizado para determinar

azúcares reductores, las cuales, varían con el método de Fehling. Estas
variaciones dependen del tipo de alimento, en cualquier caso el principal
logro de modificaciones ha de mejorar la precisión de reducción y eliminar
cualquier factor que interfiera con la producción de óxido de cobre, de los
factores estudiados como: la alcalinidad del reactivo, la proporción, el
tiempo de calentamiento, la concentración del azúcar, deben ser los más
importantes (Facultad de Química UNAM, 2007).

 Carbohidratos Totales

Los carbohidratos son moléculas formadas por carbono, hidrogeno

y oxígeno. Todos los carbohidratos son azúcares pequeños, solubles en
agua como la glucosa y fructosa; o bien cadenas, como el almidón y la
celulosa, que se elaboran enlazando subunidades de azúcar. En la
naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacáridos
(azúcares simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades
monosacáridos) y polisacáridos (glúcidos poliméricos más grandes)
(Audesirk et al., 2003).

21
  Proteína Cruda

Su adecuada evaluación permite controlar la calidad de los

insumos proteicos que están siendo adquiridos o del alimento que se está
suministrando. Su análisis se efectúa mediante el método de Kjeldhal, que
evalúa el contenido de nitrógeno total en la muestra, después de ser
digerida con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador (FAO, 1993).
El método se basa en la determinación de la cantidad de Nitrógeno
orgánico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos
consecutivos, como lo son la descomposición de la materia orgánica bajo
calentamiento en presencia de ácido sulfúrico concentrado y el registro de
la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra (Nollet, 1996).

Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y

carbonización de la materia orgánica combinada con la oxidación de
carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico es transformado a
amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio. La
recuperación del nitrógeno y velocidad del proceso pueden ser
incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de
descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes
(peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la
adición de un catalizador (Nollet, 1996).

2.2.5 Microbiología

La microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología

como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños,
concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del
poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta
disciplina venga determinado por metodología apropiada para poner en

22
evidencia, y poder estudiar a los microorganismos. Precisamente, el
origen tardío de la microbiología con relación a otras ciencias biológicas, y
el reconocimiento de las múltiples actividades desplegadas por los
microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho
tiempo, de los instrumentos y técnicas pertinentes. Con la invención del
microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de una nueva
rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes
150 años su progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos
morfológicos microbianos y a los primeros intentos taxonómicos, que
buscaron su encuadramiento en el marco de los “sistemas naturales” de
los reinos Animal y Vegetal. (Serrato Pedro, 2012).

2.2.6 Hongos

Los hongos son organismos eucarísticos que realizan una digestión

externa de sus alimentos, segregando enzimas, y que absorben luego las
moléculas disueltas resultantes de la digestión. Los hongos son los
descomponedores primarios de la materia muerta de plantas y de
animales en muchos ecosistemas, y como tales se ven comúnmente en
alimentos de descomposición. Tienen una gran importancia económica
para los humanos; las levaduras son las responsables de la fermentación
de la cerveza y el pan, y el cultivo de estas es una gran industria en
muchos países. (Navas P. y Col 2013 referido por González Itmer,
2014).

23
 2.2.7 Estructura de los Hongos

La mayor parte de los hongos son inmóviles y poseen paredes

celulares semejantes a las de los vegetales en cuanto a su composición
química y estructura. Los hongos crecen como células independientes
(levaduras) o como colonias filamentosas multicelulares (mohos y
hongos).los hongos no son fotosintéticos y en consecuencia están
restringidos a una existencia saprofita o parasita. (Carter, g y Col.1994
referido por Carlos de León, 2003).

Las dos clases principales de hongos son los mohos y las

levaduras. El elemento principal de la forma vegetativa o en crecimiento
es la hifa, estructura tubular ramificada de 2 a 10 µm de diámetro. Las
hifas se entrelazan para formar un micelio. El micelio vegetativo consiste
de las hifas superficiales, en tanto que las hifas que sobresalen de la
superficie se designan como micelio aéreo. Las hifas del micelio aéreo
generan células reproductoras o esporas. Estas se conocen de manera
colectiva como cuerpos fructifícantes. Las hifas de muchos hongos están
divididas por paredes transversales llamado septas o tabiques. Algunas
hifas crecen dentro del medio de cultivo en tanto que otras proliferan
hacia arriba como “hifas aéreas”. Estas producen estructuras semejantes
a tallos que se conocen como conidióforos o esporangioforos que dan
origen a esporas asexuales llamadas conidios. Las esporas asexuales o
conidios son más resistentes a agentes físicos y químicos que las hifas.
(Carter, g. y Col. 1994 referido por Carlos de León, 2003).

24
 2.2.8 Reproducción de los Hongos

Los hongos se reproducen por medio de esporas microscópicas,

que crecen de flagelos y sus estructuras reproductivas inmóviles,
dispersadas por el viento o por animales. Suelen tener hifas aéreas en
contacto con la atmosfera, lo que permite que las esporas sean llevadas
por el viento a nuevas zonas. En algunos hongos las hifas aéreas forman
estructuras reproductivas grandes y complejas en las cuales se producen
esporas. Estas estructuras se denominan cuerpos fructíferos o
esporocarpos. (Salomón et. Al, 2000 referido por Zurisadal Carranza
2006).

Los hongos pueden producir esporas de manera sexual o asexual.

Las células fungales por lo general poseen núcleo haploide. En la
reproducción sexual, las hifas de dos tipos de apareamiento
genéticamente distinto se reúnen y sus núcleos se fusionan, formando un
cigoto diploide. En dos grupos de hongos (ascomicetos y basidiomicetos),
las hifas se fusionan pero los dos núcleos distintos no se fusionan de
inmediato, si no que permanecen separados dentro del citoplasma fungal.
Cuando la espora fungal entra en contacto con la fuente de alimento
adecuada, germina y comienza desarrollarse. Una hifa filiforme emerge a
la diminuta espora y crece ramificándose con frecuencia. (Salomón et. Al,
2000 referido por Zurisadal Carranza 2006).

2.2.9 Técnicas micológicas para el cultivo de hongos

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las

condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan
multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos

25
líquidos y sólidos en función de las características del medio; si se añade
algún agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos
(normalmente agar) y cultivos discontinuos y continuos en función de la
disponibilidad de nutrientes en el medio. Los más comunes son:
Sabouraud, lactritmel, malta agar, papa dextrosa agar, Czapek Dox.
(Casas Guillermo 1989).

La siembra de microorganismos en medios de cultivos, se realiza

en medio solido (agar) para aislar, cultivar y conservar la capa y en medio
líquido para purificar y activar el crecimiento, consiste en tomar una
pequeña muestra del hongo, inocularla en el medio de cultivo e incubarla
a una temperatura entre 25-30 ºC. Se repica o repite la siembra tantas
veces sean necesarias para purificar (eliminar contaminantes como:
bacterias u otros hongos) el microorganismo de interés. (Casas R. 1998).

2 Estría múltiple en superficie: Con un asa de siembra, previamente

esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y
se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con
agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión
para no dañar el agar. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar
la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra
zona de la placa haciendo nuevas estrías. Ese proceso se repite
sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estría. (Alcántara Luis, 2010).

3 En medio liquido con asa: Transferir asépticamente, con el asa de

siembra, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el
tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo
estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir

26
 la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48
horas a la temperatura optima de crecimiento. (Alcántara Luis, 2010).
4 Aislamiento mediante agotamiento por estrías: Se trata de un método
rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo de inoculo
sobre un medio solido contenido de una placa petri. El objetivo final
consiste en obtener un número reducido de distribuidas
individualmente sobre la superficie e la placa. Al incubar esta, cada
una de las bacterias originara una colonia. (Gamazo Carlos y Col.
2005).

2.2.10 Levaduras

Los hongos microscópicos unicelulares, cuya importancia radica en

la capacidad para realizar descomposiciones mediante fermentación de
diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azucares, produciendo
distintas sustancias. Su principal característica es el aparato reproductor
en forma de asca, es decir, una célula especial de paredes recias que
contienen en su interior, una serie de otras pequeñas células. Las
levaduras pertenecen a la familia de la sacaromicetaceas, cuyas
características comunes son, ser unicelulares, de forma esférica u ovoide,
pueden tenerse libre o formando colonias filamentosas, cubiertas de una
membrana celulósicas fina que va aumentando de tamaño a medida que
se desarrolla. Ciertas levaduras presentan un verdadero micelio
filamentoso semejante a los hongos (Garassini, 1964).

Las levaduras se encuentran muy difundidas en el suelo , en las frutas,

en el polvo, en las hojas de muchas plantas y en todos los mostos y jugos
azuarados.las formas mas comunes son las redondas , elipticas y
cilindricas , pero hay tambien formas intermediarias y algunas tambien
filamentosas (Garassini, 1964). Las levaduras están compuestas en
cantidades muy variables de carbono hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y de

27
acuerdo a los análisis realizados sobre las cenizas de la levaduras, se ha
encontrado que contienen de 65 a 70% de agua y 30 a 35 % de materia
seca. Los carbohidratos se encuentran en un 35% de la materia seca ,
representados especialmente por celulosa, glicógeno , gomas, azucares,
entre otros ; y las sustancias proteicas alrededor del 50%, representadas
por peptonas , polipéptidos, mono y diaminoácidos y derivados de la
purina , como también bases pirimidicas (Garassini, 1964).

 Saccharomyces cerevisiae

Es una de las levaduras más conocidas , también llamada levadura

de la cerveza, la cual, es un hongo unicelular , utilizado industrialmente en
la fabricación de pan , cerveza y vino .Además , es uno de los modelos
más adecuados para el estudio de problemas biológicos .También , es un
sistema eucariota , con una complejidad solo ligeramente superior a la de
la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas
.el rápido crecimiento, las dispersión de las células y la facilidad con que
se replican cultivos y aíslan mutantes , destaca por un sencillo y versátil
sistema de transformación de ADN(Garassini, 1964).

Saccharomyces cerevisiae representa una de las levaduras de primera

elección para la producción industrial de biomasa y etanol y que
careciendo de actividad b-galactosidasa, amilasa y glucamilasa, las
levaduras en gemación son incapaces de fermentar el almidón (Garassini,
1964).

28
  Nutricion de la saccharomyces cerevisiae

Las fuentes de carbono utlizadas por la levaduras varian desde los

carbohidratos hasta los aminoacidos . ademas , la capacidad de utilizar
ciertos tipos de azucares ha sido tradicionalmente empleada para la
caracterizacion de las distintas razas que esta especie presenta .Entre los
azucares que puede utilizar estan los monosacaridos como la glucosa,
manosa y galactosa, entre otros.tambien son capaces de utilizar
disacaridos como la maltosa y la sacarosa; y los trisacaridos como la
rafinosa.Uno de los azucares que no puede metabolizar es la
lactosa.Tambien es capaz de utilzar otras fuentes de carbono distintas a
carbohidratos y aminoacidos (Fernandez y Gomez, 2011).

