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CROMATOGRAFÍA Historia
éter de
GC SFC LC petróleo
mezcla de
pigmentos
CROMATOGRAFIA
Principio Básico CROMATOGRAFIA
Modalidades y Clasificación
Separación de mezclas por interacción diferencial de sus
componentes entre una FASE ESTACIONARIA (líquido o
sólido) y una FASE MÓVIL (líquido o gas).
Cromatografia
FM = Líquido
Líquida
Cromatografia
FM = Gas
Gaseosa (CG)
Cromatografia
Sólida
Gas-Sólido (CGS)
En CG la FE
puede ser:
Cromatografia
Líquida
Gas-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFIA GASEOSA CROMATOGRAFIA GASEOSA
Efemérides Aplicaciones
Separación de ácidos orgáni- (para que una substancia cualquiera pueda ser
cos por CGL: primer cro- “arrastada” por un flujo de un gas ella debe
matógrafo (Martin e James) poder disolverse - al menos parcialmente -
Primer equipamiento comer- en ese gas)
1950 cial (Griffin & George)
Detector por Densidad de
Gás (Martin e James)
Mezclas cuyos constituyentes sean
Detector de Ionización de
llama (McWillian e Dewar) VOLÁTILES (=“evaporables”)
Detector de Captura Electrónica
(Lovelock e Lipsky) EN GENERAL:
1960 Columnas Capilares (Golay) CG se emplea en la separación y análisis
de mezclas cuyos constituyentes tengan
Presente: PUNTOS DE EBULLICIÓN de hasta 300oC
Ventas de equipamientos y acessorios para CG em U.S.A.
y que sean térmicamente estables.
estimadas en más de US$ 750.000.000 (1995).
3
1 – Suministro de Gas y Controles de Vacío / Presión
Tan sólo el 20% de los compuestos 2 - Inyector (Vaporizador) de muestra
orgánicos conocidos son analizados por 3 - Columna Cromatográfica y Horno
4 - Detector
cromatografía de gases 5 – Amplificador de Señal (tratamiento electrónico)
6 - Registro de Señal (Registrador u Ordenador).
Observación: en rojo: temperatura controlada
Gas Chromatography
Filters/Traps
Data system
H
RESET
Regulators Syringe/Sampler
Inlets
Detectors
Gas Carrier
Hydrogen
Air
Column
INSTRUMENTACIÓN INSTRUMENTACIÓN
Gas de Arraste Inyector “vaporizador Instantáneo”
Convencional
Fase Móvil en CG: NO interacciona con la 1
muestra. 2 5 (3 mL/min)
Split/Splitless
(20-50 mL/min)
Requisitos:
3
INERTE No debe reaccionar con la muestra, 4
fase estacionaria o superfícies del instrumento.
6
PURO Debe estar exenta de impurezas que
puedan degradar la fase estacionaria.
1 - Septum (silicona) FHe=1mL/min
2 - Alimentación gas de arraste)
Impurezas típicas en gases y sus efectos:
3 – Bloque metálico calefactado
oxida / hidroliza algunas FE 4 - Punta de la columna cromatográfica
H2O, O2 incompatibles con DCE 5- Purga del Septum
6- Glass-liner
hidrocarburos ruido en la señal del Col. Rellenas: no split.
DIC Col. Capilares: Inyect. con split/splitless
- División de la muestra inyectada Con división-sin división
SPLIT en dos partes en las que sólo una
se introduce en la columna.
Requerimientos:
- No vaporización previa
- No se requiere septum
Requerimientos:
- Posible sobrecarga de las columnas
- Evitar altas Tª en la zona en la que se introduce la
-Jeringas especiales. Difícil Jeringa.
Inconvenientes automatización - Evitar uso de la columna como elemento intrínseco del
sistema de inyección.
