Las pantallas de mutagénesis química en todo

el genoma permiten una saturación no sesgada

del genoma del cáncer y la identificación de
mutaciones de resistencia a fármacos
La resistencia a los medicamentos es una consecuencia casi inevitable de la terapia contra el
cáncer y, en última instancia, resulta fatal para la mayoría de los pacientes. En muchos casos,
esta es la consecuencia de mutaciones genéticas específicas que tienen el potencial de ser
dirigidas a resensibilizar el tumor. La capacidad de saturar uniformemente el genoma con
mutaciones puntuales sin sesgo de contexto de la secuencia de cromosomas o nucleótidos
abriría la puerta para identificar todas las supuestas mutaciones de resistencia a los fármacos
en los modelos de cáncer. Aquí, describimos este método para dilucidar los mecanismos de
resistencia a los fármacos mediante la utilización de mutagénesis química genómica en conjunto
con la secuenciación de próxima generación. Mostramos que la mutagénesis química del
genoma de las células cancerosas aumenta drásticamente el número de clones resistentes a los
medicamentos y permite la detección de mutaciones tanto conocidas como nuevas de
resistencia a los medicamentos. Utilizamos un proceso computacional eficiente que permite la
identificación rápida de vías implicadas y objetivos farmacológicos. Tal conocimiento a priori
potenciaría enormemente las estrategias de monitoreo en serie para la resistencia a los
medicamentos en la clínica, así como el desarrollo de ensayos para pacientes resistentes a los
medicamentos.

A pesar de una gama cada vez mayor de nuevas terapias contra el cáncer, la resistencia a los
medicamentos es un fenómeno casi universal que probablemente se deba a la presencia de
poblaciones subclonales raras que actúan como reservorio de mutaciones de resistencia. La
aparición de resistencia a los medicamentos finalmente resulta fatal para la mayoría de los
pacientes, y por lo tanto la detección temprana de resistencia y la identificación de nuevas
estrategias de resensibilización es un tema de intensa actividad.

Anteriormente, la identificación de genes de resistencia a fármacos se ha basado en la re-biopsia

de pacientes con cáncer después del desarrollo de resistencia o en el uso de líneas celulares
cancerígenas que se hicieron resistentes por exposición in vitro al fármaco durante muchas
semanas. Ambos enfoques pueden sufrir sesgos inherentes. Con respecto a la primera, la biopsia
de un único sitio resistente de la enfermedad puede pasar por alto los mecanismos de
resistencia alternativos en otros sitios metastásicos (Van Allen et al., 2014). Del mismo modo, la
exposición en serie al fármaco en líneas celulares de cáncer favorecerá clones resistentes a
fármacos preexistentes que son específicos para esa línea celular y puede no representar todo
el espectro de mecanismos de resistencia para ese tratamiento.

Por estas razones, existe un considerable interés en el uso de pantallas genéticas avanzadas
capaces de modificar los eventos mutacionales del genoma del cáncer que pueden analizarse
para determinar su capacidad de causar resistencia a los fármacos de forma imparcial. Tales
pantallas, si son lo suficientemente imparciales, en teoría podrían capturar toda la amplitud de
los mecanismos de resistencia genética para cualquier droga. Estudios recientes han
demostrado la potencia de las pantallas de ganancia y pérdida de función en todo el genoma
usando CRISPR / Cas9, shRNA lentiviral y tecnologías de lectura abierta a gran escala para
identificar mecanismos clínicamente relevantes de resistencia a los medicamentos en el cáncer
(Hu y Zhang 2016). Sin embargo, estas pantallas no logran capturar un tercer mecanismo
importante de resistencia a los medicamentos, a saber, el de las mutaciones puntuales. Las
mutaciones puntuales son responsables de la resistencia en un gran número de pacientes que
reciben terapias dirigidas en melanoma, cáncer de colon y pulmón y leucemia mieloide crónica
(tabla complementaria S1; Kobayashi et al., 2005; Katayama et al., 2012; Montagut et al., 2012;
Ohashi et al. al. 2012; Bettegowda 2014; Long et al., 2014; Van Allen et al., 2014; Wagle et al.,
2014; Arena et al., 2015; Russo, et al., 2015; Siravegna et al., 2015; Thress et al., 2015) .