Las levaduras, ademas de necesitar una fuente de carbono ,

necesitan tanto fuentes de nitrogeno como podrian ser el amonio, la urea
o distintos tipos de aminoacidos como fuente de fosforo.A las levaduras
se le denominan organismos anaerobicos facultativos , es decir que
pueden desarrollar sus funciones biologicas sin oxigeno y es aquí donde
tiene lugar la fermentacion , la cual, es considerada una reaccion
incompleta , donde solo se poduce alcohol y anhidrido carbonico, pero
con menos desprendimiento de energia(Fernandez y Gomez, 2011).

 Aislamiento de levaduras

El aislamiento de un microbio consiste en obtener su cultivo puro , la

cual, procede de la multiplicacion de individuos de la misma especie y a
partir de una sola celula .La obtencion de cultivo puro constituye el primer
paso par la realizacion de estudios microbiologicos de cualquier tipo y en
cualquier industria. Estos estudios microbiologicos , suelen abordarse

29
bajo tres aspectos fundamentales : el taxonomico,el fisiologico, y el
ecologico ( walter et al , 1998).

2.2.11 Curva de crecimiento del microorganismo

Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del

microorganismo a través del tiempo. Con base a ella, se determina
cuando se produce mayor cantidad de biomasa o de metabolitos
(primarios o secundarios). La figura 1, muestra las diferentes fases de
crecimiento de un microorganismo (Rodríguez, 2003)

Figura 1. Curva tipica de crecimiento microbiano .

Fuente: Tomado de ciencia de alimentacion por Granados (1984).

La fase de latencia tambien es conocida como fase lag; coincide

con el periodo de adaptacion del microorganismo a las nuevas
condiciones nuricionales y ambientales . Se presenta inmediatamente
despues de la inoculacion y su duracion depende del estado fisiologico

30
de la celula inoculada y de las condiciones ambientales (Rodriguez ,
2003).

En la fase logaritmica o exponencial, las celulas se multiplican a la

maxima velocidad y su crecimiento puede ser cuantificado con base en el
numero de celulas que se producen por unidad de tiempo. La velocidad
del crecimiento durante este periodo permanece constante y es
independiente de la concentracion del sustrato , siempre y cuando esta
sustancia se encuentree en exceso (Rodriguez , 2003).

La fase logaritmica termina cuando se produce alguna de estas tres

situaciones ;los nutrientes se agotan , las condiciones ambientales
indispensables para las celulas se modifican o cuando la celula produce
metabolitostoxicos que inhiben su reproduccion (Rodriguez , 2003).

En la fase estacionaria , la velocidad de crecimiento ( reproduccion )

del microorganismo es igual a la velocidad de muerte y se llega a un
equilibrio celular (Rodriguez , 2003).

La fase de muerte se inicia cuando los nutrientes que estan en el

medio de cultivo no son suficientes para que el microorganismo pueda
reproducirse . Otro motivo por los cuales empieza esta etapa es la
produccion , como parte del metabolismo, de sustancias toxicas que
impiden la multiplicacion de las celulas (Rodriguez , 2003).

2.2.12 Fermentación aeróbica.

La fermentación aerobia consiste en la asimilación de la materia

orgánica por parte de microorganismos en presencia de oxígeno y

31
nutrientes. Utiliza el oxígeno del aire (Ver figura 2). Es una oxidación
completa realizada por bacterias aeróbicas y es la que mayor energía
libera (Pérez, 2009)

Figura 2. Reacciones químicas en fermentación aeróbica.

Fuente: Procesos fermentativos. Pérez (2009).

La respiración aeróbica es un tipo de metabolismo energético en el

que los seres vivos extraen energía de moléculas orgánicas, como la
glucosa, por unproceso complejo en el que el carbono es oxidado y en el
que el oxígeno procedente del aire es el oxidante empleado. En otras
variantes de la respiración, muy raras, el oxidante es distinto del oxígeno
(respiración anaeróbica). La respiración aeróbica es el proceso
responsable de que la mayoría de los seres vivos, los llamados por ello
aerobios, requieran oxígeno. La respiración aeróbica es propia de los
organismos eucariontes en general y de algunos tipos de bacterias
(Bazán y Halil, 2011).

El oxígeno que, como cualquier gas, atraviesa sin obstáculos las

membranas biológicas, atraviesa primero la membrana plasmática y luego
las membranas mitocondriales, siendo en la matriz de la mitocondria
donde se une a electrones y protones (que sumados constituyen átomos
de hidrógeno) formando agua. En esa oxidación final, que es compleja, y

32
en procesos anteriores se obtiene la energía necesaria para la
fosforilación del ATP (Bazán y Halil, 2011).

La fermentación microbiana es el método más aplicado en la

biotecnología. La ventaja de la fermentación microbiana es que al utilizar
bacterias y levaduras estas crecen rápidamente en un medio a bajo costo,
ofrecen una alta expresión de los niveles de la proteína que deseamos
obtener, de las cuales ellos a veces secretan en el medio y esto hace más
fácil la purificación (Bazán y Halil, 2011).

2.2.13 Enzimas

Son las moleculas proteicas mas abundantes se encuetra en todo tipo

de celulas y catalizan las reacciones quimicas de los seres vivos (
biocatalizadores). Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficacez
(aumentan la velocidad de las reacciones entre 10 3 y 109 veces ) no
llevan a cabo recciones que sean energeticamente desfavorables , no
modifican el sentido de los equilibrios quimicos , sino que aceleran su
consecucion . simplente se alcanza mas rapido su estado de equilibrio
(Molina, Jose , 2009).

Las reacciones quimicas organicas en una celula son lentas en

condiciones de temperatura y presion normales , por ende ,las enzimas
ayudan acelerando las velocidades de dicha reaccion quimica . Las
enzimas se caracterizan por tres propiedades fundamentales: estan
presentes enpequeñas cantidades , aumentan la velocidad de las
reacciones quimica sin que se consuman o alteren por la reaccion,
aumentan la velocidad de las reacciones quimicas sin alterar el equilibrrio
quimico entre los reactantes y los productos (Rebolledo Luis , Col. 2005).

33
 - Propiedades Químicas y Físicas de las Enzimas

Como las enzimas son proteínas combinadas con otros grupos

químicos, poseen las mismas propiedades y características de las
proteínas: se desnaturalizan con el calor, precipitan con el etanol o
concentraciones elevadas de sales inorgánicas como el sulfato de amonio
y no dializan a través de las membranas semipermeables (Alquicira,
2003).

Algunas enzimas no requieren para su actividad más grupos

químicos que residuos de aminoácidos; otros requieren un componente
químico adicional (que se necesita de su adición para activar su función
enzimática) llamado cofactor el cual puede ser uno o varios iones
inorgánicos tales como Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+: o un complejo orgánico o
metalorgánico denominado coenzima (generalmente el complejo de la
vitamina B). Algunas enzimas requieren tanto una coenzima como uno o
más iones metálicos unidos covalentemente a la proteína enzimática,
éste se denomina grupo protético. Una enzima complejo catalíticamente
activo junto con su coenzima y/o iones metálicos se denomina
holoenzima. La parte proteica de tal enzima se denomina apoenzima o
apoproteína (Alquicira, 2003).

- Clasificación de las Enzimas

Debido al número siempre creciente de enzimas descubiertas, se

ha adoptado por acuerdo de la Unión internacional de Bioquímica un
sistema de nomenclatura y clasificación de enzimas (Tabla 1), Este
sistema distribuye las enzimas en seis clases principales, cada una de
ellas con diferentes subclases, según el tipo de reacción catalizada
(Alquicira. 2003).

34
 Tabla 1. Principales grupos de Enzimas
Clases de Reacción química catalizada Nombre de la
enzimas enzima
Oxido-Reductasas Reacción de óxido – reducción Glucosa oxidasa

Transferasas Transferencia de grupos Glucoquinasa

funcionales (glucosilos, fosfatos)
Reacciones de hidrolisis.
Transforman polímeros en
monómeros.
Hidrolasas Celulasas
Actúan sobre:
Enlaces C=O

Liasas Adición a dobles enlaces Descarboxilasa

(C=O; C=C; C=N)

Isomerasas Reacción de isomerización Fosfoglucosa

isomerasa

Ligasas Formación de enlaces, con Piruvato

aporte de ATP carboxilasa
(C=O; C=S; C=N; C=C)
Fuente: Albarán, M. 2008.

2.2.14 Celulosa

La celulosa es el componente más abundante que existe sobre la

tierra, es producida por las plantas formando parte de su pared celular. La
celulosa es uno de los materiales más utilizados desde tiempos remotos,
y en la actualidad es la fuente de combustibles orgánicos, compuestos
químicos, fibras y materiales necesarios para cubrir necesidades
humanas tales como el papel, la pulpa, las maderas, entre otros. La
celulosa se encuentra embebida en una matriz compuesta de un número
de moléculas (pectinas, proteínas, almidón y lípidos), y la hemicelulosa y
la lignina que comprenden del 20 al 35%, y del 5 al 30% en peso seco,
respectivamente (Martínez y Col, 2008).

35
 Las Celulasas no requieren cofactor en la actividad enzimática.
Ellas pueden ser refrigeradas o congeladas por años sin una pérdida
significativa de actividad. Sin embargo, el uso de Celulasas mesófitas en
condiciones de reacción optima (50ºC y pH 4.8) resulta en una pérdida
significativa de su actividad, en contraste, las Celulasas obtenidas de
microorganismos termófilos permanecen estables y activas a
temperaturas que exceden los 50ºC (Himmel, 1994).

Las enzimas del complejo celulasas han sido divididas en tres

grandes grupos, de acuerdo al sitio donde cortan la fibrilla de celulosa:
 Endo- β-glucanasas o 1,4-β-D-glucanglucanohidrolasas
(endoglucanasas)
 Exo-β-glucanasas o 1,4- β-D-glucanglucohidrolas y 1,4-β-D-
glucancelobiohidrolasas (exoglucanasas)
 β – D-glucosidoglucohidrolasas (b- glucosidasas).

2.2.15 Celulasas totales

El sistema de celulosa está formado por endoglucanasa,

exoglucanasa y β-glucosidasas, las cuales hidrolizan sinérgicamente la
celulosa cristalina. La evaluación de la actividad de las enzimas
celulolíticas es con frecuencia evaluada usando sustrato insolubles, los
cuales incluyen: papel filtro Whatman Nº1 y celulosa miro cristalina. La
heterogeneidad de la celulosa insoluble y la complejidad del sistema de
celulasas causan problemas en l medición de la actividad total.
Resultados experimentales muestran que la estructura heterogenia d la
celulosa insoluble induce la disminución en la tasa de hidrolisis en corto
tiempo (menos de 1 hora) provocando desactivación de las celulasas.
(Gaitán y Pérez 2007).

36
 2.2.16 Producción de Celulosas

Los procesos de obtención de celulasas consisten en la utilización

d un microorganismo que tenga la habilidad d sintetizar fácilmente las
enzimas y un sustrato inductor que promocione la formación del complejo
enzimático. Entre los hongos más utilizados en la producción de
azucares fermentables se encuentran las especies Trichoderma,
Aspergillus y penicillium, aunque también se pueden utilizar bacterias
degradadoras como es el caso de las clostridium, cellulomonas, bacillus,
thermomonospora entre otros (Paredes, D. 2010). En la tabla Nº 2 se
encuentran consignados algunos de los microorganismos utilizados para
la producción de celulasas.