-Límitación al tamaño de muestra
- Permitir inyección automática.
inyectada (vols. pequeños sino
- Elevada velocidad de calentamiento.
inundación)
Ventajas de PTV
INSTRUMENTACIÓN
(inyector de Tª programada) Parámetros de Inyección
TEMPERATURA DEL INYECTOR debe ser lo
suficientemente elevada para que la muestra se
-Introducción muestra sin discriminación (igual a
On-column) vaporice imediatamente sin que exista
descomposición.
- Uso de jeringas standard y cualquier diámetro de Regla General: Tinj = 50oC por encima de la
columna capilar (On-column no). temperatura de ebullición del componente
- Buena reproducibilidad de tiempos de retención menos volátil
(mejores que On-column)
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de
- Evita la descomposición de sustancias columna y del estado físico de la muestra
térmicamente estables (igual que On-column) Muestras Muestras
COLUMNA Líquidas Gasosas
-Residuos de muestra no volátiles no entran en
la columna (en On-column todo entra en col.) empaquetada 0,2 µL ... 20 µL 0,1 ml ... 50 mL
∅ = 3,2 mm (1/4”)
Permite el modo split (no en On-column) capilar 0,01 µL ... 3 µL 0,001 ml ... 0,1 mL
∅ = 0,25 mm
Microjeringa de 10 µ L:
cuerpo (pirex)
cuerpo aguja
guia
êmbolo
INSTRUMENTACIÓN
Columnas: Definiciones Básicas
Columna capilar
EMPAQUETADAS CAPILAR
∅ = 3 a 6 mm ∅ = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Rellena con sólido pul- Paredes internas
verizado (FE sólida o FE recubiertas de fina
líquida depositada sobre película (µ m) de FE
las partículas del relleno) líquida o sólida
INSTRUMENTACIÓN INSTRUMENTACIÓN
Temperatura de la Columna Horno de la Columna
TEMPERATURA UNIFORME EN SU
INTERIOR Sistemas de ventilación
ANALITO ELUYE MAS RAPIDA- interna muy eficientes para mantener
MENTE (MENOR RETENCIÓN) uniforme la temperatura en todo el horno.
INSTRUMENTACIÓN INSTRUMENTACIÓN
Horno de la Columna Efecto de la Temperatura en GC
TEMPERATURA ESTABLE Y
REPRODUCIBLE
La temperatura debe ser mantenida con Tª
una exactitud y precisión de ± 0,1°C.
¡La variación de la retención con la Tª es
característica de cada soluto y sirve para
optimizar la separación!
INSTRUMENTACIÓN INSTRUMENTACIÓN
Programación Lineal de Programación Lineal de
Temperatura Temperatura
Mezclas complejas (constituyentes con La temperatura del horno puede ser variada
volatilidades muy diferentes) separadas linearmente durante la separación:
ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAJA: Se consigue una
-Componentes más volátiles son
buena separación
separados de los
componentes de la
- Componentes menos volá- muestra en menor
tiles tardan en eluir, saliendo tiempo
como picos mal definidos
Parámetros de una programación de temperatura:
TEMPERATURA
TCOL ALTA:
- Componentes más TFIM Temperatura Final
volátiles no son separados R
tINI Tiempo Isotérmico Inicial
TINI
- Componentes menos
volátiles eluyen más tFIM Tiempo Final del Programa
rápidamente tINI tFIM
R Velocidad de calefacción
TIEMPO
Línea Base
Elección del Programa de Tª
BACKFLUSH
Tª f(oC)
t (min)
Gradiente Tª
(oC/min)
Tª o
(oC)
t (min)
K´ = tR – tM / tM
tM
Volatilidad [A]M
22 TB
ln Po = + 17.6
α (SELECTIVIDAD) = tr2´ / tr1´= K´2 / K´1 RT
depende de la Tª, la fase estacionaria, la fase Los solutos se separan por sus
móvil, o de ambas. diferentes puntos de ebullición y por
sus interacciones específicas con FE
TEORIA BÁSICA TEORIA BÁSICA
Eficacia de un Sistema Cromatográfico Medida de la EFICACIA
La migración de un
analito por la
columna provoca
inevitablemente un Cada estadío de
alargamiento de su equilibrio es llamado
banda: PLATO TEÓRICO
TIEMPO
Efectos del alargamiento excesivo de los picos: EFICACIA = Nº PLATOS TEÓRICOS (N)
Separación deficiente de Picos más largos y
analitos con tr próximos. menos intensos = menor El número de platos teó-
detectabilidad ricos de una columna
(N) puede ser calculado
mediante la expresión:
tR
Columna
N más eficiente
EFICACIA : Capacidad de elución con el wb
mínimo de dispersión de un analito.