La N-etil-N-nitrosourea (ENU) se ha utilizado como un potente mutágeno en modelos de

desarrollo de ratones durante más de cuatro décadas (Acevedo-Arozena et al., 2008). La
exposición produce la generación eficiente de mutaciones puntuales aleatorias en todo el
genoma celular (Tokunaga et al., 2014). Por lo tanto, probamos si, en los modelos de línea celular
de cáncer, ENU podría utilizarse para mutagenizar el genoma y permitir la expansión de las
células resistentes a los medicamentos después de la aplicación de un agente específico. Como
prueba de concepto, decidimos investigar si este enfoque podría identificar todas las
mutaciones de resistencia clínicamente demostradas en pacientes con cáncer colorrectal
tratados con el anticuerpo monoclonal EGFR Cetuximab (Van Cutsem et al., 2009). En la clínica,
la resistencia en tales pacientes está fuertemente impulsada por mutaciones puntuales, y una
década de estudios clínicos ha identificado la gran mayoría de las mutaciones de resistencia.
Esta "verdad fundamental" debería, en teoría, permitirnos definir qué tan bien una pantalla de
mutagénesis de saturación puede identificar mutaciones de resistencia clínicamente relevantes.

Utilizamos un enfoque de secuenciación e informática para detectar mutaciones de resistencia

novedosas a partir de datos de secuencia de próxima generación y para detectar el
enriquecimiento estadístico para mutaciones mutuamente excluyentes en vías de señalización
específicas que comprenden más de 8000 genes en el nivel de población de muestra. Nuestra
pantalla de mutagénesis fue capaz de identificar con éxito todas las mutaciones conocidas de
resistencia a medicamentos para Cetuximab previamente observadas en la clínica, así como una
nueva mutación que posteriormente identificamos en un paciente con cáncer colorrectal.
Sugerimos que este enfoque sea un medio poderoso y fácil para dibujar el paisaje de las
mutaciones puntuales que confieren resistencia a las terapias dirigidas. Tal conocimiento podría
usarse para descubrir estrategias terapéuticas para resensibilizar tumores resistentes, así como
para identificar qué genes deberían priorizarse para la monitorización no invasiva durante el
tratamiento mediante la secuenciación del ADN plasmático.

Resultados

La exposición a ENU confiere una resistencia estable al Cetuximab en las células de cáncer de
colon

Se seleccionaron 51 líneas celulares de cáncer colorrectal con un rango de concentración del

anticuerpo monoclonal EGFR Cetuximab y se evaluó la viabilidad después de 6 días (figura 1A).
De acuerdo con la experiencia clínica de los factores genéticos que sustentan la respuesta a este
fármaco, las líneas celulares de tipo silvestre para KRAS / NRAS / BRAF (barras verdes) exhibieron
una mayor sensibilidad a Cetuximab (Douillard et al., 2013). Por lo tanto, elegimos dos de estas
líneas, CCK-81 y NCI-H508, para usar en el experimento de resistencia ENU. Ambas líneas
celulares demostraron adicionalmente la sensibilidad de Cetuximab en ensayos de
supervivencia clonogénica a largo plazo (Fig. S1 suplementaria). Además, CCK-81 tiene
características de inestabilidad de microsatélites (MSI), mientras que NCI-H508 es estable a
microsatélites (MSS). La MSI se detecta en el 16% de los cánceres colorrectales y se asocia con
un fenotipo y resultado clínico diferente en comparación con los cánceres de MSS. La línea
celular CCK-81 se expuso a un intervalo de dosis de ENU (0,01-1 mg / ml) durante 24 h, después
de lo cual las células mutagenizadas se trataron con Cetuximab (10 μg / ml) durante 8 semanas
consecutivas. Se contó el número de colonias resistentes a los medicamentos al final del
experimento. Es importante destacar que no se observaron colonias resistentes a fármacos en
ausencia de ENU (figura 1B). Al aumentar la concentración de ENU, observamos un aumento
lineal tanto en el número de colonias resistentes a los medicamentos (eje y izquierdo, barras
azules) como en el número de mutaciones por clon (eje y derecho, triángulos verdes).
Posteriormente, utilizamos una concentración de ENU (0.1 mg / mL) que resultó en un efecto
de viabilidad mínimo en ambas líneas celulares (Métodos). A continuación, tratamos las células
NCI-H508 con ENU (0,1 mg / ml) durante 24 h, seguido de tratamiento semanal con Cetuximab
durante ocho semanas. Las colonias resistentes a los fármacos se recogieron, se expandieron en
cultivo y 72 se sometieron a la secuenciación completa de Illumina (un total de 14 colonias CCK-
81 y 58 NCI-H508). Los datos se analizaron para sustituciones e inserciones / deleciones para
permitir una estimación del número de mutaciones asociadas a ENU por Mb de exoma y para
detectar mutaciones nuevas (y supuestas de resistencia a fármacos) (Tabla Suplementaria S2).
Luego realizamos ensayos de supervivencia clonogénica en un subconjunto de clones resistentes
y confirmamos una resistencia robusta y estable al Cetuximab (Fig. 1C).