Tabla 2. Microorganismos usados para la Producción de Celulasas

Microorganismos Sustrato Escala Productividad
CellulomonasBiazotea Bagazo,
tallo de 37.5 IU/L/h en CMC,
algodón, 1L 17,5 IU/L/h FPAsa
paja de
trigo,
celobiosa
, CMC y
papel de
filtro.
Aspergillus Fumigatus Paja de Fermentació 240 U/g sustrato
trigo, n en estado endoglucanasas,
bagazo, solido 9,73 FPAsa
paja de
arroz.
AcremoniumCellulolytic Paja de Matraz 10,8U/ml en papel d
us arroz filtro.
Penicilliumechinulatum Bagazo Fermentació 32,9 U/dm/g en
de caña, n en estado papel d filtro.
salvado solido
de trigo

37
 Aspergillus niger, A. Jacintos 250 ml 0,9 U/mg Casa y 0,8
nidulans de agua U/mg proteína de
avicelasa 0.3 U/ml
Aspergillus niger MS82 CMC de Matraz EndogluconasaFPAs
baja e 1,33U/ml CMCase
densidad 19,7
Neurosporacrassa Paja de Matraz U/ml, BGL 0,58 U/ml
trigo
Trichodermareesei Sauce Fermentador FPAse 108 U/g
pretratad 22L celulosa
o
Trichodermareesei RUT Avicel
Fermentador FPAse 1,8 U/ml
C30
Fuente: (Suesca, A.2012)

Actualmente se ha propuesto un modelo generalizado de

regulación de la producción de celulasas, el cual se propone que es
controlado por dos mecanismos por un lado, se encuentra la inducción
por sustratos naturales , como celulosa y por otro lado la represión por
fuentes de carbono de bajo peso molecular como glucosa y celobiosa .El
modelo además sugiere la existencia d un nivel basal de enzimas
.inicialmente el microorganismo sintetiza y exporta a su superficie celular
bajas cantidades de enzimas ,las cuales inician la hidrolisis del sustrato y
producen oligosacáridos que entran la célula , convirtiéndose en
verdaderos inductores que encienden la transcripción de los de los genes
respectivos (Ponce y Pérez, 2012) .

Las tecnologías basadas en las celulasas se han centrado en la

investigación de su actividad, pero actualmente se encuentra una
tendencia a buscar sustratos adecuados y sostenibles para su
producción. El sustrato lignocelulósicos debe ser económico, fácilmente
procesable y viable en grandes cantidades y composición debe ser
adecuada tanto para la hidrolisis como para la producción d enzimas

38
celulolíticas. La producción de las enzimas in situ, en vez de utilizar
enzimas comerciales puede mejorar la economía del proceso global
(Suesca, A.2012)

Figura 3. Modo de acción del complejo enzimático celulasa

Fuente: Albarrán, M. 2008.

2.2.17 Uso de las celulasas

El interés en el uso de celulasas, comenzó alrededor de la década

de los 50, debido al potencial encontrado en la conversión de biomasa en
glucosa y otros azúcares solubles. Esta actividad enzimática tiene
aplicaciones en la industria textil (procesos biostoningy biopolishing) para
dar apariencia de desteñido o de gastado a las prendas, tratamiento de
las telas para eliminar imperfecciones de las fibras, preparación de la tela
previa a tinciones o impresiones para obtener mayor afinidad con los
pigmentos y desfibrilación realizada antes y después del teñido (Suesca,
A. 2012).

39
 También es un componente de los detergentes, alcanzando efectos
como: remoción de manchas de suciedad atrapadas en las fibrillas de la
celulosa, suavidad permanente de la ropa, mejoramiento del color por la
remoción de pelusas formadas por la fibrilación, desfibrilación con efecto
anti depositante en la suciedad; en la industria papelera se usa en el
blanqueamiento de pulpas, en la industria alimenticia se utiliza en la
extracción de jugos de frutas y verduras, en la filtración de mostos y en la
extracción de aceites comestibles, en la industria de la cerveza para
mejorar la calidad de la cerveza, en la industria del vino para obtener
vinos de mejor calidad y estabilidad.

Además, se usa en la hidrólisis parcial de materiales

lignocelulósicos para mejorar la digestión de rumiantes (Ponce y Pérez,
2012).

2.2.18 Enzimas en Venezuela

Las enzimas se utlizan en la industria desde hace muchs años

tradicionalmente fueron extraidas de plantas y animales; sin embargo , su
produccion por fermentacion va en aumento ; en la actualidad se estima
que el 75% de las ezimas de nivel comercial se produce por via
microbiana, mientras que el otro 25% corresponde amilasas de cereales
terminados , reninas para quesos y proteasas de origen vegetales (
Illanes 1994 referido por Hernandez Alicia y col 2003).

A lo largo de muchos años los paises Latinoamericanos han mostrado

una produccion limitada de enzimas que pudiecen ser empleadas a nivel
industrial . En lo que concierne a Venezuela la situacion interna es similar

40
a la que presentan otros aises latinoamericanos ( fundacion CIEPE ,2007
referido por Dayana muzziotti 2008).

En nuestro pais , los requerimientos del mercado local son elevados y

debido aque la produccion nacional de enzimas es practicamente
inexistente , la demanda debe ser satisfecha con importaciones . el
mercado Venezolano de enzimas se clasifica como un mercado de
competencia imperfecta , ya que existen pocos ofertantes . pero los
mismos influyen en el precio de las enzimas en la industria . Actuando
como precio-oferta ya que por esos precios se regira el mercado nacional
( fundacion CIEPE ,2007 referido por Dayana muzziotti 2008).

Las empresas localizadas en territorio nacional , que tienen como

fucion producir y comercializar enzimas para satisfacer las necesidaes del
mercado nacional son : Girber de Venezuela ubicada en San Antonio De
Los Altos Estado Miranda , laboratorio PHARMASTEST ubicado en
Guarenas Estado Miranda biza ubicado en Santa Lucia Estado Miranda,
lavital ubicado en Ocumare Del Tuy Estado Miranda, Tecnogranos
Ubicado en Choao Caracas( fundacion CIEPE ,2007 referido por Dayana
muzziotti 2008).

2.3 Bases Legales

El trabajo se llevo a cabo bajo los lineamientos establecidos por la

norma comprendida en la comision veneolana de normas industriales
(CONVENIN) y la asociacion de quimica analista oficiales (A.O.A.C).
Entre las A.O.A.C tenemos:

41
  Determinacion de proteinas (A.O.A.C 2057).
 Determinacion de humedad (A.O.A.C 14004).
 Determinacion de cenizas (A.O.A.C 31012).
 Determinacion de pH (A.O.A.C 1990).

2.4 Teminos Basicos

Aerobio: Es un organismo que requiere oxigeno libre en el medio

ambiente para subsistir (Fraume, 2006).

Absorbancia: Es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una

muestra. La absorbancia de una solución es proporcional a su
concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz
con ellas. (Abril N. y otros ,2008).

Anaeróbico: Referente a los seres vivos y a los procesos vitales

que ocurren en ausencia de oxigeno libre o en medios de baja presión
parcial de este (Fraume, 2006).

Azucares: Son hidratos de carbono, están compuestos solamente

por carbono, oxigeno e hidrogeno.

Bacterias: Las bacterias son microorganismos unicelulares que

presentan un tamaño de algunos micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 μm)
y diversas formas incluyendo esferas, barras y hélices. Las bacterias son
procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las células eucariotas (de

42
animales, plantas, entre otros), no tienen núcleo ni orgánulos internos.
Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano,
muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de
desplazamiento y son móviles.

Biomasa: Es aquel material orgánico biodegradable originado de

plantas, animales y microorganismos (Salinas y Hernández, 2008).

Celulosa: Es polímero natural, constituido por una larga cadena de

carbohidratos polisacáridos. La estructura de la celulosa se forma por la
unión de moléculas de β-glucosa (Cortinez, V.2010).

Cenizas: Es el producto de la combustión de algún material,

compuesto por sustancias inorgánicas no combustibles, como sales
minerales. Este representa la fracción mineral del material original.

Cepa: Conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo

patrimonio genérico. Existentes en una colonia o cultivo (Fraume, 2006).

Colonia: Se define como una masa visible de microorganismos,

todos originados d una sola célula madre, de manera que una colonia
constituye Clones de bacterias, todas genéticamente similares (Garassini,
L.1964).

43
 Concentración: es la magnitud fisicoquímica, la cual permite
conocer la proporción entre el soluto y el disolvente en una disolución.
(Aldabe y Cols, 2006).

Desecho: Denominacion generica de cualquier tipo de producto

inservivle , residual o basura procedente de las diversas actividades
humanas ( Fraume , 2006).

Enzima: Son moleculas cataliticas (proteina) que incrementan la

velocidad de reaccion quimica (Suesca, A. 2012).

Espectrofotometro : Es equipo que prmite determinar la

concentracion de un compuesto n solucion . El que se puede seleccionar
la longitud d honda de la luz qu pasa por una solucion y medir la cantidad
de luz absorbida por la misma (Abril N. y otros ,2008).

Fermentacion: Proceso en el que los microorganismos producen

metabolicos o biomasa , a partir de la utilizacion de sustancias organicas ,
en ausecia o presencia de oxigeno ( Fraume , 2006).

Hidrolisis: Descomposicion de sustancias organicas e inorganicas

complejas e otras mas sencillas por accion de agua o sutancias quimica
(Castells, 2000).

44
 Incubación: Intervalo de tiempo entre la exposición a un agente
infeccioso y la aparición del primer signo o síntoma de la enfermedad
(Casas, 1972).

Inocular: Introducir en el medio, organismo por medios artificiales,

una pequeña cantidad de un producto que contiene bacterias y que se
toma, por ejemplo, para hacer un cultivo, una resiembra o infectar
determinados animales de experimentación.

Levadura: Son cuerpos unicelulares ,generalmente de forma

esferica de un tamaño que ronda 2 o 4 µmy que estan presentes de forma
natural en algunos productos como frutas, cereales y verduras
(Garassini,1964).

Maíz: Planta herbácea gramínea de hojas largas, planas y

puntiagudas, tallos rectos, que produce mazorcas con granos gruesos,
amarillos y nutritivos (Morris y López, 1966).

Proteína: Son las moléculas orgánicas más abundantes en el

interior de las células, pues constituyen el 50% o más de su peso seco.
Son fundamentales en todos los aspectos de la estructura celular y de su
función (Fraume, 2006).

Sustrato: Superficie sobre la cual habitan organismos como los

hongos y los musgos (Kappelle et al, 2003).

45
 Reproducción asexual: La reproducción asexual, también llamada
reproducción vegetativa, consiste en que de un organismo se desprende
una sola célula o trozos del cuerpo de un individuo ya desarrollado que,
por procesos mitóticos, son capaces de formar un individuo completo
genéticamente idéntico a él. Se lleva a cabo con un solo progenitor y sin
la intervención de los núcleos de las células sexuales o gametos.

Saccharomyces cerevisiae: es un hongo unicelular, un tipo de

levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino.
El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra
diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación.

Sustrato: Es todo material que presenta, importantes propiedades

químicas, microbiológicas, físicas y un contenido mineral, para ser
aprovechadas en la obtención de productos de interés comercial.

Tramitancia: Es una magnitud que expresa la cantidad de energía

que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo (potencia).

