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BIOMARCADORES DE DANO GENETICO. Una

mirada Práctica

Conference Paper · August 2009

DOI: 10.13140/RG.2.1.2901.4164

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Elio A. Prieto Gonzalez

Interamerican Open University
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BIOMARCADORES DE DANO GENETICO. UN
ENFOQUE PRÁCTICO.
ELIO A. PRIETO GONZÁLEZ MD

GENOTOXICIDAD DEFINICION

La genotoxicidad es el daño químico que se produce sobre el material genético, entendido este como el
ADN y los distintos tipos de ARN, aunque en ocasiones se hace referencia a los cromosomas. En muchas
ocasiones se extiende el alcance del término hasta incluir a los agentes físicos y biológicos capaces de
causar modificaciones en el material genético.

Genotóxico

Agente que, a niveles subtóxicos de exposición, producen algún tipo de alteración en el material
genético o en sus componentes asociados. Bajo este término se incluyen los agentes que interaccionan
tanto directa como indirectamente, con el ADN provocando mutaciones, y los que interfieren en algunos
procesos enzimáticos de la reparación, o en la génesis o polimerización del material proteico
involucrado en la segregación cromosómica. En consecuencia pueden producir modificaciones de las
características de un determinado genoma.

Las sustancias genotóxicas pueden unirse directamente al ADN o actuar indirectamente al causar
afectación de las enzimas involucradas en las modificaciones fisiológicas del ADN como replicación o
transcripción lo que también puede producir mutaciones que pueden ser el paso inicial en el desarrollo
de un cáncer o alterar el desarrollo embrionario. Los genotóxicos no son necesariamente cancerígenos,
pero la mayor parte de los cancerígenos son genotóxicos.

Xenobiotico: Es toda sustancia extraña o ajena a las que proceden de la composición o metabolismo de
los organismos vivos.

Anéugeno: Es el agente capaz de inducir una distribución desigual de los cromosomas entre las células
hijas. Esto produce células con uno o varios cromosomas más o menos.

Clastógeno :Es el agente capaz de producir roturas en los cromosomas

Mutágenos: Agentes de diversa naturaleza, químicos, físicos y biológicos, capaces de producir una
modificación estable en el material genético.

La radiación ionizante, como la radiación gamma y los rayos X

La radiación ultravioleta, en particular la UVC (la molécula de AND tiene el máximo de absorción en los
260 nm que corresponde e este rango). Otros son la UVA que genera EROs en por reacciones
fotoquímicas y la UVB que es atraviesa la capa de ozono.

Agentes químicos como los alquilantes , sulfonato de metilmetano , ciclofosfamida, bleomicina estos
últimos algunos de los utilizados en la quimioterapia del cáncer.

Agentes como las radiaciones provocan roturas en el ADN, sea de manera directa o por la generación de
especies reactivas del oxigeno (O2–, OH-, H2O2 Oxigeno singulete).

El daño oxidativo en el ADN es capaz de generar beses modificadas (oxidadas) dentro de las cuales la 8
oxo guanina y la glicoltimina son las más relevantes.

Las especies reactivas del oxigeno, se generan además como resultado del metabolismo, en la cadena
respiratoria, por reducción uni electrónica del oxigeno, en los neutrofilos, por acción de la enzima
NADPH oxidasa, por acción de la xantina oxidoreductasa entre otros.

El desbalance a favor de la producción de EROs frente a la disponibilidad de agentes antioxidantes se

denomina estrés oxidativo y está en la base de una variedad de modificaciones en el ADN con
capacidad de convertirse en mutaciones.

en la metilación también son modificaciones a considerar.

Mecanismos de mutación

Para que se produzca una mutación es necesario que haya daño en el DNA, si este daño no es reparado
durante la replicación se producirá la fijación de la mutación. Dentro de los cambios asociados a la
replicación del DNA están:

Despurinización es la perdida de purinas que produce sitios apurínicos (AP) capaces de bloquear la
replicación y que inducen mecanismos de reparación o tolerancia al daño, la desaminación o perdida de
grupos aminos, los cambios

Durante la replicación del ADN se producen una serie de eventos que pueden determinar que una base
nitrogenada ocupe un lugar inapropiado en la cadena de ADN.

A consecuencia de cambios tautoméricos: se refieren a las modificaciones de las configuraciones que

adoptan las bases a lo largo del tiempo, lo que puede generar apareamientos erróneos, puede ocurrir en
cualquier base, en la cadena molde o en aquella que está en crecimiento. Ocurre con relativa baja
frecuencia.

Por errores en la ADN polimerasa que incorpora nucleótidos incorrectos en la cadena en crecimiento. La
función editora o de corrección de errores limita el número de mutaciones.

Por la presencia de secuencias pequeñas repetidas que favorecen el fenómeno del deslizamiento durante
la replicaciones, esto puede dar lugar a deleciones y duplicaciones. Estas últimas provocan corrimientos
del marco de lectura. Hay afecciones hereditarias que se relacionan con la expansión de tripletas
repetidas como la enfermedad de Huntington (CAG) o el Síndrome del X frágil (CGG).

Los cambios que se producen el ADN por acción de los genotóxicos deben ser reparados, de lo
contrario resultarán fijados y se transmitirán a las células hijas de aquella en la que ocurrió el evento
inicial.

Puede resumirse que las mutaciones génicas pueden ser.

Sustituciones de base que provocan un cambio en la lectura del mensaje.

Mutación de cambio de sentido: se incorpora una base que modifica el aminoácido a incorporar en la
traducción a proteína

Mutación sin sentido: aparece un triplete o codón de terminación y se interrumpe el mensaje

prematuramente

Mutación silente: aparece un codón que codifica para el mismo aminoácido que el codón original (ver
degeneración del código genético).

También pueden clasificarse por el tipo de modificación física ocurrida en la molécula de ADN;

Deleción, duplicación e Inversión

Las dos primeras modifican el marco de lectura del ADN que al no tener comas se lee correctamente
solo si la ADN polimerasa se ubica exactamente en el sitio que le permita reconocer el codón de
iniciación y de ahí en lo adelante los tripletes del mensaje o marco de lectura abierto

Las mutaciones génicas también pueden clasificarse de acuerdo al tipo de base que sustituya a la
original en: Transición: sustitución de una purina (A,G) por una purina, o de una pirimidina (C, T) por una
pirimidina y Transversión: sustitución de una purina por una pirimidina o viceversa.

Entre las modificaciones premutacionales de las bases vale mencionar el Daño primario al ADN

Aducciones: aquí un grupo químico o molécula se une de forma covalente a una base modificando sus
características de apareamiento y provocando una transición o transversión.

Roturas de simple cadena o de doble cadena

Las uniones cruzadas entre porciones de ADN ADN-ADN crosslinks o ADN – proteínas también son
capaces de generar cambios que devengan en una modificación estable y transmisible entre
generaciones celulares.