Figura 1.

Figura 1.

Pantallas de mutagénesis química en todo el genoma para definir las vías de resistencia a los
fármacos en el cáncer. (A) Pantalla de viabilidad de Cetuximab en líneas celulares de cáncer
colorrectal. Se analizaron 51 líneas celulares de cáncer colorrectal con un rango de
concentración del anticuerpo monoclonal EGFR ...
Figura 1.

Pantallas de mutagénesis química en todo el genoma para definir las vías de resistencia a los
fármacos en el cáncer. (A) Pantalla de viabilidad de Cetuximab en líneas celulares de cáncer
colorrectal. Se analizaron 51 líneas celulares de cáncer colorrectal con un rango de
concentración del anticuerpo monoclonal EGFR ...

El espectro de mutaciones inducidas por ENU

La capacidad de cualquier cribado de mutagénesis para capturar un fenotipo particular depende

fuertemente de su capacidad para saturar uniformemente el genoma con las seis clases posibles
de tipo de sustitución de bases (expresado como la pirimidina de un par de bases de Watson-
Crick mutado, C> A, C > G, C> T, T> A, T> C, T> G). En promedio, detectamos 470 nuevas
mutaciones por exoma en cada clon (media 570 y 446 en clones CCK-81 y NCI-H508,
respectivamente), para un total de 33.857 (Tabla S2 complementaria). Las mutaciones se
componían casi exclusivamente de sustituciones de bases (96% del total). Un tercio de tales
mutaciones fueron variantes no sinónimas (missense) dentro del exón codificador de un gen,
donde las mutaciones de resistencia son más propensas a ocurrir (Fig. 2A). Solo el 4% fueron
posibles mutaciones truncadoras con pérdida de función (indels de desplazamiento del marco o
mutaciones sin sentido). Las mutaciones restantes fueron predominantemente silenciosas o
intrónicas. Significativamente, el análisis de los datos de secuencias del exoma en los 72 clones
(independientemente de si MSS o MSI) reveló que de las seis clases posibles de sustitución de
bases, solo las sustituciones C> G están menos representadas (3% de todos los cambios de la
base de sustitución) (Fig. 2A). El espectro de mutación en clones derivados de ENU fue similar
independientemente de si las células procedían de un fondo de MSI o MSS (Fig. S2
suplementaria). No hubo evidencia de un sesgo significativo hacia las mutaciones en la
codificación de genes en un cromosoma en particular o, de hecho, en cualquier región específica
dentro de un cromosoma (Fig. 2B; Fig. S3 suplementaria). Sin embargo, dado que estas 33.857
mutaciones son una mezcla de las causadas por ENU, procesos mutacionales de fondo y
variantes subclonales privadas, elegimos utilizar un enfoque matemático para extraer
específicamente la firma ENU de los datos y determinar con mayor precisión el espectro de
mutación de las mutaciones ENU .