46
 CAPITULO III

MARCO METODOLOGICO

3.1 Tipo y Diseño de la Investigación

Una investigación puede definirse como un esfuerzo que se

emprende para resolver un problema, claro está, un problema de
conocimiento. (Sabino, 2000). El nivel de investigación se refiere al grado
de profundidad con que se aborda un fenómeno u objeto de estudio.
(Fidias G. Arias, 2006). La investigación científica es un proceso metódico
y sistemático dirigido a la solución de problemas o preguntas científicas,
mediante la producción de nuevos conocimientos, los cuales constituyen
la solución o respuestas a tales interrogantes. (Fidias G. Arias, 2006).

La propuesta de obtención de la enzima por fermentación en fase

líquida del desecho de Z. mays a partir de A. niger y S. cerevisiae, se
consideró una investigación descriptiva ya que describe el hecho o
fenómeno en estudio así como las características que el desecho posee y
los beneficios que estas presentan al ser implementada como nueva
materia prima en diversos procesos industriales, correspondiendo así con
los planteamientos de Arias (2006) que define el nivel descriptivo como
“La investigación descriptiva consiste en la caracterización de un hecho,
fenómeno, individuo o grupo, con el fin de establecer su estructura o
comportamiento.

Los resultados de este tipo de investigación se ubican en un nivel

intermedio en cuanto a la profundidad de los conocimientos se refiere.”De
igual manera también se reconoció la presente investigación dentro del

47
nivel exploratorio, dado que es un tema poco desarrollado y estudiado
donde se busca implementar nuevas alternativas y nuevas tecnologías
para adquirir un producto de buena calidad. Según Arias (2006) “La
investigación exploratoria es aquella que se efectúa sobre un tema un
objeto desconocido o poco estudiado, por lo que sus resultados
constituyen una visión aproximada de dicho objeto, es decir, un nivel
superficial de conocimientos.”

Así mismo Arias (2006) El diseño de investigación es la estrategia

general que adopta el investigador para responder al problema planteado.
En atención al diseño, la investigación se clasifica en: documental, de
campo y experimental. Por ende el presente estudio se considero una
investigacion experimental, debido a que se manipularon diferentes
variables independientes observándose los efectos de estas sobre las
variables independientes.

Lo que permitio establecer las condiciones de operación para

lograr el crecimiento del hongo y levadura con la finalidad de obtener la
enzima. Considerando de mismo modo el concepto de investigacion
experimental definido por Arias(2006). “La investigacion Experimental es
un proceso que consiste en someter a un objeto o grupo de individuos a
determinadas condiciones, estimulos o tratamientos (variable
independiente), para observar los efectos o reacciones que se producen
(variabe dependiente).”

48
3.2 Población y Muestra

La población, o en términos más precisos población objetivo, es un

conjunto finito o infinito de elementos con características comunes para
los cuales serán extensivas las conclusiones de la investigación. Esta
queda delimitada por el problema y por los objetivos del estudio. (Fidias
G. Arias, 2006).

Para el presente estudio se estudiaron los desechos de maíz

localizados en la comunidad de Pueblo Nuevo, municipio Petit del estado
Falcón, considerada una población infinita, dado que se desconoce el
total de los elementos que la conforman, por cuanto no existe un registro
documental de estos.

La muestra es un subconjunto representativo y finito que se extrae

de la población accesible. (Fidias G. Arias, 2006).Tamayo, T. Y Tamayo,
M (1997) confirman el fundamento anteriormente planteado ya que
definen a la muestra como “el grupo de individuos que se toma de la
población, para estudiar un fenómeno estadístico¨.

Para el presente trabajo de investigación, se tomó una muestra

tipo: Muestreo aleatorio simple, la forma más común de obtener una
muestra es la selección al azar. Es decir, cada uno de los individuos de
una población tiene la misma posibilidad de ser elegido. (Tamayo y
Tamayo, 1997).

49
3.3 Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos

Se entendera por tecnica el procedimiento o forma particular de

obtener datos o informacion. (Fidias G. Arias, 2006).Mientras, Un
instrumento de recolección de datos es cualquier recurso, dispositivo o
formato (en papel o digital), que se utiliza para obtener, registrar o
almacenar información.” (Fidias G. Arias, 2006).

El analisis documental fue una de las tecnicas empleadas para la

recoleccion de los datos, durante la ejecucion de la investigacion se
realizó constantemente la revision bibliografica a traves de textos,
normas, publicaciones, investigaciones, paginas web, todos estos
instrumentos aportaron informacion para obtener la enzima a partir del
desecho del maiz.

Para la presente investigación se empleó la técnica de la

observación que permitió tener una visión clara de lo que sucede en la
investigación, y la más utilizada por los ingenieros y en los trabajos de
este tipo de investigación. Según, Arias (2006) “La observación es una
técnica que consiste en visualizar o captar mediante la vista, en forma
sistemática, cualquier hecho, fenómeno o situación que se produzca en la
naturaleza o en la sociedad, en función de unos objetivos de investigación
preestablecidos.”

En cuanto al analisis experimental la tecnica empleada fue la

observacion directa , con los ensayos realizados a las muestras
recolectadas, donde se utiliza el material y los equipos proporcionados
por el centro de investigacion tecnologica (CITEC) y el laboratorio de

50
investigacion y apoyo Docente Santa Ana (LIADSA). Los datos obtenidos
fueron ordenados, analizados e interpretados en tablas identificadas .
Tambien se utilizaran graficos, fotografias y diagramas con el objeto de
analizar logicamente las fuentes experimentales , apoyandose en los
basamentos teóricos y en las normas que rigen cada ensayo. Para lo cual
se emplearon los metodos de experimentacion por duplicado y triplicado,
de manera que se pueda dar mayor confiablidad a la investigacion.

3.4 Fases de la Investigación

Fase 1. Caracterización Fisicoquímica del desecho de maíz (Z. mays).

Recolección y tratamiento del desecho de maíz.

Los desechos del maíz fueron recolectados en las casas de

habitación y mercados del municipio Petit del Estado Falcón. Ya que en
esta zona se venden y degustan muchos productos a partir del maíz. Los
desechos del maíz fueron lavados y molidos a 650 rpm en un Molino de
Bolas 39Planetario modelo Retsch PM100. La harina obtenida se
conservó a temperatura ambiente (26-30ºC) en bolsas plásticas cerradas
herméticamente. Los parámetros fisicoquímicos se determinaron según
los métodos y procedimientos descritos en la tabla 3.

51
 Tabla 3. Ensayos fisicoquímicos aplicando métodos a diferentes
parámetros
Parámetros Método
pH Electrométrico
A.O.A.C 1990
Humedad A.O.A.C 14.004
Proteína Total Kjeldhal
Grasa Total Soxtec
Ceniza Total A.O.A.C. 31.012
Fibra Total Norma COVENIN (1194-79).
Carbohidratos Totales Lane-Eynon
Fuente: CITEC-Propia (2017)

Fase 2. Identificación de A niger y S. cerevisiae mediante el estudio

macroscópico y microscópica de sus estructura reproductora.

Para dar inicio a dicha fase, primeramente se ejecutó una serie de

actividades, como lo son:

1. La esterilización de los materiales de vidrio y medios de cultivo

aseguró un estado de asepsia que permitió trabajar sin dificultades.
Siendo utilizada la esterilización por calor húmedo y/o a presión de
vapor de agua que se consigue con el uso de una autoclave
Chamberlat.

2. Se prepararon los medios de cultivos sólidos y líquidos, adecuados

para los microorganismos. Procedimiento (Anexo A )

52
 3. Para la activación inicial de la levadura y del hongo se sembraron y
repicaron la S. cerevisiae y el A. niger con ayuda de azas de
platino esterilizadas a la flama, con la finalidad de conservar el
microorganismo en el medio de cultivo, contenido en los tubos de
ensayo y en las placas de Petri, los cuales fueron tapados y
sellados.

4. Identificación del hongo filamentoso, se estudió a simple vista el

crecimiento radial y las características macroscópicas en un
periodo de 12 días. Considerando aspecto, textura y color de las
colonias de hongos aisladas. Casa G. (1989).Para el estudio
microscópico, se aplicó el método de Riddel - Rivalier, el cual
consistió en colocar en una placa Petri con papel absorbente
húmedo con un ángulo o soporte y una capsula de Petri sobre ella
un cuadro de agar, sembrado por los laterales colocando un cubre
objeto por dos semanas. Transcurrido el tiempo, fueron
identificadas las características microscópicas Casa G. (1989).Con
ayuda de un microscopio Axioskop Zeiss a 400X.

Fase 3. Determinación de la cinética de crecimiento A. niger y S.

cerevisiae

La cinética de crecimiento determinada para A. niger se realizó a

partir del método radial, el cual consistió en la preparación de un medio de
cultivo de composición definida Czapek Dox en estado sólido, medio rico
en minerales y con concentraciones de fuente de carbono (sacarosa) de
(5, 10 y 15) %.

53
 Para ello se procedió a disolver los compuestos por calentamiento
a 115 ºC durante 20 minutos. Para ser luego esterilizado en autoclave de
Chamberlat a 121ºC por 15min a 15psia. Luego se vertió en las placas de
Petri en condiciones de asepsia. Seguidamente, se sembró el hongo
filamentoso en estudio. Por un periodo de doce (12) días se observó
diariamente, se midió a través de un vernier y se registró el tamaño de
sus colonias y se graficó la curva de crecimiento del mismo en una hoja
de cálculo para Windows.

La determinación de la cinética de crecimiento de la levadura Se

utilizó cultivo de composición definida Czapek Dox en estado líquido,
medio rico en minerales y con concentraciones de fuente de carbono
(sacarosa) de (5, 10 y 15) %., se realizó a cada hora para medir la
absorbancia con una longitud de onda de 420nm en un espectrofotómetro
MAPADA V-1000 Luz UV, se creó la representación gráfica de los datos
en una hoja de cálculo para Windows.

Fase 4. Comprobar la presencia de proteínas totales en la

fermentación del desecho Z. mays a partir de A. niger y S. cerevisiae.

El método de Biuret es la técnica más simple para la

determinación de proteínas solubles. Las sustancias que poseen 2 o más
enlaces peptídicos forman un complejo colorado purpura con sales de
cobre alcalinas. La reacción de Biuret es una reacción coloreada debido a
la formación del complejo Cu en un medio alcalino con compuestos que
poseen –CO-NH. El complejo se basa en la desprotonacion de los grupos
amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de
un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los
átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Procedimiento (Anexo B )

54
 La actividad proteolítica para cada uno de los fermentados por los
diferentes microorganismos se midió la absorbancia con una longitud de
onda de 540nm en un espectrofotómetro MAPADA V-1000 Luz UV.

Fase 5. Determinación cuantitativa de presencia de la celulosa

en la fermentación en fase liquida del desecho de Z. mays a partir de
A. niger y S. cerevisiae.