Reparación del ADN

Los mecanismos de reparación pueden clasificarse asi:

1) Reparación directa o “in situ” :

Transferencia directa de grupos metilos desde una enzima hacia el ADN

Enzimas fotoliasas que toman la energía luminosa para eliminar alteraciones como Dímeros de
timina de tipo ciclobutano (CPD). No se reconoce su acción en mamíferos

2) Reparación por escisión

Reparación por escisión de bases BER (Base Excision Repair) se elimina la base dañada por
acción de Endonucleasas Apurinicas que escinden los enlaces fosfodiester cuando existe un sitio
AP o de una enzima glicosilasa que corta el enlace entre la base y el azúcar generando s su vez
un sitio AP. Mecanismo más activo frente a modificaciones de bases, como las provocadas por la
oxidación

Reparación por escisión de nucleótidos NER (Nucleotide Excision Repair) ó reparación de parches
cortos (SP). La escisión de nucleótidos involucra un número mayor de polipéptidos al que se le
conoce como complejo proteico de Exinucleasa. En este caso se repara por corte escisión una
lesión más voluminosa como los CPD. Esta vía de reparación por escisión de nucleótidos puede
eliminar una cadena sola de

ADN dañado con una longitud de 24-30 pares de bases. Ulteriormente se produce la síntesis del
oligonucleótido eliminado con la lesión para restituir la integridad del ADN. Su deficiencia provoca
las enfermedades conocidas como Xeroderma Pigmentosum y el Sindrome de Cokcayne

En este sistema se distinguen la Reparación General Global que ocurre en cualquier región del
ADN y la Reparación acoplada a la Transcripcion que tiene lugar en los genes que se estan
expresando.

Reparación de mal apareamiento de bases (Mitsmach Repair) ó reparación de parches muy largos
(VLP). Aquí se reconoce la hebra que debe ser reparada porque al ser la de síntesis reciente se
encuentra hipometilada.

El reconocimiento de un mal apareamiento requiere varias proteínas diferentes como el MSH2 y el

corte de la base mal apareada involucra al gen MLH1. Ambos se relacionan con el cáncer de colon
, por lo que su deficiencia es importante en la herencia de esta afección.
 3) Reparación de roturas de doble hebra

Principalmente por recombinación no homóloga (RNH ) En esta modalidad la union directa de

los extremos rotos requiere de proteínas que reconocen y unen tales extremos para que se
puedan restituir la integridad de la hebra por acción de una ligasa que fusiona los extremos
apareados. Se considera que el mecanismo principal de reparación de RDC en mamíferos es la
fusión de extremos (NHEJ). Por otra parte las RDCs asociados con el proceso de replicación
son reparadas por recombinación homóloga (RH). En este sistema se produce una
recombinación entre las hebras a reparase donde una cadena se aparea con la complementaria,
pero del otro extrema a reunir y luego se sintetizan los segmentos restantes y se ligan.

En estos mecanismos participan los genes asociados al cáncer BRCA1 y BRCA2

4) Reparación del ADN mitocondrial

Se han identificado en la mitocondria glicosilasas que participan en el sistema de reparación por

escisión de bases y que actúan frente a modificaciones oxidativas. La mitocondria carece de
sistema NER así como de reparación por mal apareamiento (MMR)

REPARACION DEL ADN CONSIDERACIONES PRÁCTICAS

La reparación del ADN, puede ser un indicador del nivel de daño a que están
sometidos organismos en el entorno evaluado. Los sistemas inducibles se encuentran
hiperactivos en esas circunstancias.

Pero la aplicación principal es la de servir como biomarcador de susceptibilidad, bajo la

asunción general de que una merma en ciertos sistemas de reparación puede
aumentar la susceptibilidad la acción de genotóxicos.

Un elemento a considerar cuando se toman muestras para evaluar daño genético es

la disminución del daño detectable por la acción de mecanismos de reparación si es
que no se conservan las muestras a una temperatura adecuada (4 oC)

En los estudios en humanos las células utilizadas para las evaluaciones pueden estar
en cavidades expuestas como la nasal o la bucal, lo que reduce al estrés mecánico
como la causa principal de injuria durante el muestreo. Sin embargo en las tomas de
sangre, la exposición a oxigeno o a la luz UV del sol o en el laboratorio, pueden causar
daños en el ADN que se incrementen durante la fase de corte de los mecanismos
donde está involucrado el corte y la escisión de bases.

Esto obliga a la protección frente a estos estresores y a la estandarización del

momento en que comenzar los procedimientos de evaluación del daño a partir de la
toma de la muestra.

Lo primero se logra disminuyendo la exposición a la luz en el momento de la

extracción y al cierre hermético de la jeringa o vacutainer con parafilm y
posteriormente envolviendo en papel metálico la muestra que se debe transportar a
temperatura entre 4 y 8oC, evitando las sacudidas.

En ocasiones se recomienda el empleo de inhibidores de la reparación para impedir

una reducción artificial del daño. En técnicas en las que se requiere que las células se
dividan, hay que tomar en cuenta que las más afectadas también mueren en mayor
cantidad lo que tiende a disminuir los niveles de daño detectados en el estudio.

TECNICAS PARA LA EVALUACION DEL DAÑO GENETICO

Pueden realizarse en diversos tipos celulares pueden aplicarse como biomarcadores para evaluar el
efecto de las condiciones ambientales sobre el genoma. Han sido desarrollados varios métodos
citogenéticos que permiten la detección de alteraciones en el fenotipo. En esencia, los cambios
fenotípicos funcionan como biomarcadores de exposición o de efecto. Los biomarcadores citogenéticos
se han relacionado con efectos biológicos y de hecho se aprecian como cambios desencadenantes del
proceso tumoral a consecuencia de la yuxtaposición de segmentos génicos que modifican el control
sobre el crecimiento y la diferenciación celular. Es por eso que el diagnostico citogenético forma parte
de la batería de estudios que se utilizan en onco hematología para diagnosticar y clasificar tumores con
técnicas que se refinan hasta el nivel molecular. En otro sentido, la significación de las aberraciones
cromosómicas como biomarcadores de daño genético se ha puesto de relieve en los estudios que
demuestran una asociación entre la frecuencia con que aparecen en poblaciones libres de enfermedad
y el riesgo relativo de padecer cáncer en el futuro.
MUTACIONES O ABERRACIONES CROMOSOMICAS

Son alteraciones en la forma o numero de los cromosomas que se asocian al desarrollo de tumores
sólidos y leucemias. Las aberraciones que aparecen en forma constitutiva (forman parte de todas o de
una gran proporción de las células) están en el origen de afecciones como el Síndrome de Down, de Cri
du Chat, de Turner. En el síndrome de X frágil el evento inicial; que se manifiesta como una rotura
cromosómica es la mutación dinámica con aumento del número de tripletas.

Las aberraciones cromosómicas numéricas pueden ser: Aneuploidías o Aneusomías.

En la primera puede estar presente un juego cromosómico completo, mientras que en la segunda hay
cromosomas de más (polisomías) o de menos (nulisomías).

Entre las aberraciones estructurales se pueden encontrar: estables o inestables.