Figura 2.

El espectro de mutaciones inducidas por ENU. (A) Espectro de mutaciones en clones resistentes
a fármacos derivados de ENU. Representación gráfica circular de la proporción de 33.857
mutaciones detectadas en los clones CCK-81 y NCI-H508 categorizados de acuerdo con el tipo
de mutación. Por ...

El algoritmo de factorización de matriz no negativa se utilizó previamente para detectar la

presencia de firmas mutacionales en cánceres humanos, incluidos los defectos en la reparación
del desajuste de ADN y la actividad alterada de la polimerasa POLE propensa a errores
(http://cancer.sanger.ac. uk / cosmic / firmas) (Alexandrov et al., 2013b). Extrae las firmas
basadas en una clasificación de 96 mutaciones que incorpora los seis tipos de sustitución de
bases descritos anteriormente, así como el contexto de la secuencia flanqueante inmediata de
la base mutada (cuatro posibles bases 5 'y cuatro posibles 3'). En nuestros datos, reveló una
firma distintiva y única que se representó en casi todos los contextos de trinucleótidos en clones
CCK-81 y NCI-H508 y no se detectó previamente en estudios tumorales previos, incluido un panel
de 51 líneas celulares de cáncer colorrectal (datos no mostrado) (Fig. 2C; Suplementario Fig. S4).
Esta firma ("Firma A") es probablemente una de exposición ENU. De manera tranquilizadora, el
patrón de sustituciones de bases que comprende esta firma fue casi idéntico al observado en
todo el conjunto de sustituciones detectadas en los clones derivados de ENU, con solo
nuevamente sustituciones C> G vistas a frecuencias más bajas (figura 2C). Por lo tanto, utilizando
este enfoque, debería ser factible generar la mayoría de las mutaciones teóricas del punto de
codificación para la resistencia a los fármacos en todo el genoma.

Como era de esperar, detectamos una firma de MSI ("Firma B") en el catálogo de mutaciones
combinadas para los clones CCK-81, pero sorprendentemente también en los clones NCI-H508
(Supplemental Fig. S4; Alexandrov et al., 2013a). En un examen más detallado, esta firma fue el
resultado de dos clones hipermutadores en el catálogo de mutaciones NCI-H508 (flechas rojas)
(clones NCI-H508_26 y NCI-H508_40) (Fig. S5 suplementaria). Estos clones tenían tasas de
mutación tan altas como cualquiera de los clones de MSI CCK-81 y un número incrementado de
inserciones y deleciones pequeñas. Esto estaría de acuerdo con un defecto en la vía de
reparación de desajuste (Tabla Suplementaria S2). Se descubrió que el clon NCI-H508_26
albergaba una nueva mutación sin sentido (stop-gain) en el gen de reparación del
desapareamiento MLH1, y el clon NCI-H508_40 albergaba una mutación sin sentido en el gen de
reparación del ADN EXO1. Otros dos clones (flechas negras) también tienen tasas de mutación
elevadas que pueden ser el resultado de la obtención de mutaciones sin sentido en POLQ, un
gen implicado en la reparación del daño del ADN. Estos dieron lugar a la tercera firma de origen
desconocido detectada en clones NCI-H508 ("Firma C") (Fig. S4 suplementaria).

La mutagénesis ENU identifica mutaciones y vías de resistencia clínicamente relevantes

Un desafío en la identificación de mutaciones de resistencia a fármacos en clones derivados de