(L = dependiente de la
columna) mm
Valores típicos de H y N: R = 2 (tr2 – tr1) / (w2 + w1)
dC df H N
0.10 0.25 0.081 370370 Matemáticamente:
0.25 0.25 0.156 192308
0.32 0.32 0.200 150000 α-1 K´
0.32 0.50 0.228 131579
R=¼ N ( )( )
Capilares, L = 30 m α K´ + 1
0.32 1.00 0.294 102041
0.32 5.00 0.435 68966
0.53 1.00 0.426 70423
0.53 5.00 0.683 43924
Rellenas, L = 2 m 2.16 10% 0.549 3643 Término Término Término
2.16 5% 0.500 4000 Selectividad Capacidad
Eficacia
Valores de H para columnas capilares y rellenas son (geometría de (naturaleza de las (factor mixto
próximos, pero como L para capilares es MUCHO la columna) fases y Tª) de capacidad)
mayor columnas capilares son más eficaces
- Término de Eficacia:
Factores que Afectan la
N = 16 (tr/w)2 = 5.5 (tr/w1/2 )2 Eficacia de una Columna
¡¡ Más exacto cuando los picos
no son completamente simétricos !! • Longitud de la Columna
• Diámetro de la Columna (1/4", 1/8",
N=L/H 1/16" de diámetro externo)
• Tamaño de las partículas del
C: 100- 500 x 103 0.1 – 1 mm
R: 5000
empaque
- Valores bajos de H • Naturaleza de las fases
• Grosor de fase estacionaria
Consideraciones
Aumento de H: disminución de N
B
H=A+—+C·ū (A, B, C = constantes)
ū dp: diámetro de las partículas del
- Columnas Capilares: Ecuación de Golay soporte sólido
A = 2 dp λ λ: factor de relleno (depende de
(B, CM, CS = constantes) la dispersión de tamaños de
las partículas).
Curva de
B (Difusión Longitudinal): existe porque todos
los solutos se difunden de un área de concentración Van Deemter
elevada a un área de concentración más baja.
H
V (factor de obstrucción): impedimento
que ofrece el relleno a la difusión
longitudinal.
Cs
B = 2 V Dm
Dm: coeficiente de difusión del soluto
en la fase móvil. Depende de la fase Cm
móvil y la Tª. B es elevado cuando la
fase móvil es gas. A
B/ū
C (Resistencia a la transferencia de Ū (cm/s)
materia): tiempo finito requerido por el soluto para
equilibrarse entre las fases móvil y la estacionaria. Se Aumenta con ū
tarda un tiempo en conseguir los equilibrios de
distribución.
Cm: resistencia a la transferencia de
Independiente de ū Al aumentar ū disminuye
materia desde la fase móvil.
B, porque B requiere un
C = Cm + Cs cierto tiempo. Al aumentar
ū no tienen tiempo para
Cs: resistencia a la transferencia de difundir y B no contribuye
materia desde la fase estacionaria a H.
EN GENERAL:
0.4
H2
B) Fuerzas entre dipolos permanentes y
dipolos inducidos:
inducidos: Se dan entre moléculas
polares y apolares. También disminuyen al
elevar la Tª.