Preparación del inoculo: Las cepas seleccionadas fueron

sembradas en frascos de 250 mL con Czapek Dox, hasta la esporulación
para A. niger y cremosidad para la S. cerevisiae, se dejó incubar a
temperatura del laboratorio 28-30 °C, por 8 días. Posteriormente se
cosecharon las esporas y células de levaduras con tween 80 al 0,1 %
estéril, y recolectadas en un frasco estéril para realizar el conteo como se
explica a continuación (Llacza, 2012; Alquicira, L. 2013)

Conteo de células: Una vez cosechadas y recolectadas las esporas

en un frasco estéril, se tomó aproximadamente 0,1 mL de la suspensión
de esporas A. niger y células de S. cerevisiae y se depositó en la cámara
de Neubauer para realizar el conteo de esporas con la ayuda del
microscopio óptico (Ver anexo C)

Fermentación enzimática: En frascos de 125 mL, se colocó 50mL

de medio de composición definida y fuente de carbono (sacarosa) 10%,
La inoculación se realizó a partir de la suspensión de esporas a razón de
2,5x107 esporas/ mL y las condiciones de incubación fueron temperatura
30 °C, con suministro de aire a razón de 2 L/ min, bajo agitación de 300

55
rpm, durante 7 días para A. niger y 24horas para S. cerevisiae.
Finalmente los caldos de cultivo se recuperaron mediante filtración para
separar el micelio y realizar el proceso de extracción y purificación de las
enzimas (Ojeda, L. y col. 2011).

Extracción de enzimas: Al tiempo definido de fermentación se

centrifugó cada matraz para separar el sobrenadante o extracto
enzimático 5 minutos a 12000rpm y se filtró.

Prueba cuantitativa de azúcares reductores totales por la técnica

del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS): La actividad del sistema enzimático
en el complejo celulolítico puede medirse determinando la cantidad de
glucosa liberada mediante DNS. Esta técnica demuestra la presencia del
grupo carboxilo libre (C=O) de los azúcares reductores que implica la
oxidación del grupo funcional aldehído de la glucosa (Miller, 1959).

La lectura de la prueba del DNS, es altamente influenciada por las

mismas condiciones de la prueba, como la temperatura del agua de
calentamiento, la transferencia del calor, el tiempo de reacción, la
proporción de glucosa, presente y el tiempo del reactivo,(Gaitán y Pérez,
2007). Esta lectura se realizó en un espectrofotómetro MAPADA V-1000
Luz UV.a una longitud de onda de 480nm. La curva de calibración se
realizó con medio Czapek Dox con azúcar comercial.

56
 CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1 Caracterización fisicoquímica del maíz (Zea mays)

En la tabla 4 se muestran los resultados correspondientes a la

caracterización fisicoquímica del desecho del maíz.

Tabla 4. Caracterización fisicoquímica del maíz.

Resultados obtenidos *Rangos referenciales de

Parámetros de residuos de los parámetros
Z. mays (%) (%)

Cenizas 1.98 <5

Proteína 2.45 2.3 – 6
Fibra Cruda 24 17 – 42
Carbohidratos 23.03 15 – 30
Grasas 0.2 0.7 – 4
Humedad 9.2 8 – 15
Fuente: Propia 2017, * Rodríguez J. 2009

Los resultados obtenidos de la caracterización fisicoquímica del

desecho de maíz se encuentran dentro de los rangos consultados según
Rodríguez J (2009) de las diferentes investigaciones de materiales
lignocelulósicos evaluados.

Las cenizas indica la presencia de minerales (magnesio, sodio,

potasio y entre otros) del material original, el porcentaje obtenido en la
materia prima fue de 1.98 %. Es un valor bajo pero se encuentra dentro

57
de los rangos normales ya que según Rodríguez J (2009), en general, las
cenizas suponen menos del 5% de la materia seca.

Mientras que el contenido de proteína cruda en el residuo fue de

2,45%, dicho porcentaje representan la proteína verdadera y el nitrógeno
no proteico, por lo tanto su contenido de aminoácidos es bajo debido al
bajo contenido de proteína.

De igual forma, es conocido que el contenido de grasa indica las

trazas de aceites procedentes del grano de maíz, dicho contenido arrojo
un porcentaje de 0,2% lo que muestra el bajo contenido de grasa cruda
en el desecho.

El porcentaje de fibra cruda reportó ser de 24 %, valor que

representa la mayor parte de celulosa, hemicelulosa y lignina. Por ende,
al obtenerse mayor contenido de fibra menor será el contenido de valor
nutricional.

El porcentaje humedad obtenido fue de 9,2 % en peso de

contenido de agua, el cual de acuerdo con Rodríguez, J (2009) se
encuentra en el rango establecidos para los desechos de maíz que están
entre 8-15%, con este valor se pudo prever que el rendimiento máximo de
este desecho estaría aproximadamente en un 91%,

El desecho en estudio arrojo un 23,03 % de carbohidratos totales,

demostrando el contenido de azúcares que pueden ser utilizados como
fuentes de nutrientes para que los microorganismos puedan recibir las
fuentes de reservas necesarias. Por ende, es factible emplear este

58
desecho como materia prima para la obtención de proteínas unicelulares
y biomasa microbiana.

4.2. Identificación de A niger y S. cerevisiae mediante el

estudio macroscópico y microscópica de sus estructura
reproductora.

Siguiendo la metodología planteada en el estudio macroscópico

para identificación de hongos filamentosos se observó el crecimiento al
tercer día, colonias con características de texturas aterciopelada
pulverulenta, color en adverso negro y reverso blanco con estrías muy
marcada,

El estudio microscópico, se logró identificar como Aspergillus niger

debido las características que este presentó al observar en microscopio
Axioskop Zeiss a 400X, según Delaat (2005) cabezas de las conoideas
negras y radiales divididas formando columnas, los conidióforos son de
color café y anchos con formas de vesículas globosas.

En tal sentido para evaluar las características macroscópicamente

de la levadura, esta presento en la adversa forma cremosa, color blanco y
la reversa forma lisa. Al realizarle el estudio microscópico en Axioskop
Zeiss a 100X y 400X en fresco en porta lámina con cubre objeto
(laminillas) contenidas con azul de lactofenol al 10% se evidencio la
presencia de células en forma ovaladas diploides, multiplicándose por
gemación siendo su forma de reproducción, debido a su maduración
ascal, ellas son puestas en libertad y se multiplican con el consume de
fuente de nutrientes y carbono. Considerando estos aspectos se
determinó Saccharomyces cerevisiae como la levadura en estudio.

59
 4.3 Determinación de la cinética de crecimiento A. niger y S.
cerevisiae.

Tabla 5. Crecimiento radial del A. niger en medio Czapek Dox a

diferentes concentraciones
Días Promedio Promedio Promedio
(mm) 5% (mm) 10% mm)15%
sacarosa sacarosa sacarosa
1 0,26 0,28 0,4
2 1,55 1,65 1,76
3 2,66 2,9 2,68
4 3,96 4,1 3,7
5 4,82 5,3 4,62
6 5,92 7,85 7,5
7 6,7 8,4 8
8 7,02 8,57 8
9 7,25 8,6 8,1
10 7,42 8,63 8,1
11 7,45 8,65 8,1
12 7,45 8,65 8,1

Fuente: Propia (LIADSA 2017)

10
CRECIMIENTO RADIAL (MM)

9
8
7 Fase de crecimiento
exponencial
6 Fase Estacionaria
5 5%
4
10%
3
2 15%
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
DIAS

Grafica 1. Crecimiento radial del A. niger a diferentes

concentraciones de sacarosa
Fuente: Propia. LIADSA (2017)

En la gráfica 1 se muestra el crecimiento logarítmico de la muestra

de A. niger con respecto a cada una de las concentraciones, donde se

60
evidencia el log de la población fúngica, al transcurrir el tiempo, atraviesa
cada una de las fases, excepto la fase de muerte.

Con una concentración de 10% de sacarosa el hongo presenta un

crecimiento radial más rápido, presentando desarrollo hasta el día 7,
llegando a su fase estacionaria en el día 8. Siendo entonces, esta
concentración al 10% la idónea para la fermentación enzimática y para
ello, fue necesaria su réplica a dicha concentración de sacarosa para
continuar con el estudio de la fermentación en fase líquida de dicho
hongo.

La determinación de la cinética de crecimiento de la levadura S.

cerevisiae se hizo inicialmente una lecturas por horas del crecimiento de
la cepa donde se evidenció por las lecturas de absorbancia del
espectofotometro UV MAPADA V-1100D, que el crecimiento es lento, lo
cual es típico a la fase latencia (Lag) de crecimiento de la levadura.

Grafica 2. Crecimiento de la levadura S. cerevisiae en medio Czapek Dox

líquido a diferentes concentraciones de sacarosa.

Fuente: Propia 2017 LIADSA

61
 Se registraron valores de absorbancia que al ser graficados
generaron una curva de tendencia exponencial de manera progresiva
entrando a la fase estacionaria. Se observó el crecimiento pleno de la
levadura con una concentración de 10% de sacarosa. Cabe destacar que,
la cepa entró en fase estacionaria luego de cuatro horas ya que las
células se dividen y otras mueren donde las células vivas utilizan los
compuestos provenientes de las muertas como nutrientes, manteniendo la
población constante durante la fase de muerte. Al cabo de un tiempo,
dicho comportamiento no es sostenido por la colonia y este tiende a ir
decreciendo hasta morir, como se observa luego de las primeras 5 cinco
horas.

4.4 Comprobar la presencia de proteínas totales en la

fermentación del desecho Z. mays a partir de A. niger y S.
cerevisiae.

0.2

0.15
ABSORBANCIA

0.1 A.niger
PATRÓN
0.05
S. cerevisae
0
0.1 0.2 0.25
-0.05
CONCENTRACCIÓN

Grafica 3. Presencia de proteínas totales en A. niger y S. cerevisiae a

diferentes concentraciones de glucosa.

Fuente: Propia LIADSA (2017).

62
 Se observó la discrepancia entre la curva patrón y las curvas problema
lo que indicó que la curva patrón posee valores de absorbancia más
altos en comparación a los de las muestras, dicho valor es razonable
pues la curva patrón fue realizada con una muestra que contenía clara
huevo (alto contenido de proteína), razón que justifica la mayor cantidad
de proteínas contenidas, no obstante la curva que contenía del hongo en
estudio nos indica también la presencia de proteínas, pero en menor
proporción que la curva control, indicando que la concentración a la cual
existe más presencia de proteína con el A. niger es la del 25% con
0,009183. Mientras la S. cerevisiae presento la mayor presencia de
proteínas al 20% con 0.0004666 ppm.

Evidenciándose en el A. niger la presencia de proteínas totales en

comparación a la levadura, por lo que se espera hipotéticamente una
mayor actividad enzimática en la enzima que se obtendrá del hongo.

4.5 Determinación cuantitativa de presencia de la celulosa en la

fermentación en fase liquida del desecho de Z. mays a partir de A.
niger y S. cerevisiae.

0.35

0.3

0.25

0.2
PATRÓN
(ppm)

0.15
A. niger
0.1
S. cerevisae
0.05

0
0.1 0.2 0.25
-0.05
CONCENTRACÓN

63
 Grafica 4. Presencia de Celulosa a Diferentes concentraciones
de Glucosa

La especie Aspergillus niger genera tendencia en la producción de

celulosa, por ende una actividad enzimática. Presentó una concentración
de 0,2065ppm con respecto a la levadura Saccharomyces cerevisiae que
arrojo una absorbancia máxima de 0,0458ppm. A pesar que el proceso de
fermentación fue más rápido con la S. cerevisiae en comparación a la del
A. niger.