ENU es que cada clon alberga cientos de mutaciones de "pasajeros" además de la resistencia
que confiere. Presumimos que con una población suficiente de clones resistentes individuales
podría ser factible utilizar el enriquecimiento estadístico para mutaciones codificantes no
sinónimas en vías específicas para ayudar a identificar mutaciones de resistencia a fármacos.
Por lo tanto, utilizamos un marco estadístico (SLAPenrich) para identificar si las alteraciones
genéticas observadas en muestras múltiples se enriquecen dentro de una vía específica de
manera estadísticamente significativa utilizando una red de 8056 genes únicos
(https://github.com/saezlab/SLAPenrich) ( Iorio et al. 2016). Una vez que se identifican las vías
significativamente enriquecidas, SLAPenrich aplica un filtro final basado en la tendencia de los
genes en una vía seleccionada positivamente a mutarse de una manera mutuamente exclusiva.
Al aplicar este método al conjunto de mutaciones ENU a través de los 72 clones resistentes a
Cetuximab, encontramos varias vías enriquecidas estadísticamente (tasa de descubrimiento
falso [FDR] <5%) (Tabla Suplementaria S3). La ruta más significativamente enriquecida con
mutaciones, "Señalización a P38 a través de RIT y RIN", contiene muchos de los genes clave de
la vía canónica MAP quinasa (Fig. 3A). En total, pudimos identificar mutaciones de resistencia
creíbles en 42 de los 72 clones resistentes (59%) (Tabla Suplementaria S4). Detectamos
mutaciones de resistencia creíbles en todos los genes previamente encontrados clínicamente
para conferir resistencia al tratamiento con EGFR en el cáncer colorrectal (Tabla Suplementaria
S1). Se encontró que EGFR, KRAS, NRAS, BRAF y MAP2K1 (también conocidos como MEK1)
estaban mutados en tres o más clones y de una manera mutuamente excluyente. No hubo una
diferencia clara en la frecuencia de mutaciones específicas entre NCI-H508 y CCK-81. Además,
38/42 (90%) de estas supuestas mutaciones de resistencia se han identificado previamente en
pacientes colorrectales que desarrollan resistencia a Cetuximab. La mutación de resistencia ENU
más frecuentemente observada fue la de BRAF p.V600E (13/42 clones), seguida de NRAS p.Q61K
(8/42) y KRAS p.G12C (4/42) (Fig. 3B, C; Fig. S6). estas mutaciones son todas mutaciones
conductoras canónicas en la tumorigénesis y se sabe que activan la señalización oncogénica y
confieren resistencia a Cetuximab tanto experimental como clínicamente (Diaz et al., 2012;
Misale et al., 2012). También detectamos mutaciones de EGFR en tres de los clones resistentes.
Se ha demostrado que la sustitución de EGFR I491K induce cambios estructurales en el dominio
extracelular de EGFR, tal como para prevenir la unión de Cetuximab y conferir resistencia
(Montagut et al., 2012). Es de destacar que las mutaciones adicionales también presentes en la
red "Señalización a P38 vía RIT y RIN" (p. Ej., JAK1, IL6R, RAF1) no se llevaron adelante para
investigación ya que estas mutaciones estaban presentes en clones que también albergaban
otros controladores más creíbles de resistencia a fármacos y estuvieron presentes a baja
frecuencia (menos de tres clones) (Fig. S7 suplementaria).

Figura 3.
La mutagénesis ENU identifica mutaciones y vías clínicamente relevantes. (A) La vía más
enriquecida con mutaciones, "Señalización a P38 a través de RIT y RIN", contiene muchos de los
genes clave de la vía canónica MAP quinasa, ...

Un análisis de enriquecimiento de mutaciones identifica genes de resistencia a fármacos

Estudios recientes de grandes conjuntos de datos mutacionales de estudios de secuenciación de

cáncer han utilizado enfoques estadísticos que consideran el espectro de mutación, la secuencia
de cada gen, el impacto de las sustituciones de codificación (sinónimo, sin sentido, sin sentido,
sitio de empalme) y la variación de la tasa de mutación para detectar nuevos genes de cáncer
(Nik-Zainal et al., 2016). Adaptamos este método "dN / dS" (no sinónimo / sinónimo) para
analizar las mutaciones identificadas en los clones resistentes a fármacos ENU (Métodos). Como
este enfoque fue diseñado para el análisis de muestras tumorales no relacionadas y tenemos
instancias de clones que comparten mutaciones que reflejan un origen subclonal común dentro
de las líneas celulares parentales originales, primero condensamos los 72 clones ENU en 19
grupos representativos, cada uno la unión de todos las mutaciones en clones que comparten
más de tres mutaciones. Se identificaron tres genes que tenían un patrón de mutaciones que
respaldaban la selección positiva, a saber, NRAS, KRAS y MAP2K1 (FDR <0.05) (Tabla
Suplementaria S5). Después de estos, el siguiente gen más alto clasificado fue BRAF; aunque fue
de importancia límite (FDR = 0.0508), es un candidato muy fuerte para un gen de resistencia
porque 4/6 de las mutaciones se encuentran en el locus canónico p.V600.