Las estables son:

o Translocación: intercambio de material genético entre cromosomas no homólogos. Existe un

tipo de translocación en el que la rotura ocurre en el centrómero y produce cromosomas
fusionados. Es un importante evento en la evolución.

o Deleción: perdida de parte del cromosoma (lo que la distingue de la deleción molecular es la
escala del fenómeno, aquí se pierden cientos de bases.

o Inversión: se produce un corte doble que separa un fragmento del cromosoma que se vuelve a
reunir pero en sentido inverso al original. Las inversiones pueden involucrar o no al centrómero.

o Isocromosoma: Un cromosoma se corta transversalmente y se replica de manera que posee

solo las secuencias correspondientes a los brazos largos o cortos (duplicadas)

Las aberraciones inestables son:

o Cromosomas dicentricos: tienen dos centrómeros producto de la fusión de dos cromosomas

delecionados.
 o Cromosomas acéntricos: son fragmentos sin centrómeros destinados a perderse en la siguiente
división

o Cromosoma en anillo: Cromosomas delecionados en los extremos de ambos brazos en los que
ambos extremos se han reunido formando un circulo.

o Roturas de una cromátida o de ambas

o Espacios acromáticos (gaps)

o Reordenamientos múltiples formando triradiales

o Endorreduplicaciones.

o Dobles diminutos

o Regiones de tinción homogenea

TÉCNICAS CITOGENÉTICAS

La citogenética es la parte de la genética que se dedica al estudio del cariotipo y los cromosomas
mediante técnicas en las que se evalúan sus alteraciones numéricas o estructurales, así como el índice
mitótico. La tinción diferencial de las cromatidas permite inferir los eventos de daño y reparación
ocurridos y la velocidad con que se dividen las células en cultivo.

Análisis de Aberraciones cromosómicas

Las imágenes obtenidas al microscopio se procesan y los cromosomas se ordenan por su tamaño y por
la posición del centrómero. En la actualidad, se utiliza el análisis digital de las imágenes de los
cromosomas capturadas por cámaras que están en interfase con PC en la que se aplican programas cada
vez más capaces de aportar imágenes en el límite entre lo citológico y lo molecular

Los cromosomas pueden teñirse con el colorante basófilo Giemsa lo que facilita la observación de la
estructura y el conteo del número de cromosomas. Existen otros procedimientos que reconocen el
patrón específico de bandas de cada cromosoma, patrón que obedece a los distintos tipos de cromatina
(eucromatina y heterocromatina) y a las secuencias especificas de los centrómeros. Las técnicas de
bandeado que así se les denominan, tienen poca aplicación en Genotoxicología pero pueden emplearse
en ocasiones especiales cuando se desea detectar alguna lesión estable.

Las técnicas de bandeado cromosómico más utilizadas son las de: bandas G, bandas C (centroméricas),
bandas R, bandas NOR y en desuso las bandas Q (fluorescentes) que reconocen un patrón similar al de
las bandas G.

La hibridación in situ fluorescente (FISH) permite la determinación del número y localización de

secuencias especificas de ADN las en células, tanto en interfase como en cromosomas en metafase. La
técnica se basa en la unión de oligonucleótidos marcados con un colorante fluorescente a las
secuencias de ADN donde se encuentre complementariedad. El empleo de secuencias especificas para
cada cromosoma permite marcarlos con diferentes colores ( chromosome painting) esta pintura facilita
la identificación de intercambios de material entre cromosomas no homólogos o translocaciones incluso
las más pequeñas.

Intercambio de cromatidas hermanas

Los ICHs se originan de manera normal en células de mamíferos en estado replicativo y se han utilizado
ampliamente como un indicador sensible de genotoxicidad. En teoría, el análisis del ICH se puede
realizar en cualquier línea celular que pueda replicarse en cultivo y tienen como único requisito que la
célula pueda incorporar bromodeoxiuridina (BrdU) (un análogo de timidina) hasta un segundo ciclo
celular. Es la transposición recíproca de segmentos entre cromátidas hermanas de un cromosoma
somático duplicado, este proceso es conservativo y libre de error, es decir no se pierde información
genética en el proceso. La radiación ultravioleta es el agente que mas aumenta su frecuencia, las
radiaciones ionizantes y otros agentes mutagénicos y es particularmente alta en el Síndrome de Bloom.

La significación de los ICH se ha discutido por años, (la primera demostración se realizó en 1957 aunque
utilizando timidina tritiada ) , pero existe el consenso de que su frecuencia refleja el nivel de eventos de
daño y reparación que ha experimentado el cromosoma. La mayoría de los genotóxicos puede inducir
ICH mediante el colapso de la horquilla de replicación.

La técnica mas frecuentemente utilizada es la de fluorescencia más Giemsa (FPG) y es ampliamente

empleada tanto en la evaluación in vitro e in vivo en modelos animales de la genotoxicidad de drogas,
productos químicos o exposiciones a agentes físicos como la radiación solar como en el biomonitoreo de
poblaciones.

Micronúcleos con bloqueo de la citocinesis por citocalasina B

Los micronúcleos (MN) son corpúsculos citoplasmáticos, de características similares al núcleo pero de
menor tamaño, se detectan en interfase y pueden originarse por la inclusión en la membrana nuclear
de fragmentos de cromosomas rotos o por o cromosomas enteros durante la cariocinesis y en
consecuencia son indicadores de la acción de clastógenos o anéugenos. La prueba de micronúcleos
registra sólo las células binucleadas por bloqueo de la citocinesis con Citocalasina, una micotoxina que
bloquea la formación de micro filamentos contráctiles necesarios para el clivaje de la célula al final de la
división. La permanencia de la membrana plasmática rodeando los dos núcleos apenas separados
impide la pérdida del micronúcleo con lo que aumenta su sensibilidad.

La prueba de aberraciones cromosómicas permite caracterizar el tipo de aberraciones sin embargo la

complejidad del análisis cromosómico requiere de observadores con mayor entrenamiento; por otra
parte el análisis de micronúcleos provee mayor validez estadística porque la evaluación se hace sobre el
conteo de miles de células binucleadas, muy por encima de las varias decenas de metafases que
habitualmente se analizan en la prueba de aberraciones cromosómicas.

La prueba de micronúcleos está validada internacionalmente como bioensayo para evaluar

genotoxicidad de sustancias, exposiciones agudas y crónicas, y es una de las más usadas para identificar
agentes genotóxicos. Existe una prueba de micronúcleos en eritrocitos policromatófilos (inmaduros) de
la medula ósea de ratón que está incluida en las baterías de estudio propuestas por varias agencias.

Uno de los desarrollos de esta técnica es el desarrollo de métodos de Citometría de flujo automatizado
para evaluar frecuencias de micronúcleos en eritrocitos murinos para mejorar el rendimiento del
ensayo basado en la observación al microscopio.
Cálculo del Índice mitótico

Es el cociente entre el número de células en una población en proceso de mitosis sobre el número de
células que no está en mitosis. Se utiliza como una estimación de la tasa de crecimiento de un cultivo o
tejido. Se evalúa en la prueba de aberraciones cromosómicas, evaluando varios campos consecutivos
hasta contabilizar 1000 células. El índice mitótico se calcula como sigue:

Cálculo de la Cinética de proliferación celular

La tasa de proliferación se calcula en 200 metafases según la fórmula = [(%M1) + 2(%M2) + 3(%M3+)] /
100, lo que indica el número promedio de veces que las células se habían dividido en el medio entre la
incorporación de BrdUrd y la obtención de los cromosomas en metafases.

Las metafases se diferencian por la coloración de sus cromatidas hermanas. Las M1 tienen las dos
cromatidas de color azul oscuro. Las M2 tienen una cromatida de color azul oscuro y otra de color azul
claro mientras que las M3 tienen al menos algunas cromosomas cuyas cromatidas son ambas de clor
azul claro.