A pesar que el A. niger presenta una cinética de crecimiento más

rápido en una concentración de 10% de sacarosa, la concentración que
arrojo una mayor actividad enzimática fue de 25% de glucosa. Siendo
esta concentración de glucosa la más adecuada para obtener la mayor
cantidad de enzima, dado que con las concentraciones de glucosa
trabajadas en las fases anteriores, generaba una baja concentración y
por ende un bajo contenido de la enzima a obtener.

Razón por la cual es importante destacar, que se debe tomar en

cuenta las concentraciones de la diluciones de glucosa, ya que a través
de ella se determina a cual concentración de glucosa se obtendrá la
mayor cantidad de enzima ; por tal motivo se comprueba que es más
efectivo trabajar en pro de una mayor actividad enzimática .

No obstante se observa también una diferencia significativa en una

disminución bastante marcada en la producción de celulosa en S.
cerevisiae con una concentración de 0,0458ppm valor que nos indica la
poca actividad enzimática obtenida si se utiliza la levadura como
microorganismo mediante el proceso de fermentación. Los resultados

64
coinciden con lo mencionado por Saddler, 1982 al decir sólo unos pocos
microorganismos pueden producir niveles altos de celulasas.

65
 CAPITULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

 Se Caracterizó Fisicoquímicamente el desecho de maíz,

empleando los diferentes métodos necesarios; observándose un
porcentaje de cenizas de 1,98%, proteína 2,45%, fibra cruda 24%,
carbohidratos 23,03%, grasa 0,6% y humedad 9,2%. Parámetros
que se encuentran entre los rasgos establecidos para los
materiales lignocelulósicos.

 Fueron Identificados los microorganismos Aspergillus niger y

Saccharomyces cerevisiae mediante el estudio macroscópico de la
colonia y microscópico de la estructura reproductora, logrando la
apreciación sus estructuras morfológicas y macroscópicas, como
características propias de la Saccharomyces cerevisiae, color
blanco, superficie de terciopelo y un color negro verduzco para el
aspergillus niger.

 La curva de crecimiento mostro un crecimiento radial en los

primeros 7 días para el aspergillus niger y entrando en la fase
estacionaria a partir del día 8, mientras la levadura tiene un
crecimiento en las primeras 4horas, transcurrido este tiempo entra
a la fase estacionaria, posteriormente la de muerte.

66
  Se Comprobó la presencia de proteínas totales en la fermentación
del desecho Z. mays a partir de A. niger y S. cerevisiae
evidenciándose por lectura de absorbancia la mayor presencia de
proteínas en el aspergillus niger a 25% de sacarosa.

 La presencia de celulosa en cada una de las diferentes

concentraciones de glucosa se determinó mediante el método
DNS, donde se observó la mayor producción de celulosa con el
aspergillus niger en 25% de sacarosa con una absorbancia de
0,2065ppm.

RECOMENDACIONES

- Cuantificar la actividad enzimática de la enzima celulosa de

manera que pueda profundizar el estudio antes realizados.

- Incluir la identificacion y separaracion decada una de las enzimas

presentes complejo enzimático celulasa.

- Fomentar como Electivas, microbiología aplicada.

- Utilizar diversos desechos agrícolas en procesos industriales,

como materia prima para la obtención de diferentes productos.

67
 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Albarrán, M. (2008). Ajuste y validación de un modelo de determinación

de actividad enzimática celulosa en suelos a partir de la valoración
espectrofotométrica de azucares reductores. Documento en línea.
Disponible:http://tesis.ula..ve/pregado/tde_busca/arquivo.php?codArqivo=
1218

Álvarez, S. y De Silva, A. (2010). Obtención de biomasa de

Saccharomyces cerevisiae usando residuos del mesocarpo de naranja
criolla (Citrus sinensis (L.) Osbeck). T.E.G. Universidad Nacional
Experimental Francisco de Miranda.

Angulo, V. (2005). Obtención de pasta celulósica de sarmientos de vid.

IVICAM y Universidad de Córdoba. Facultad de Ciencias. España.
Disponible en:
http://pagina.jccm.es/ivicam/investigacion/finalizados/celulosicas.pdf

Arias, F. (2006). El proyecto de investigación, Introducción a la

Metodología Científica. 5ta Edición. Editorial Episteme. Caracas –
Venezuela.

Audesirk, T., Audesirk, G. y Byers, B. (2003).Biología: ciencia y naturaleza

Bazán, C. y Halil, B. (2011). Respiración aeróbica y Fermentación.

Disponible en:
http://www.acmor.org.mx/cuamweb/reportescongreso/2011/Secund/738re
spiracion.pdf

68
Canche, G; De los santos, J; Andrade, S; Gómez, R. (2005). Obtención de
celulosa a partir de desechos agrícolas del banano. Centro de
Investigación Científica de Yucatán. México. Disponible en
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718-
07642005000100012&script=sci_arttext

Caparros, S. (2009).Fraccionamiento integral de vegetales no alimentarios

para la obtención de pasta celulósica y subproductos. Universidad de
Huelva. Departamento de Ingeniería Química, Química Física y Química
Orgánica. España. Disponible en:
http://rabida.uhu.es/dspace/bitstream/handle/10272/328/b15296283-
1.pdf?sequence=1

Casas, G. (1989). Micología General. Universidad Central de Venezuela.

Ediciones de la Biblioteca, Caracas, Venezuela.

Casas, R. (1972). Contribución al estudio del Aspergillus y

Aspergilosis.Kasmera: vol. 4. No. 2. Universidad Nacional del Zulia.
Maracaibo. Venezuela

Castells, X. (2000). Reciclaje de residuos industriales. Disponible en:

http://books.google.co.ve/books?id=oA7ndthNMYQC&pg=PA73&dq=hidról
isis&hl=es&sa=X&ei=JXdtUuSDH8W_kQf83IGQAQ&ved=0CDYQ6AEwAg
#v=onepage&q=hidrólisis&f=false

Calvo, M. (2009). Bioquímica de los Alimentos.

69
Claassenvan LierJB, López Contreras AM, van Niel EWJ, Sijtsma L,
StamsAJM, de Vries SS, Weusthuis RA (1999). “Utilización de la biomasa
para el suministro de las compañías de energía”.

Cortinez, V. (2010).Comparación de pre tratamiento en residuos

forestales para la producción de bioetanol de segunda generación:
hidrolisis acida y líquidos iónicos. Documento en línea. Disponible en:
www.tesis.uchile.cl/tesis/uchile/2010/cf-cortinez.../cf-cortinez,vv.pdf

De Jaime, M. (2011). Reactivo de Fehling. Disponible en:

http://blog.uchceu.es/eponimos-cientificos/reactivo-de-fehling/

F.A.O. (1993). Manual de técnicas para laboratorio de nutrición de peces

y crustáceos. Disponible en:
http://www.fao.org/docrep/field/003/AB489S/AB489S00.htm

Facultad de Química UNAM. (2007). Fundamentos y técnicas de análisis

de alimentos. Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/FUNDAMENTOSYTECNICAS
DEANALISISDEALIMENTOS_12286.pdf.

Fernández, B. y Gómez, M, (2011). Determinación del grado de

conversión global del jugo de piña en etanol por medio de la fermentación
alcohólica. Disponible en:
http://200.35.84.131/portal/bases/marc/texto/2101-11-04067.pdf.

Fraume, N. (2006). Manual Abecedario ecológico. Disponible

en:http://books.google.co.ve/books?id=rrGMx_DpbfAC&pg=PT100&dq=de

70
secho&hl=es&sa=X&ei=vmZtUoL4K8yjkQf0_4HAAw&ved=0CDsQ6AEwA
w#v=onepage&q=desecho&f=false

Gaitán, D., y Pérez. L. (2007). Aislamiento y evaluación de

microorganismos celulolítico a partir de residuos vegetales frescos y en
compost generados en un cultivo de crisantemos (Dendranthema
grandiflora). Pontificia Universidad Javariana.

Garassini, L. (1964). Microbiología tecnológica.

Garrote, G; Nacimiento, j; Caparros, S; Ariza, J; López, F. (2005).

Producción de pasta de celulosa a partir de tallos de girasol. Universidad
de Huelva. Facultad de Ciencias Experimentales. España. Disponible en:
http://rabida.uhu.es/dspace/bitstream/handle/10272/328/b15296283-
2.pdf.txt?sequence=11

González, W. (1989). Nutrición animal, Editorial América. Caracas.

Venezuela

Granados, R. (1984). Ciencia de la alimentación, Editorial Reverté.

Barcelona. España.

Hurtado, P; Krinjnen, J. (2005). Diseño y puesta en marcha de un digestor

a escala piloto para la elaboración de pulpa para papel. UNEFM. Falcón –
Venezuela.

71
Jiménez, G; Rodríguez, E; Contreras, M. (2011). Obtención de
carboximetilcelulosa usando lemna como materia prima. Universidad del
Zulia. Zulia – Venezuela. Disponible en:
http://www.ehu.es/reviberpol/pdf/DIC11/genire.pdf

Juhasz, T (2005). Characterization of Cellulase and hemicellulose

produced for Trichodermareesei on various carbon sources. Process
Biochemistry, 40:3519-3525.

Kappelle, M., Castro, M., Acevedo, H., González, L. y Monge, H. (2003).

Ecosistemas del área de conservación Osa. Ecosistemas de Costa Rica:
Serie técnica No. 1. INBio. Santo Domingo de Heredia

Kozakiewicz, Z. (1989). Aspergillus species on stored products. CAB

International Mycological Institute, Kew, Surrey.

Malfavon, L., Gutiérrez, B., llyina A. (2003). Aislamiento de

microorganismos fúngicos productores de celulasas. En línea. Disponible
en:http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/puertovallarta03/TRABA
JOS/AREAXII/CARTEL/CXII-3.PDF

Martínez, A. (2012). Crecimiento microbiano. Disponible en:

http://fepi608.wordpress.com/2012/06/09/verificar-el-comportamiento-del-
microorganismo-y-sus-cinetica-de-crecimiento

Martínez, C. Balcazar, E. Dantan, Edgar, Folch J. (2008). Celulasas

fúngicas: aspectos biológicos y aplicaciones en la industria energética.
Revista latinoamericana de microbiología. Vol. 50. Nos. 3 y 4. Pp.119-113.

72
Ministerio de Industrias Ligeras y Comercio. (2006). Resolución N°195.
Gaceta oficial N°38557.

Montiel, M. y Rodríguez, D. (2008). Optimización de las condiciones de

tratamiento PDA del follaje de yuca para la obtención de concentrados
proteicos. Universidad Rafael Urdaneta, Maracaibo

Morris, M. y López, M. (1966). Impactos del mejoramiento de maíz en

América Latina. Disponible en:
http://books.google.co.ve/books?id=nyCNLIdlpqsC&pg=PA2&dq=definicio
n+maiz&hl=es&sa=X&ei=H3ltUqr3KcqHkQfWiIFQ&ved=0CEEQ6AEwBA#
v=onepage&q=definicion%20maiz&f=false

Moya, M; Duran, M; Sibaja, M. (1990).Obtención de derivados celulósicos

a partir de desechos de café. Universidad Nacional. Costa Rica.
Disponible en: http://www.mag.go.cr/rev_agr/v14n02_169.pdf.