Concepto de POLARIDAD en GC
FE
líquida
SOPORTE
Tubo capilar de
Sólido inerte
material inerte
poroso
Para minimizar la pérdida de FE líquida por
log t´ri - log t´rN volatilización, normalmente es:
Ii = 100N + 100N´ ( ------------------------------)
log tr(N+N´) – log t´rN
Entrecruzada: las Quimicamente ligadas:
N: nº de carbonos del n-alcano eluido antes del soluto i cadenas las cadenas poliméricas
N + N´: nº de carbonos del alcano eluido después del soluto i poliméricas están están “presas” en el
N´: generalmente igual a 1 ó 2. químicamente soporte mediante
ligadas entre si enlaces químicos
SÓLIDOS Columnas rellenas con material finamente
granulado (empaquetadas) o depositado sobre la
superfície interna de un tubo (capilar)
FE Selectiva:
separación
adecuada de los
constituyentes de
la muestra
FE poco Selectiva:
mala resolución con
columna de buena
eficacia
Solutos polares
ADSORCIÓN
DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO Sólidos con gran
DE PUREZA Columnas reproducibles; número de sitios activos
ausencia de picos “fantasma” en los (hidroxilos, pares de
cromatogramas. eletrones...)
CH3
CH3 CH3
FE convencionales no interaccionan diferencialmente O Si O Si
con isómeros ópticos
CH3 CH2
n
Organometálicos: CH2
Separación de mezclas de isómeros
ópticos sólo es posible con FE Separación de O
C3F7
FE Quirales
Chiralsil-Metal
Chiralsil-Dex
- Introducidas en 1983
Tubo de material inerte relleno de FE sólida gra- área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1
La FE líquida debe
nulada o FE líquida depositada sobre un soporte microporos regulares (~ 1 µm)
estar depositada
sólido.
sobre un NO interaccionar con la muestra
SOPORTE sólido Buena resistencia mecánica
acero inox
MATERIAL vidrio pirex ø = 3 mm a 6 mm
DEL Uso casi universal: TIERRA DIATOMEAS
níquel L = 0,5 m a 5 m
TUBO
TEFLON
MESH dp
DETECTORES DETECTORES
Definiciones Generales Parámetros Básicos
Dispositivos que generan una señal elétrica
proporcional a la cantidad eluida de un analito CANTIDAD MÍNIMA DETECTABLE Masa de un
analito que genera un pico con una altura igual a tres
~ 60 detectores ya empleados en CG veces el nivel de ruído
~ 15 equipamientos cromatógraficos S
SEÑAL (S)
=3
comerciales N
LIMITE DE DETECCION Cantidad de analito que SENSIBILIDAD Relación entre el incremento del
área del pico y el incremento de la masa del analito
genera un pico de S/N = 3 y wb = 1 unidad de tiempo
ÁREA
pendiente de la
recta Area del
pico x Masa del
CMD: wb
analito
Detector (señal generada, ruido)
Cantidad
mínima Anchura de pico cromatográfico MASA
detectable = f
DETECTORES DETECTORES
Parámetros Básicos Clasificación
FRANJA LINEAR DINÁMICA Intervalo de masas
dentro del cual la respuesta del detector es linear
UNIVERSALES:
Generan uma señal para
cualquier
A partir de substancia eluida.