La tinción obedece a la replicación semi conservativa de cromosomas de células que han replicado su
ADN incorporando en la hebra nueva el análogo de timina 5-2-bromo desoxiuridina. En la primera
división M1, cada cromatida que está formada por una molécula de ADN tiene una cadena bromo
sustituida mientras que la complementaria tiene timina. Estas cadenas son químicamente iguales. En la
segunda M2 ocurre que la cadena bromo sustituida al replicarse lo hace incorporando BrdU mientras
que la cadena “vieja” que tiene timina incorpora también BrdU por lo tanto hay una cromatida con una
cadena conteniendo BrdU aunque la otra conserva la timina. Una cromatida es químicamente diferente
de la otra. En la M3 hay algunas zonas cuyas cadenas son ambas bromo sustituidas y esto hace que
ambas cromatidas sean químicamente iguales y en esta ocasión se coloreen menos.

Figura 1. BASES MOLECULARES DE LA TINCION PARA INTERCAMBIO DE CROMATIDAS HERMANAS Y LA

EVALUACION DE LA CINETICA DE PROLIFERACION CELULAR
TECNICAS ELECTROFORÉTICAS

Ensayo cometa

El ensayo de electroforesis de células aisladas en gel de agarosa (también se traduce como de células
únicas) o Ensayo Cometa, es una técnica que permite evaluar varios tipos de lesiones en el ADN, por lo
que es útil en la caracterización de la genotoxicidad de agentes y exposiciones. La evaluación genotóxica
de alimentos, medicamentos u otras sustancias que puedan estar en contacto con las poblaciones
humanas o de animales sociabilizados y de consumo, resulta una herramienta útil para la identificación
de riesgos a la salud humana y para poder desarrollar medidas de prevención y control ya que las los
niveles de daño genético y alteraciones premutacionales son indicadores del riesgo de cáncer en las
poblaciones estudiadas. Las alteraciones genómicas asociadas al cáncer pueden implicar mutaciones a
nivel molecular o reordenamientos cromosómicos o aberraciones numéricas.

Aunque la información que brinda el análisis de aberraciones cromosómicas es más especifica y se

puede relacionar con eventos que tienen mayor significación biológica, como es el caso de las
translocaciones y el cáncer. La sensibilidad, la rapidez y el gran número de células que es posible analizar
hacen del ensayo cometa una herramienta muy útil para la evaluación de genotoxicidad.

Los resultados pueden ser orientadores de la conveniencia de aplicar otros procedimientos más
específicos, pero el pesquisaje inicial se ha beneficiado con el ensayo cometa, lo que hace que sea uno
de los estudios más frecuentes. La sensibilidad del ensayo decenas de veces superior al análisis de la
inducción de aberraciones cromosómicas, lo sitúa en el rango de las pruebas bioquímicas, que por su
complejidad y requerimientos no son de las mas utilizadas en los estudios de genotoxicidad. Esta
sensibilidad sin embargo, se constituye en una de las desventajas de la técnica, puesto que al ser tan
susceptible de alterar sus resultados por variables de difícil control, dieta, ejercicio previo, el consumo
de medicamentos, las horas de sueño entre otras, disminuye la reproducibilidad de los resultados y
obliga a un control de variables intervinientes mucho más severo.

Los procedimientos de preparación de las suspensiones celulares deben estar normalizados para cada
tipo de célula y durante la electroforesis es imprescindible el uso de controles internos para habilitar la
comparación de resultados obtenidos en diferentes corridas. La iluminación del área de trabajo, la
temperatura del buffer de corrida, el tiempo de desenrollamiento previo a la electroforesis en sí, son
aspectos a controlar.
La evaluación del daño se hace midiendo la cantidad de ADN migrado desde el nucleoide (el sitio donde
el núcleo de una célula incluida en gel de agarosa ha perdido su membrana y solo ha dejado una esfera
de ADN que por su tamaño no puede migrar a menos que se hayan producido roturas de una o las dos
cadenas del ADN). Para la cuantificación del daño se han utilizado diferentes procedimientos como la
medición de la longitud de la cola del cometa en micras o unidades arbitrarias. Actualmente se evalúa la
proporción de ADN migrado de acuerdo a una escala que va del 0 al 4 (cinco niveles) y se utiliza una
formula de ponderación.

Índice de Daño= n0 (0) +n1 (1) +n2 (2) +n3 (3) +n4 (4)

Donde el número entre paréntesis indica el nivel de daño o de migración en que se ha clasificado un
grupo de células multiplicado por el número de células en el nivel n

El entrenamiento e intercalibración de los observadores es un elemento central en la reproducibilidad

de los resultados. Este procedimiento en el que se utiliza solo el ojo y luna escala fotográfica (ver figura
3), se ha comparado con el que está basado en el uso de un programa que realiza el análisis de los datos
numéricos de la intensidad de fluorescencia multiplicada por el área de fluorescencia de la cola del
cometa. Esta multiplicación de la intensidad de brillo captada en el microscopio por la integral de la
fluorescencia, se denomina Momento de la cola y es la medida más precisa de la migración del ADN.

Sin embargo de la mayor precisión y la conversión de una variable cualitativa proporción del ADN
migrado a una cuantitativa Momento de la cola, la primera forma de medir se utiliza con más frecuencia
y es aceptada como válida por las revistas de mayor impacto.

La detección de diferencias intercelulares en el daño de ADN y reparación en cualquier población celular

escarótica que puede ser obtenido como una suspensión celular de 100.000 células. La sensibilidad llega
hasta 0.1 roturas de ADN por 109 Dalton

El Ensayo cometa se ha utilizado para el estudio de genotoxicidad sobre células en cultivo, linfocitos de
sangre periférica, células del epitelio bucal, vaginal o nasal. Las células no necesitan ser cultivadas por lo
que la medición del dano se hace de forma directa. Es por eso que en células de mamíferos amfibios,
aves y peces con lo que se ha empleado en la evaluación de genotoxicidad en emanaciones aéreas,
contaminación hídrica y del terreno utilizando la lombriz de tierra en particular la eisenia foetida de la
que se estudian los celomocitos. También es aplicable a células vegetales.
La técnica permite la detección de roturas de simple cadena cuando la lisis celular y ulterior incubación
de los nucleoides se hace en medio alcalino, a pH 13 o mayor se revelan los sitios lábiles al álcali y por
otra parte desaparecen los puentes de hidrogeno, lo que facilita la separación de los fragmentos de ADN
de simple cadena que migran y hacia la cola del cometa en función de su peso molecular. Las roturas de
doble cadena se revelan cuando la incubación para el desenrollamiento se hace a pH neutral. Aquí la
separación de los fragmentos ocurre solo si el esqueleto azúcar fosfato se ha roto en ambas cadenas
complementarias y se puede producir la migración electroforética. En este caso los puentes de
hidrogeno permanecen y la separación de los fragmentos se produce si la rotura aparece en las dos
cadenas.

El ensayo permite la adaptación de otros procedimientos como la digestión con enzimas de reparación
como glicosilasas especificas para lesiones oxidativas. Los ensayos de reparación se realizan después de
someter a las células a la acción de un agente con espectro lesional conocido. La toma de muestras a
interavalos durante la incubación permite monitorear la cinética de incisión, remoción y ligazón de los
fragmentos, por lo que la reparación se evalúa a partir de las mediciones de la migración del ADN hacia
la “cola del cometa” en función del tiempo.