Nollet, L. (1996) Handbook of food analysis; M. Dekker, New York.

Norma COVENIN 1315-79, (1979). Alimentos. Determinación del pH.

(Acidez Iónica). Publicación de Fondo norma. Caracas, Venezuela.

Norma AOAC (14.004). Determinación de humedad.

Paredes, D. (2010). Obtención de enzimas celulasas a partir de hongos

(Pleurotusostreatus, Pleurotuspulmonarius y Lentinulaedodes), utilizando
como sustratos los residuos del cultivo del banano (Musa Cavendich).

73
Documento en línea. Disponible en:
http://repo.uta.edu.ec//bitstream/handle/123456789/848/AL445%20ref.%2
03359.pdf?sequence=1

Pérez, M. (2009). Procesos fermentativos. Disponible en:

http://es.scribd.com/doc/15762395/Procesos-Fermentativos

Ponce, T. y Pérez, O. (2012). Celulasas y Xinalasas en la industria.

Avance y perspectiva, 21.

Ramírez, O y Urrego, F. (2009). Producción de celulasas a partir del

hongo Trichidermaspy aprovechamiento de la fibra prensada de palma
como medio de cultivo.

Ranea, F. (2002). Crecimiento microbiano. Documento en línea.

Disponible en: http://www.mictobiologia.com.ar/fisilogia/crecimiento.html

Reczey, K. (1996). Cellulase production by T.ressei. Bioresource

Tecnology

Rodríguez, A. (2003). Microbiología industrial.

Rodríguez, J. (2009). Síntesis y caracterización de geles de

carboximetilcelulosa obtenidos del pericarpio del maíz, y sus posibles
aplicaciones. Universidad de Oriente. Sucre – Venezuela. Disponible en:
http://ri.bib.udo.edu.ve/bitstream/123456789/295/1/TESIS_JR.pdf.

74
Salinas, Z. y Hernández, P. (2008). Guía para el diseño de proyectos MDL
forestales y de bioenergía. Disponible
en:http://books.google.co.ve/books?id=fyAOAQAAIAAJ&pg=PA154&dq=bi
omasa+definicion&hl=es&sa=X&ei=i0xtUoDZJ4zrkQfZk4GgAQ&ved=0CC
wQ6AEwAA#v=onepage&q=biomasa%20definicion&f=false

Suesca, A. (2012).Producción de enzimas celulolíticas a partir de cultivos

de Trichoderma spp. Con biomasa Lignocelullitica. Documento en línea.
Disponible en: http://www.bdigital.unal.edu.co/7843/1/300054.2012.pdf

Vélez, L. M., P. Gañan, D.J. Severiche, G.A. Hincapié y M.C. Restrepo.

(2009). Aprovechamiento de la fibra dietaría de frutas y/o residuos de su
transformación en la elaboración de productos de panificación y de maíz.
Facultad de Ciencias Agropecuarias Vol. 7.

Walter, P., Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M y Roberts,
K. (1998).Essential Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology
of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York & London.

Yegres, F. Fernández, G. Padin, C. Rovero, L. Yegres, N. (2003).

“Saccharomyces cerevisiae en la fabricación del licor Cocuy”. Revista de
la Sociedad Venezolana de Microbiología. Volumen 23.

Yusmaira R. Eglenis L. Yaracelis M. Hector P. (2011). Producción

Nacional del Maíz. Disponible en: http://elmaizdelzulia.blogspot.com

75
 APÉNDICE

Apéndice A. Características Fisicoquímicas del Desecho del Maíz

(Zea Mays).

1. pH (método electrométrico) (A.O.A.C 1990)

Mediante pH metro digital a 20ºC. La medición se realizó a la

solución filtrada de 10 gramos de harina en 100 ml de agua destilada.

2. Humedad (Método A.O.A.C. 14.004)

Se colocó la capsula de porcelana en la estufa a 105ºC por dos

horas, luego en el desecador por 15 minutos, finalmente se pesó la
capsula. Se colocaron aproximadamente dos gramos de muestra en la
capsula de porcelana ya pesada. Seguidamente se colocó en la estufa a
105ºC por 4 horas. Posteriormente se pesó la capsula y se reportó la
pérdida de peso por humedad.

- Calculo del Porcentaje de Humedad

Nota: La determinación debe hacerse a la muestra por duplicado.

𝐏𝐡−𝐏𝐬
%Humedad= *100%
𝐏𝐡

Ph: Peso muestra humedad

Ps: Peso muestra seco

76
Ps= (Peso del crisol + muestra) antes de estufa - (Peso del crisol + muestra)
después de estufa

(2g−( 34,62−34,43)g)
%Humedad1= ∗ 100% = 9,5%
2g

%Humedad2= 8,9%

𝛴%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 9,5+8.9
%Humedad promedio= *100% = *100%= 9,2%
2 2

3. Proteína Total (Método kjeldhal).

- Digestión: Se pesó aproximadamente 0,2 gramos de muestra seca

y molida, transfiriéndolo a un balón de digestión agregando 0,2
gramos de catalizador y 2,5ml de Ácido sulfúrico concentrado
(H2SO4). Se colocaron los calentadores del digestor a media llama,
hasta que la muestra a digerir se tornó cristalina o color marrón,
obtenido este color se mantuvo la digestión por 30 minutos más (Se
deben rotar los balones ocasionalmente durante el proceso).
Terminando esta fase se apagaron los calentadores, dejo enfriar los
balones, manteniendo encendido los extractores para permitir el
escape de todos los gases.

- Destilación: Se encendió el micro Kjeldhal se conectó la manguera

de entrada de agua del condensador al grifo, dejo salir agua.
Abriendo la válvula de entrada a la cámara interna de destilación (1)
y lavo con agua destilada, desalojando el agua del lavado a través
de la válvula (2) repitiendo varias veces. Se llenó la cámara externa
con agua destilada hasta la mitad a través de la válvula (3)
manteniendo siempre el mismo nivel durante todo el proceso. Se
Dejó enfriar las cámaras externas antes de agregar el agua.

77
 Asegurando que la celda de calentamiento no pegue con las
paredes de las dos cámaras. Cerrando las válvulas (1) y (2)
manteniéndolas así durante todo el proceso. Agregando 5ml de
agua destilada al balón que contenía la muestra digerida y
transfiriéndola a la cámara interna del destilador, dejando caer la
muestra adicionada 10ml de NaOH y cerrando la válvula (1).
Colocando en el externo del condensador una fiola de 50 ml con
5ml de solución de 𝐻3 𝐵𝑂3. Encendiendo el equipo y colocando el
botón de temperatura en (5) se destilo hasta obtener de 25 a 30 ml
de destilado, retirando la fiola y dejando salir la muestra (2)
apagando el calentador.

- Titulación: Se tituló con el ácido seleccionado (H2SO4

concentrado) hasta que ocurrió un cambio de color, anotando el
volumen de ácido gastado.

- Calculo del Porcentaje de Proteínas

%Proteína= %Nitrógeno Total * Factor de Conversión

𝐕𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞𝐧 𝐆𝐚𝐬𝐭𝐚𝐝𝐨 ∗ 𝐍𝐨𝐫𝐦𝐚𝐥𝐢𝐝𝐚𝐝 𝐀𝐜𝐢𝐝ó∗𝟏,𝟒

%Nitrógeno Total= ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝐠𝐫 𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚

0,4 ∗ 0,14 ∗1,4

%Nitrógeno = ∗ 100=0,392%
0,2

%Proteína= 0,392%* 6,25 = 2,45%

78
 4. Grasa Total (Método Soxtec).

Soxtec es un método de extracción continua, basado en que una

porción fresca del solvente se pone en contacto con el material que se
extrae por un periodo de tiempo. Se pesó 5 gr de muestra seca y triturada
en el mortero, colocándola en los dedales que contenían algodón en el
fondo y se tapó la muestra con un poco de algodón. Conectando la
manguera del refrigerante al grifo, se abrió el suministro de agua
chequeando el reflujo del mismo.

Encendiendo el equipo extractor en posición MAIN (luz verde

encendida). Llevando los dedales al Soxtec y colocándolos en el
compartimiento subiéndolos usando las manillas que se encontraban al
frente del refrigerante. En las capsulas de aluminio (previamente secadas
en estufa a 105ºC por dos horas y pesadas ) son colocados 40 ml de
solvente y son introducidos al equipo, bajando la palanca de presión que
lo sella. Los pedales son bajados sumergiéndolos en el solvente, justando
el tiempo a 15minutos, las válvulas se mantuvieron abiertas durante todo
el proceso.

Ya completados los 15 minutos, los dedales fueron subidos y el

tiempo ajustado a 30 minutos, cerrando las válvulas ya transcurrido el
tiempo es encendido el evaporador por 5minutos (posición AIR) luego
fueron retiradas las capsulas y llevadas a la estufa a 105ºC,
posteriormente son enfriadas por 10 minutos en el desecador y pesados.

79
 - Calculo del Porcentaje de Grasa

𝐏𝐁𝐆 − 𝐏𝐁𝐕
%Grasa = ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝐏𝐌𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚

Donde

PBG: Peso del balón con grasa

PBV: Peso del balón vacío

PM: Peso de la muestra

273,18 − 273,17
%Grasa= * 100= 0,2%
5,01

5. Ceniza Total (Método A.O.A.C. 31.012).

Se pesó una capsula de porcelana previamente seca a 105ºC, en

la estufa y enfriada en el desecador. En la capsula fue introducido de 4
gramos de muestra sólida, calentándola en una plancha o cocina eléctrica
hasta que perdió toda la humedad (muestra torna un color gris).
Posteriormente la capsula fue colocada en la mufla a 525ºC por 4 horas.
Se enfrió en desecador y se pesó.

- Cálculo del Porcentaje de Cenizas

Nota: La determinación debe hacerse a la muestra por duplicado.

𝐏𝐢−𝐏𝐟
%Cenizas= ∗ 𝟏𝟎𝟎%
𝐏𝐦

Pi: Peso del crisol con cenizas

Pf: Peso del crisol vacío

80
Pm: Peso de la nuestra

33,04−33,10
%Cenizas1 = ∗ 100%= 1,198
5,01

%Cenizas2 = 1,198

𝛴%𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 1,198+1,198
%Cenizas promedio= *100%= *100%= 1,198%
2 2

6. Fibra Total

Es calculado mediante hidrólisis ácida con SO4H2. Se pesó 1

gramo de muestra por duplicado, colocándolos en beaker, se añadió 50ml
de SO4H2 a 0,128M. Posteriormente se colocó en el calentador, al
aparecer la primera burbuja de ebullición se contaron 30 minutos.

Transcurrido ese tiempo, se procedió a filtrar con agua destilada

caliente. La muestra ya filtrada se colocó en el calentador nuevamente
con 50ml de KOH a 0,223M. Los papeles filtro que estaban en la estufa se
colocaron en el desecador por 15 minutos para ser pesados
posteriormente.