ÁREA
cierto punto la
señal no
aumenta más
linearmente
SELECTIVOS:
Detectan substáncias
MASA
com determinadas propriedades
El fín de la da zona de linearidad puede ser detectado físico-químicas.
cuando la relación (Área / Masa) diverge en más de 5
% de la inclinación de la recta en la región linear:
1,05 S
ESPECÍFICOS:
ÁREA / MASA
El efluente de la columna es
mezclado con H2 y O2 y H2
quemado. Como en una llama
de H2 + O2 no existen iones,
no se produce conducción de
la corriente elétrica
COLUMNA
DETECTORES DETECTORES
Detector de ionización de llama Detector de ionización de llama
SELETIVIDAD Seletivo para substancias que TEMPERATURA DE OPERACIÓN El efecto de la
contienen enlaces C-H en su estructura química. temperatura sobre la señal del FID es despreciable
(como virtualmente todas las substancias analizables por CG son
orgánicas, en la prática se le llama Detector UNIVERSAL) TRATAMIENTO DE LA SEÑAL Debido a la baja
magnitud de la corriente elétrica generada (pA y nA)
éstra debe ser amplificada para poder ser registrada.
Compuestos que NO producen respuesta en FID:
2
CCl4, peralogenados
1 Flame tip / Llama / Colector
Principio: el efluente pasa a través de una llama de ► Compuestos o familias de papel sutil o secundario:
hidrógeno/aire a baja Tª en la que los compuestos compuestos o grupos de compuestos que no son capaces de
fosforados y azufrados se descomponen dando transmitir sus notas aromáticas específicas pero que
compuestos que emiten en bandas de 526 y 394 nm, contribuyen de manera neta a alguna nota aromática secun-
respectivamente. Las bandas se aislan mdiante filtros daria o genérica (ej, frutal, dulce). Esa nota será el resultado
adecuados y sus intensidades se registran de la interacción de estos componentes con otros
compartiendo alguna similitud aromática.
fotométricamente.
► “Off-flavours”: componentes cuya presencia lleva asociada
Aplicaciones: determinación de pesticidas Una disminución en la calidad general del aroma.
organofosforados y de compuestos sulfurados volátiles
en alimentos.
¿Por qué realizar análisis aroma en TECNICAS DE EXTRACCIÓN DE AROMAS
alimentos?
- Límites de detección
más bajos que para las
técnicas de
“head-space”
Cromatograma aroma vino blanco
La GC nos da información de un gran
número de compuestos volátiles, pero
¿cuáles son activos aromáticamente?
GC
GC--O
Identificación individual de
espécies presentes en la muestra
Aplicaciones
cualitativas de
CG Determinación de la identidad de
la muestra propriamente dicha
El gráfico: número de
íones formados en
Espectrométrica por Absorción en el función de la relación
Infra-rojo (GC-IR) Masa / Carga de los íones
es el ESPECTRO DE
MASAS del analito
Identificación más fiable al combinarlos con las
técnicas de identificación basadas en la retención MASA / CARGA
Analizador de cuadrupolo
ANÁLISIS CUALITATIVO
Espectrómetro de Masas
1 3
2 4
TIC SIM
Universal Selectivo
m/Z = 90
Similar al FID Mayor Sensibilidad
ANÁLISIS CUALITATIVO ANALISIS CUALITATIVO
GC-MS: TIC x SIM Identificación de compuestos
Busca automática en bibliotecas de espectros:
comparación estatística ( Probability Based Matching )
ESPECTRO
TIC DESCONOCIDO
Aparecen los picos Lista de posibles
candidatos +
correspondientes a PBM porcentage de
todas las substancias confianza
eluídas BIBLIOTECA DE
ESPECTROS
# NOME FÓRM. %
1 1-dodeceno C12H24 99
2 1-dodecanol C12H26O 91
PBM de un C12H24 91
3 ciclododecano
SIM (m/z = 149) compuesto
C12H24 66
4 2-dodeceno
Cromatograma “desconocido” (1-
dodecano) 5 1-undeceno C11H22 35
construido a partir de
los mismos datos de 6 8-metil-3-undeceno C12H24 32
arriba, pero sólo
usando fragmentos con Identificación poco fiable de es-
masa = 149 (ftalatos: pectros muy simples
plastificante)
Limitada por el tamaño de la base
LIMITACIONES:
de datos (NIST = 66.000 espectros)
Diferencias entre espectros
generados por diversos MS
FIN