La ductilidad, relativa facilidad en el análisis y el empleo de colorantes en lugar de moléculas radiactivas

le ha dado al ensayo la posición número uno en entre las pruebas para medir la capacidad de
reparación, como variable fenotípica y como complemento de la genotipificación. La estandarización de
los métodos de registro del daño así como la intercalibración entre laboratorios hará posible la
introducción de la técnica en las baterías de pruebas toxicológicas en la industria farmacéutica y
cosmética.
Figura 2. DIAGRAMA DE LA TECNICA DE ELECTROFORESIS DE CELULAS AISLADAS EN GEL DE AGAROSA

Figura 3. ESCALA CUALITATIVA

Electroforesis de campo pulsante

Electroforesis de campo pulsante en gel (PFGE) es una técnica para resolver moléculas de ADN de gran
tamaño aproximadamente de 10 Mb. Varios pares de electrodos en la cuba electroforética que están
dispuestos con una geometría apropiada se somete al ADN a un campo eléctrico alternativo a través
de una matriz de agarosa.

Como los cambios de dirección del campo eléctrico y el tiempo de reorientación de ADN son
proporcionales al peso molecular; se logra la separación de los grandes fragmentos de acuerdo a su
tamaño. Requiere de una preparación muy cuidadosa de la muestra a correr, para evitar que las fuerzas
de cizallamiento rompan la molécula. Puede aplicarse a la evaluación del número de roturas de doble
cadena y a la evaluación de la capacidad de reparación.

Es un procedimiento muy trabajoso para ser aplicado en estudios de biomonitoreo con gran número de
muestras.

Citometria de flujo

Los citómetros de flujo son instrumentos muy complejos en los que actúan cuatro sistemas
estrechamente relacionados. El sistema neumático transporta las partículas en suspensión hasta el
clitómetro, donde actúan los sistemas de iluminación y electrónicos, para ser interceptados por un rayo
de luz que a resultas de una colimación precisa, impacta sobre una partícula por vez. La dispersión de la
luz y fluorescencia resultante es recogida, filtrada y transformada en señales eléctricas. El sistema de
almacenamiento de datos guarda los resultados de las mediciones: existe una pantalla donde se
controlan las funciones del instrumento. Estos sistemas proporcionan una herramienta analítica muy
poderosa. Esto es porque permiten el análisis de las propiedades de las partículas individuales, y miles
de partículas (células y fragmentos) pueden analizarse en pocos segundos. A resultas de lo cual los
datos de una muestra de citometría de flujo son una colección de cientos y miles de mediciones lo que
aumenta la reproducibilidad.

La citometría de flujo requiere que la muestra contenga una gran cantidad de células suspendidas y
desagregadas por lo que puede utilizarse en preparaciones procedentes de cultivos celulares tratados
con sustancias en prueba o a partir de muestras de tejidos. El empleo de la citometria de flujo en los
estudios de genotoxicidad se basa en la tinción del ADN con ciertos colorantes que se unen de forma
estequiométrica, de manera que se pude calcular la cantidad de ADN en una célula a partir de los datos
de fluorescencia. El tamaño de las moléculas de ADN es posible evaluarlo y de esta forma conocer el
grado de integridad de la muestra. En el estudio de poblaciones celulares en las que está presente la
apoptosis se puede calcular la proporción de células que tienen cantidades de ADN por debajo de la que
se debe encontrar en la fase G1 del ciclo (de ahí que se les denomine Sub G1). Las posibilidades
analíticas se multiplican por el desarrollo de colorantes diversos que habilitan la evaluación simultánea
de eventos diferentes en la misma célula como, la supervivencia y el nivel de daño al ADN.

PRUEBAS MICROBIOLOGICAS

Prueba de Ames

Los ensayos microbianos para la evaluación de genotoxicidad presentan algunas ventajas sobre los
sistemas basados en cultivos de células eucariotas, como el menor tiempo empleado, la relativa
simplicidad de las técnicas; el mayor conocimiento de la genómica de los microorganismos y el menor
costo. Las pruebas basadas en microoganismos se han empleado en la evaluación de la genotoxicidad de
agentes como los pesticidas, los hidrocarburos policíclicos aromáticos, micotoxinas, medicamentos,
aditivos alimentarios o muestras ambientales de aire agua o suelo contaminados con residuos
industriales o en sitios cercanos a basurales.

Ensayos de genotoxicidad microbiana pueden dividirse en dos principales grupos: las encaminadas a
detectar la reversión de una mutación puntual, como el Ensayo de Ames y los diseñados para revelar la
inducción de la respuesta SOS.

La prueba de Ames es un ensayo a corto plazo ampliamente utilizado para la detección de mutágenos
químicos. El ensayo se basa en la aparición de revertantes en cultivos de Salmonella thyphymurium. Un
revertante es una célula que ha sufrido una mutación que la ha vuelto a la condición previa a la de una
primera mutación o mutación directa. Es decir las células wild type o salvajes, pueden vivir en un medio
sin histidina agregada, pero una primera mutación las convierte en dependientes de ese aminoácido.
La incubación con una sustancia mutagénica incrementa el número de colonias que son capaces de
crecer sin histidina. Los productos químicos mutágenos aumentan la frecuencia de aparición de
revertantes, generalmente en una forma dosis dependiente. El ensayo se puede aplicar a estudios de
monitoreo genético empleando muestras como orina u otras. Se utiliza en el estudio de procedimientos
que resultan en agentes químicos altamente volátiles, gases, productos químicos que requieren
metabolismo reductivo o que requieran el sistema de activación metabólica S-9 una fracción subcelular
que provee al cultivo de enzimas del sistema de citocromo P450, necesario en la toxicocinetica de algunos
compuestos que solo son activos como tóxicos o mutágenos una vez transformados por la fracción
microsomal .

Por otra parte evaluación de la capacidad de inducir la respuesta SOS es un ensayo muy utilizado en la
evaluación de genotoxicidad. La respuesta SOS ocurre en bacterias frente a un daño al ADN e involucra
la acción coordinada de genes que a partir de la degradación de una molécula represora, se activan por
lo que se produce la síntesis de enzimas de reparación del ADN y la inhibición de la división celular.

En la evaluación de la respuesta SOS se cuantifica la capacidad de inducción de los compuestos en

estudio, a partir de la medición de los cambios de coloración en el cultivo provocados por la inducción
de genes reportadores como el lac Z, a los que se les insertan promotores del sistema SOS a fin de que al
activarse, la respuesta sea detectable por reacciones enzimáticas que modifican substratos incoloros en
productos coloreados.

Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR

La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR también se ha incorporado a la Genética
Toxicológica. El PCR (utilizamos las siglas en ingles pues su uso es el más popular cualquier lengua) está
basado en la polimerización de segmentos de ADN que quedan como marco de lectura entre
oligonucleótidos cebadores o primers que aportan el extremo OH-3 para la adición de nuevos
nucleótidos por una polimerasa. En la PCR se utilizan enzimas polimerasas termoestables que soportan
la elevación de la temperatura necesaria para producir la fusión de los enlaces de hidrogeno entre las
cadenas complementarias, un paso necesario para que al bajar la temperatura se pueda producir la
hibridación de los primers con aquellas regiones complementarias. La multiplicación exponencial de las
cadenas a replicarse es lo que ha permitido el estudio de polimorfismos de ADN a partir de pequeñas
cantidades de muestra original. La sucesión de ciclos de hibridización, polimerización, fusión de las
cadenas y de nuevo hibridización, produce una mayor cantidad del segmento de ADN que se desea
amplificar lo que permite aplicar diferentes procedimientos de análisis como la digestión con enzimas de
restricción, la secuenciación o la sola evaluación de la aparición o no de bandas de amplificación.
Se ha encontrado que la exposición de organismos a genotóxicos, provoca cambios en las nucleótidos
que alteran las secuencias y las probabilidades de hibridización de los primers y amplificación, esto hace
que en las muestras con daño genético aparezcan o desaparezcan bandas lo que se considera una
“huella molecular”. Este procedimiento se denomina ADN polimórfico amplificado al azar RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA). En el RAPD se utilizan primers aleatorios de 10-mers. Es decir
oligonucleótidos de diez monómeros que se puedan reconocer una secuencia del ADN al azar ( siempre
la misma para casa primer) . Los resultados publicados demuestran que análisis RAPD puede aplicarse
en el estudio de las modificaciones causadas por contaminantes y en especial de la aparición de
inestabilidad genómica.

PROTOCOLOS TÉCNICOS
PROTOCOLOS TÉCNICOS

CITOGENETICA. ANALISIS DE ABERRACIONES CROMOSMICAS E ICH

Cultivos celulares

Las células mantenidas en cultivo que requieren de adhesión a la superficie deben

desprenderse para poder obtener una cosecha cromosómica y proceder al análisis
citogenéticos.

TRIPSINIZACION

- Colocar un frasco de tripsina ( %) y otro de medio de cultivo a 37˚C

- Descartar el medio del frasco de cultivo en un frasco estéril situado en el flujo laminar
- Añadir 0.5 ml de tripsina por cada 5 ml de medio, agitar y colocar en la estufa
-
- Observar al microscopio invertido y comprobar si las células se han vuelto redondeadas y se
mueven con el medio. Puede que sea necesario golpear la parte inferior del frasco de cultivo con
el dedo.
 - En ocasiones es necesario utilizar un raspador de células o rubber policeman para despegarlas
del frasco
-
- Añadir 10 ml de medio completo para detener la acción de la tripsina
-
- Retirar las células en suspensión y centrifugarlas a 1000 rpm por 5 min
-
- Eliminar el sobrenadante tomando como referencia en punto donde se encuentra el pellet celular
para introducir la punta de la pipeta en el punto diametralmente opuesto.
-
- Resuspended las células en el vehículo apropiado

La sangre periférica es el tejido usado más frecuentemente en el estudio cromosómico

por su facilidad de obtención y cultivo. Los linfocitos pueden ser inducidos a dividirse por
acción de una glicoproteína obtenida de un frijol el Phaseolus vulgaris llamada
Fitohemaglutinina (PHA). . In vitro se ha observado que la PHA, después de 24 horas
de cultivo, causa un incremento en la síntesis de ARN, seguida de la síntesis de ADN y
la división celular a las 48 horas. Además, en las primeras 24 horas después de
estimuladas las células con PHA, los linfocitos producen (IL-2), conocida también
como un factor de crecimiento linfocitario, la que perpetúa el proceso de mitosis a
manera de reacción en cadena.Los linfocitos T serán los estimulados selectivamente en
su proliferación en los cultivos con PHA.

Cultivo de linfocitos

Siembra

- Obtener 10 ml de sangre venosa con jeringa descartable previamente heparinizada.

- Mantener la muestra y los reactivos en condiciones estériles. Trabajar en ambiente estéril.

Preparar los tubos para cultivo.

En el frasco de cultivo estéril desechable

5 ml de medio RPMI
1 ml de suero fetal bovino
0,1 ml de fitohemaglutinina
10 a 15 µl de penicilina –estreptomicina
1 ml de sangre heparinizada

En el caso de utilizar una jeringa para la toma de la muestra se tomaran unos ml del frasco de heparina por punción
a través del tapón de goma y luego se repondrá en el frasco, con lo que la jeringa quedara lista para la extracción.
Pueden utilizarse vacutainers que se presentan con diferentes anticoagulantes como el EDTA

- Incubar en estufa de cultivo a 37°C, preferentemente con suministro de CO2 durante 72

horas. Los tubos se disponen en posición horizontal.

COSECHA DE LAS METAFASES, FIJACION Y TINCION

- Añadir colcemida (stock 10 g / ml ) a una concentración final de 0,4 g/ml durante las 2,5 últimas
horas de cultivo.

- Recoger las células mediante agitación en tubos de centrífuga de 10 ml.

- Centrifugar durante 6 min. a 900 rpm y decantar el sobrenadante. Resuspender las células.
- Tratamiento con solución hipotónica precalentada a 37˚C de KCl 0,075 M. La solución se añade
gota a gota muy lentamente y resuspendiendo con suavidad
- Colocar a temperatura ambiente por 10 minutos o a 37 por 3 minutos
- (es necesario realizar los ajustes de tiempo en el laboratorio para cada tipo celular)
- Centrifugar 5 min a 800 rpm luego, eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en solución fijadora de Carnoy (metanol 3:1 ácido acético) mantenida en
la heladera aprox a 8 grados. La solución debe estar recién preparada y se añade lentamente por
goteo.
- Una vez resuspendidas las células( es necesario desagregar los grumos que puedan formarse,
pipeteando muy lentamente y desplazando la punto de la pipeta arriba y abajo en la columna de
liquido en el tubo de centrifuga.
-
- Agregar 7 ml de Fijador. Colocar durante 1 hora en la heladera.
- La cantidad de fijador varia, pero debe llegarse hasta 12 ml al final de la fijación.
- Debe centrifugarse en las mismas condiciones y dejar reposar por una hora como mínimo.
- Extender unas gotas sobre una lamina portaobjetos que se haya mantenido en alcohol al 70 %
previamente y secado con papel suave hasta dejarlo sin restos de grasa o polvo en la superficie.
- Extensión
- Tomar una lamina y colocarla horizontalmente sosteniéndola con una mano mientras que con la
otra se vierten de tres a cuatro gotas en secuencia y a lo largo de la superficie, cuidando no
alcanzar al area donde se escribe la información de la preparación.
- Dejar secar al aire

- Se puede extender y observar el grado de dispersión de las metafases así como la presencia de
detritus celulares. La observación puede realizarse bajando el condensador y cerrando la abertura
del diafragma hasta ver las células en “contraste de fase”.
- También pueden teñirse con Giemsa al 0.4% durante 5 minutos, luego lavar con agua corriente y
observar.
- Preparar una solución Giemsa al 3% en buffer Sörensen.
- Colocar las laminas sobre dos pipetas en paralelo sobre una bandeja u otro recipiente, Verificar la
horizontalidad y verter unas gotas del colorante a fin de cubrir toda la superficie de la lamina
- Enjuagar con agua y secar a temperatura ambiente.
- Si se constata la presencia de restos celulares, se pude proceder a otra fijación.

2. Métodos de coloración de cromosomas

Método de Giemsa

Procedimiento:

- Realizar la coloración con Giemsa diluido durante 5-7minutos.

- Lavar bajo canilla. Dejar secar.