- Cálculo del Porcentaje de Fibra

Nota: La determinación debe hacerse a la muestra por duplicado

𝐂−[(𝐁+𝐀)–(𝐃−𝐀)]
%Fibra= [ * 100]
𝐏

81
Donde

A: Peso del crisol

B: Peso del papel

C: Peso del crisol + Papel + Fibra Después de la estufa

D: Peso del Crisol + Cenizas

P: Peso de la muestra

32,80−[(0,91+31,51)–(31,52−31,51)]
%Fibra1= [ * 100]=39%
1

%Fibra2= 9%

39+9
Σ%Fibra
%Fibra promedio= = = 24%
2 2

7. Carbohidratos Totales (Método de Lane-Eynon).

Basados en que los componentes reductores, formados a partir de

los carbohidratos en medio alcalino, reducen los iones cúpricos a cuproso,
los que al reaccionar con los iones hidróxidos forman hidróxido cuproso
que por calentar pasan a oxido cuproso formándose un precipitado de
color rojo. El hidróxido cuproso es casi insoluble; pero en presencia del
tartrato de sodio y potasio se solubiliza formando un complejo que es el
que suministra los iones cúpricos. La concentración de los azucares en la
solución con la cual se va a titular el fehling, debe estar comprendida
entre 0,5% – 1 %.

Reactivos:
- Solución de acetato de plomo, densidad 1,25
- Solución fehling 1 y fehling 2
- Solución azul de metileno al 1%

82
 FEHLING 1: Se disolvió 34,639 gramos de CUSO45H2O en agua
destilada, llevando a 500c.c y filtrando.

FEHLING 2: Se disolvió 1,73 gramos de sal de rochelle (tartrato de

doble potasio y sodio) y 50 gramos de NaOH en agua destilada, se
diluyó a 500ml, dejando en reposo por dos días y luego fue filtrado.

Preparación de la muestra: Se pesaron 50 gramos de muestra,

se homogenizo con 100ml de agua destilada, posteriormente se pasó a
un matraz aforado de 500ml y se filtró. Del filtrado se tomó una alícuota
que contenía más o menos 2,5 gramos de azucares totales (25ml a 30
ml). Se colocaron en un matraz aforado de 250ml donde se diluyeron
con 100ml de agua destilada agregado un pequeño exceso de solución
de subacetato de plomo hasta precipitación completa (1ml - 2ml).

Azucares reductores: Seguidamente se colocó en una fiola 5ml de

fehling 1 y fehling 2 diluyendo con un poco de agua destilada, se calentó
suavemente y desde una bureta se dejó caer la solución clarificada que
contenía los azucares, observando la producción de un precipitado rojo y
la disminución de la coloración azul. En este punto se agregaron 2 gotas
de azul de metileno como indicador, posteriormente se procedió la
titulación, hasta que desapareció la coloración azul y se observó un
precipitado de color rojo.

Azucares totales: Del filtrado clarificado se tomaron 50ml y se

colocaron en un matraz aforado de 100ml agregando 5ml de HCL 1:1, se
calentaron a 70°C durante 5minutos, dejando enfriar a temperatura
ambiente. Se neutralizo con NaOH usando fenolftaleína como indicador,
se completó el volumen, se filtró y se tituló los azucares totales con la
solución de fehling.

83
 - Calculo del Porcentaje de carbohidratos

Nota: La determinación debe hacerse a la muestra por duplicado.

𝟎,𝟎𝟒𝟕𝟓 ∗ 𝐛 ∗ 𝐝 ∗ 𝐝′
%Azucares Totales= ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝐚 ∗ 𝐜 ∗ 𝐜 ′ ∗𝐰

Donde:

a= ml de solución de azúcar gastado para titular 10 ml de fehling

d= Volumen a que se llevó la muestra original

d’= Volumen a que se llevó la solución de azúcar después de la inversión

b= Volumen al que se llevó de azúcar clarificado

c= Alícuota formada de la solución de azucares para clarificar

c’: Alícuota formada de la solución clarificada para la inversión

w= Peso de la muestra.

0,0475 ∗ 250 ∗500 ∗ 250

%AzucaresTotales1= ∗ 100= 23,6%
20,6 ∗ 50 ∗ 125∗50

%AzucaresTotales2 = 23,4%

Σ%AzucaresTotales 23,6+23,4
%AzucaresTotalespromedio= = =23,3%
2 2

ANEXOS

84
 Anexo A. Identificación de A niger y S. cerevisiae mediante el
estudio macroscópico y microscópica de sus estructura
reproductora.

1. Preparación del medio de cultivo:

Medio de cultivo Czapek Dox sin agar: Para la preparación de los

medios, se diluyeron los reactivos de la tabla 5, según Casas, R. G.
(1989), estas cantidades en el enlermeyer de 2000 ml para ser llevados a
la plancha de calentamiento con agitación hasta que hiervan y se
disuelvan totalmente. Luego de ser homogenizada la solución se taparon
los enlermeyer con el fin de evitar contaminación, y fueron llevados al
autoclave hasta que alcanzó una presión de 15 Psi y 121 °C por 10
minutos. Una vez que llegó a temperatura ambiente se dispuso de 50 mL
del medio en recipientes de vidrio y 5 ml en tubos de ensayo, luego se
refrigeró para evitar contaminación y deshidratación.

Tabla 6. Preparación de Medio de Cultivo, Czapek Dox Líquido,

concentración de sacarosa (5,10 y 15) %

Reactivos Cantidad (gramos)

Nitrato de sodio 2

Fosfato bipotásico 1

Sulfato de magnesio 0,5

Cloruro de potasio 0,5

Sulfato ferroso 0,01

85
 Sacarosa 0,225 – 0,45 – 0,675

Agua destilada 1000 c.c

Fuente: Casas G (1989).

Medio de cultivo Czapek Dox con agar: Para la preparación de

los medios, se diluyeron los reactivos de la tabla 7. Según (Casas, R. G.
1989), estas cantidades en el enlermeyer de 2000 ml para ser llevados a
la plancha de calentamiento con agitación hasta que hiervan y se
disuelvan totalmente. Luego de ser homogenizada la solución se taparon
los enlermeyer con el fin de evitar contaminación, y fueron llevados a la
autoclave hasta que alcance una presión de 15 Psi y 121 °C por 10
minutos. Una vez que alcanzó una temperatura ambiente se dispone de
50 ml del medio en recipientes de vidrio y 5 ml en tubos de ensayo,
dejándose solidificar en forma de bisel evitándose el contacto entre el
tapón y el medio contenido, luego se refrigeraron para evitar
contaminación y deshidratación.

Tabla 7. Preparación de Medio de Cultivo, Czapek Dox sólido,

concentración de sacarosa (5,10 y 15) %
Reactivos Cantidad (gramos)

Nitrato de sodio 2

Fosfato bipotásico 1

Sulfato de magnesio 0,5

Cloruro de potasio 0,5

Sulfato ferroso 0,01

Sacarosa 0,225 – 0,45 – 0,675

86
 Agar 15

Agua destilada 1000 c.c

Fuente: Casas G (1989)

Anexo B. Comprobar la presencia de proteínas totales en la

fermentación del desecho Z. mays a partir de A. niger y S. cerevisiae.

Se realizo por el método de biuret. Sigue el siguiente

procedimiento: Se tomó un tubo de ensayo y se colocaron tres
centímetros cúbicos de albumina de huevo, es decir, la clara de huevo. Se
añadió 2 centímetros cúbicos de solución de NaOH al 20%. Agregando 4
o 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluido al 1%. Si la mezcla se
forma violeta, hay presencia de proteínas.

Lo mismo se realizo con las muestras en estudio, es decir, para la

fermentación de cada microorganismo (Aspergillus niger y
Saccharomyces cerevisiae) con las diferentes concentración de glucosa.

Anexo C. Determinación cuantitativa de presencia de la

celulosa en la fermentación en fase liquida del desecho de Z. mays a
partir de A. niger y S. cerevisiae.

87
 1. Método para el conteo de células

Técnica de dilución

1. Se tiene una solución madre de 50mL de medio líquido Agar Papa

Dextrosa (PDA) con 1mL del microorganismo.
2. Toma 6 tubos de ensayo
3. Añadir a un tubo de ensayo 9 mL de medio líquido Agar Papa
Dextrosa y 1mL de la solución madre
4. Luego del tubo 1, tomar 1mL de la solución y agregársela al tubo 2,
y así sucesivamente hasta terminar las diluciones en los 6 tubos de
ensayo.

Cámara de Neubauer

88
 1. Preparar una fiola con medio líquido Agar Papa Dextrosa
2. Inocular 1mL del hongo en estudio
3. Añadir 0,1mL en la cuadricula graduada de la cámara de Neubauer
4. Colocar la cámara en el microscopio
5. Realizar el conteo de las células formadoras de colonias.

Conteo de esporas en cámara de Neubauer

Este método se basa en observar al microscopio y contar las

esporas presentes en un volumen predeterminado; el cual es un
portaobjetos esmerilado que tiene un patrón de cuadrículas con
dimensiones conocidas que indican un volumen estándar bajo un
cubreobjetos. En esta cámara hay 25 cuadros grandes y cada uno tiene
0.1mm3(0.0001 mL), y cada cuadro grande contiene 16 cuadros más
pequeños; para obtener la densidad de las esporas, estas son
dispersadas por capilaridad y entonces pueden ser contadas al
microscopio.

89
 Para determinar el número de esporas por mL, se contaron las
esporas contenidas en 10 cuadros grandes (delimitados por dos rayas
paralelas), realizando un promedio y sustituyéndolo en la siguiente
fórmula.

Nro.de esporas/ mL = 𝑿 ∗ 𝟐𝟓 ∗ 𝟏𝟎 ∗ 𝟒 ∗ 𝒇𝒅

Dónde:

X: es la media aritmética del número de esporas

25: es el número de cuadros totales de la cámara de Neubauer

104: es el factor de volumen de la cámara de Neubauer

fd: es el factor de dilución de la cosecha de esporas

90
 2. Determinación de azucares reductores

- Preparación del reactivo DNS.

Se Disuelve 0.8gr de NaOH en agua destilada.

Se Adiciona 15gr de tartrato de Na y K.

Se agrega 0.5gr de DNS.

Aforar a 50ml y luego almacenar en un frasco ámbar a 4 ºC.

- Procedimiento

Se toman 0.5ml de la muestra patrón a diferentes concentraciones

de glucosa (10,20 y 25) % luego se agregan 0,5ml de DNS y se agita la
muestra colocándolas a ebullir en baño de maría por 5 minutos.
Transcurrido el tiempo se retiran las muestras y se colocan en un envase
con hielo. Finalmente se le añade 5ml de agua destilada dejándola en
reposo por 15 minutos para luego ser medidas en el espectrofotómetro

91
Anexo D. Memoria fotográfico

Molino de bolas Mod: Retsch PM100.

Harina del Desecho del Zeas Mays.

Mufla utilizada para determinación de Cenizas.

92
 Desecador.

Determinación de Grasas.

Balanza utilizada.

93
 Preparación de medios de cultivo.

Preparación de las muestras para la curva de crecimiento de la levadura

Saccharomyces cerevisiae.

94
Muestras para la curva de crecimiento del Aspergillus niger.

Vista Microscópica de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

95
Crecimiento radial del Aspergillus niger.

Saccharomyces cerevisiae.

96
 Preparación del DNS.

Método DNS, Coloración de las muestras.

Medición de Absorbancia.

97
 Fermentación liquida con aireación.

Calentamiento de recipiente ensayo DNS

98
. Determinación de celulosa muestra con DNS sin calentamiento

. Muestras luego del calentamiento

99