- Para obtener preparados permanentes, realizar montaje con Xam y cubreobjetos. Rotular.

- Método de banda G

- Preparaciones de cromosomas fijados en metanol acético (3:1)

- Soluciones:
a) Tripsina 0,25% en Solución de Hanks sin iones de calcio y magnesio, o en agua desionizada.
b) Giemsa 2% en tampón fosfato 0,06 M, pH 6,8.

Procedimiento:

- Colocar horizontalmente cada preparación y cubrir la zona con los cromosomas con tripsina
0,25% por aproximadamente 10 segundos. a temperatura ambiente.
 - Lavar con agua destilada.

- Teñir con la solución de Giemsa por 10 minutos.

- Lavar con agua destilada 3 veces. Secar al aire.

Resultados: Se diferencian sectores claros y oscuros (azul violeta) a lo largo del cromosoma.

3. Evaluación

Localizar una metafase (en 10 X) en el preparado coloreado

- Correr el objetivo 10X y colocar una gota de aceite de inmersión.

- Enfocar 100 X (objetivo de inmersión), observar si los cromosomas se encuentran bien

separados, si es así proceder a dibujarlos en una hoja.

ELECTROFORESIS EN CELULAS AISLADAS EN GEL DE AGAROSA. Ensayo cometa

FALTA TERMINAR DE TRADUCIR

Preparation of Reagents

Materials: Supplier (Catalogue Number):

Dimethylsulfoxide (DMSO) - Fisher (D128-500)

Disodium EDTA - Sigma (E-5134)

Ethidium Bromide - Sigma (E-8751)

Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) - GIBCO (1804873)

Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) - GIBCO (450-1300EC)

Sodium Chloride (NaCl) - Sigma (S-9625)

Sodium Hydroxide (NaOH) - Sigma (S-5881)

SYBRTM Green I - Molecular Probes, Inc.,

 P.O. Box 22010, Eugene, OR,

503-465-8353

Triton X-100 - Sigma ( x-100)

Trizma Base - Sigma (T-8524)

Procedure:

1. Mincing Solution: HBSS (Ca++, Mg++ free) with 20 mM EDTA and 10% DMSO: To 400 mL 1x
HBSS (Ca++, Mg++ free), add 3.72 g EDTA and 50 mL DMSO, adjust pH to 7.0 - 7.5., q.s. to 500
mL, store at room temperature.

2. PBS (Ca++, Mg++ free): Dulbecco's PBS - 1 L packet: add 990 mL dH2O, adjust pH to 7.4, q.s. to
1000 mL, store at room temperature.

3. Lysing Solution: Ingredients per 1000 mL: 2.5 M NaCl 146.1 gm

100 mM EDTA- 37.2 gm

10 mM Trizma base 1.2 gm

Add ingredients to about 700 mL dH2O, and begin stirring the mixture. Add ~8 gm NaOH and
allow the mixture to dissolve (about 20 min). Adjust the pH to 10.0 using concentrated HCl or
NaOH. q.s. to 890 mL with dH2O (the Triton X-100 and DMSO will increase the volume to the
correct amount), store at room temperature.

Final lysing solution: add fresh 1% Triton X-100 and 10% DMSO, and then refrigerate for at
least 30 minutes prior to slide addition.

NOTE: The purpose of the DMSO in the lysing solution is to scavenge radicals generated by the
iron released from hemoglobin when blood or animal tissues are used. It is not needed
for other situations or where the slides will be kept in lysing for a brief time only.
Sodium lauryl sarcosinate, which we used earlier, is not included in this version, but
may be needed for some cell types.
 4. Electrophoresis Buffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA):

Prepare from stock solutions: 1. 10 N NaOH (200 g/500 mL dH2O)

2. 200 mM EDTA (14.89 g/200 mL dH2O, pH 10)

store both at room temperature. We prepare the NaOH and EDTA stock solutions every ~2
weeks.

For 1X Buffer (made fresh before each electrophoresis run): per liter, add 30 mL NaOH and 5.0
mL EDTA, q.s. to 1000 mL, mix well. The total volume depends on the gel box capacity. Prior
to use, measure the pH of the buffer to ensure >13.

NOTE: Use this buffer at pH 12.1 to selectively assess for strand breakage.

5. Neutralization Buffer: 0.4 M Tris - 48.5 gm added to ~800 mL dH2O, adjust pH to 7.5 with
concentrated (>10 M) HCl: q.s. to 1000 mL with dH2O, store at room temperature.

6. Staining Solution: Ethidium Bromide (10X Stock - 20 µg/mL): add 10 mg in 50 mL dH2O,

store at room temperature. For 1X stock - mix 1 mL with 9 mL dH2O.

SYBRTM Green: Add 1 µL of provided stock solution to 10 mL of TE

buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) to prepare a 1:10,000
dilution. Make fresh prior to use. Staining solution is stable for several
hours at room temperature and for 1-2 days when refrigerated. pH is
critical for stability.

II. Preparation of Slides for the Single Cell Gel Assay

Materials: Supplier (Catalogue Number):

Coplin jars (opaque) -

Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) -

Frozen Ice Packs

Low Melting Point Agarose (LMPA) -

Microcentrifuge Tubes (for freezing samples)

Micropipettor and Tips

Microscope Slides, Conventional

Microscope Slide Tray (aluminum)

Microscope Slide Tray (plastic covered)

Normal Melting Agarose (NMA)

PBS (Ca++, Mg++ free) -

Scintillation vials -

ShurMark Marker for labeling slides -

Procedure:

1. Prepare 0.5% LMPA (250 mg per 50 mL) and 1.0% NMA (500 mg per 50 mL) in PBS.
Microwave or heat until near boiling and the agarose dissolves. For LMPA, aliquot 5 mL
samples into scintillation vials (or other suitable containers) and refrigerate until needed. When
needed, briefly melt agarose in microwave or by another appropriate method. Place LMPA vial
in a 37ºC water bath to cool and stabilize the temperature.

2. While NMA agarose is hot, dip conventional slides up to one-half the frosted area and gently
remove*. Wipe underside of slide to remove agarose and lay the slide in a tray on a flat surface
to dry. The slides may be air dried or warmed for quicker drying. Store the slides at room
temperature until needed; avoid high humidity conditions. We generally prepare slides the day
before use.
 NOTE: Slides should be labeled prior to dipping.

3. To the coated slide, add 75 Lµ of LMPA (37ºC) mixed with ~10,000 cells in ~5-10 µL (do not
use more than 10 µL). Replace coverslip and place the slide on a slide tray resting on the ice
packs until the agarose layer hardens (~3 to 5 minutes). Using ~10,000 cells in an area 24 by 50
mm results in ~1 cell per microscope field at 200-250 x magnification.

4. Gently slide off coverslip and add a third agarose layer (75 µL LMPA) to the slide. Replace
coverslip and return to the slide tray until the agarose layer hardens (~3 to 5 minutes).

5. Remove coverslip and slowly lower slide into cold, freshly made Lysing Solution. Protect from
light and refrigerate for a minimum of 1 hour. In our experience, slides may be stored for at least
4 weeks in cold Lysing Solution without affecting the results.

NOTE: The amounts indicated are based on using 24 x 50 mm coverslips. Proportional volumes
can be used for coverslips differing in size. If the gels are not sticking to the slides
properly, avoiding humidity and/or increasing the concentration of NMA agarose in the
lower layer to 1.5% should eliminate the problem. Steps 3 to 5 should be performed
under dim yellow lights to prevent DNA damage.

III. Cell Isolation

1. Whole Blood: Per gel slide, mix ~5 µL whole blood with 75 µL LMPA and process
accordingly.

NOTE: A small volume of blood can be added to 1 mL of media and stored cold (refrigerated or
on ice) for an extended period of time until processed. In this case, the cells must be
pelleted by centrifugation and care taken to remove as much supernatant as possible
before adding the 75 µL LMPA per 5 µL of blood. In cases where protracted sample
storage is necessary, this sample can be flash-frozen in liquid nitrogen and then stored at
–70 C until processed. Flash-freezing optimizes DNA integrity but not necessarily cell
survival.
2. Isolated Lymphocytes: Micro technique: Mix 20 µL whole blood with 1 mL RPMI 1640 in a
microcentrifuge tube, add 100 µL Ficoll below the blood/media mixture. Spin for 3 min at 2000
x g. Remove 100 µL of bottom of the media/top of Ficoll layer, add to 1 mL media and mix, spin
for 3 min to pellet lymphocytes. Pour off supernatant, resuspend pellet in 75 µL LMPA, and
process accordingly.

3. Bone Marrow: Perfuse a femur (mouse) with one mL of cold mincing solution (HBSS with 20
mM EDTA, 10% DMSO) into a microcentrifuge tube. Remove and mix 5 µL per 75 µL LMPA,
and process accordingly.

4. Solid Organs: Place a small piece of an organ in 1 mL of cold HBSS containing 20 mM

EDTA/10% DMSO. Mince into fine pieces, let settle, remove and mix 5 - 10 µL of the cell
suspension per 75 µL LMPA, and process accordingly.

NOTE: For blood rich organs (e.g., liver), mince into large pieces, let settle, aspirate mincing
solution, add fresh mincing solution, mince into finer pieces, remove and mix 5 µL of
the cell suspension with 75 µL LMPA, and process accordingly. The purpose of the
DMSO is to prevent lipid peroxidation associated with the processing of some tissue.
The volume of the cell suspension to mix with 75 µL of LMPA must be 10 µL or less,
while the optimal cell number is ~10,000 cells per slide. Adjust the volume of mincing
solution as needed. In cases where protracted sample storage is necessary, the minced
sample can be flash-frozen in liquid nitrogen and then stored at –70 C until processed.
Flash-freezing optimizes DNA integrity but not necessarily cell survival.

5. Monolayer Cultures: Remove the media and replace with mincing solution, scrape off cells into
the mincing solution using a teflon scrapper to yield approximately 1x106 cells/mL. Remove and
mix 5 - 10 µL of the cell suspension per 75 µL LMPA and process accordingly.

NOTE: Trypsin can be used but excessive amounts/times increases DNA damage.

6. Suspension Cultures: Mix ~10,000 cells in 10 L or less volume per 75 L LMPA and process
accordingly.

7. Viability Assessment: Viability assessment is often critical for interpreting SCG data. While
several methods are available, we routinely use a technique developed by G.H.S. Strauss ( Non-
random cell killing in cryopreservation: Implications for performance of the battery of leukocyte
tests (BLT) I. Toxic and immunotoxic effects, Mutation Res. 252: 1-15, 1991).
Materials:

Solution A: ethidium bromide (EB; Sigma #E8751). For the stock solution, dissolve 50 mg EB in 1.0
mL 100%-EtOH, and add 100 µL to 4.9 mL PBS. For the working solution, add 250 µL
stock solution to 9.75 mL PBS (final conc. = 0.025 µg/µL), and protect from light.

Solution B: 5-6 carboxyfluorescein diacetate (CFDA; Sigma #C-8166). For the stock solution,
dissolve 3 mg CFDA in 1.0 mL acetone. For the working solution, add 420 µL stock
solution to 9.58 mL PBS (final conc. = 0.125 µg/µL), and protect from light.

Solution C: Working solution: Combine A and B in a ratio of 1:1. Can be refrigerated for up to 6
months. Protect from light.

Procedure:

1. Place 40 µL of at least 106 cells/mL in a microcentrifuge tube, and add 10 µL of working solution
of dual stain (5-6 carboxyfluorescein diacetate:ethidium bromide; solution C).

2. Let stand for 3-5 min at 37ºC, and then remove excess stain by washing cells with 1 mL of wash
solution (tissue culture media, PBS, etc).

3. Pellet cell sample, and pour off supernatant.

4. Repeat wash. The cells may be stored by placing pelleted cells in PBS at 4ºC until ready to score.

5. Pellet cells, and pour off supernatant. Mix cells in remaining drop of fluid (about 10 µL).

6. Place drop with cells on microscope slide, add coverslip (the smaller in size, the better).
 7. Observe cells with fluorescent microscope (FITC or acridine orange filter combination).

8. Score 100 cells for the number of viable cells (green fluorescence in cytoplasm), the number of
compromised cells (green fluorescence in cytoplasm, red fluorescence in nucleus), and the
number of dead cells (red fluorescence in nucleus).

IV. Electrophoresis of Microgel Slides

Materials:

Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) -

Micropipettor and Tips

Ethanol or methanol

formalin

Procedure:

NOTE: The procedure described is for electrophoresis under pH>13 alkaline conditions.
Electrophoresis can also be conducted at pH 12.1 or under neutral conditions. Also,
slides can be removed from lysis to treat with repair enzymes specific for different
classes of DNA damage or with proteinase K to remove any residual protein (or to
distinguish between DNA-DNA and DNA-protein crosslinking , or can be used under
nonelectrophoretic conditions to detect apoptotic/necrotic cells.

1. After at least 1 hour at ~4ºC, gently remove slides from the Lysing Solution. Rinse slides
carefully in Tris (e.g., 3 x 5 min) to remove detergents and salts. Place slides side by side on the
horizontal gel box near one end, sliding them as close together as possible.

2. Fill the buffer reservoirs with freshly made pH>13 Electrophoresis Buffer until the liquid level
completely covers the slides (avoid bubbles over the agarose).
 3. Let slides sit in the alkaline buffer for 20 to 60 minutes to allow for unwinding of the DNA and
the expression of alkali-labile damage.

NOTE: The longer the exposure to alkali, the greater the expression of alkali-labile damage.

4. Turn on power supply to 25 volts (~0.74 V/cm) and adjust the current to 300 milliamperes by
raising or lowering the buffer level. Depending on the purpose of the study and on the extent of
migration in control samples, electrophorese the slides for 10 to 40 minutes.

NOTE: The goal is to obtain migration among the control cells without it being excessive. The
optimal electrophoresis duration differs for different cell types. If crosslinking is one of
the endpoints being assessed then having controls with about 25% migrated DNA is
useful. A lower voltage, amperage, and a longer electrophoresis time may allow for
increased sensitivity. Different gel boxes will require different voltage settings to
correct for the distance between the anode and the cathode.

5. Turn off the power. Gently lift the slides from the buffer and place on a drain tray. Dropwise
coat the slides with Neutralization Buffer, let sit for at least 5 minutes. Drain slides and repeat
two more times.

NOTE: Perform steps 1 through 4 under yellow light; the premise is that usual lighting will cause
DNA damage but have no data to support this concern.

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