La mutagénesis ENU identifica nuevas mutaciones de resistencia en MAP2K1

Recientemente, dos estudios de secuenciación de ADN plasmático en pacientes con cáncer

colorrectal sometidos a tratamiento con anticuerpos monoclonales EGFR identificaron
conjuntamente las primeras mutaciones de resistencia del codón MAP2K1 K57 (p.K57T y
p.K57N) (Russo et al., 2015; Siravegna et al., 2015). En nuestro estudio, también identificamos
mutaciones MAP2K1 en el codón K57 (p.K57N, p.K57E) así como en dos sitios no informados
previamente (p.F53L, p.C121S) (Tabla Suplementaria S4). Por lo tanto, secuenciamos estos loci
MAP2K1 (junto con hotspots de mutaciones adicionales en otros 34 genes) en una serie de
muestras de ADN plasmático recogidas de 22 pacientes con cáncer colorrectal que adquirieron
resistencia al tratamiento con terapias EGFR (Cetuximab o Panitumumab) después de una
respuesta inicial. Además de todas las mutaciones canónicas de resistencia conocidas (en KRAS,
NRAS y BRAF), detectamos en uno de estos pacientes una nueva mutación p.F53L MAP2K1
predicha por nuestra pantalla como una mutación de resistencia (Tabla 1, Fig. 4A) . Como se
informó anteriormente, detectamos más de una posible mutación de resistencia en varios de
estos pacientes, de acuerdo con diferentes sitios metastásicos que evolucionan a diferentes
mecanismos de resistencia.

Figura 4.

La mutagénesis ENU identifica una nueva mutación de resistencia MAP2K1 que se detecta en un
paciente con cáncer colorrectal después de una respuesta inicial a Cetuximab. (A) Un paciente
con cáncer colorrectal con metástasis hepáticas inoperables fue tratado con la combinación de
...
Tabla 1.

Tabla 1.

Identificación de alteraciones genéticas asociadas con la resistencia a anticuerpos anti-EGFR en

muestras de plasma de 22 pacientes con cáncer colorrectal

Para validar funcionalmente los efectos de resistencia de estas mutaciones MAP2K1, tratamos
células CCK-81 que expresan las nuevas mutaciones p.F53L y p.C121S, así como la mutación
p.K57N previamente identificada con Cetuximab (junto con vectores vacíos y controles de tipo
salvaje MAP2K1 ) Encontramos que todas nuestras mutaciones de resistencia candidatas
indujeron resistencia a Cetuximab, y la fuerza del efecto de resistencia para las mutaciones fue
comparable a la conferida por la sobreexpresión de la tirosina quinasa receptora MET, un
mecanismo de resistencia previamente identificado (Fig. 4B, izquierda; Bardelli et al. 2013). Los
ensayos de inhibición del crecimiento a largo plazo mostraron una resistencia robusta y
duradera a Cetuximab en las células mutantes MAP2K1 (Fig. 4B, derecha). El análisis de
inmunotransferencia demostró una fosforilación constitutiva elevada de ERK1 / 2 así como una
falla para suprimir completamente la expresión de pERK1 / 2 después del tratamiento con
Cetuximab en todos los clones mutantes de MAP2K1 (figura 4C).

El direccionamiento racional de las vías puede resensibilizar mutantes resistentes a los

medicamentos a Cetuximab

La señalización constitutiva de EGFR en tumores sólidos activa una serie de rutas pro-
supervivencia / proliferación corriente abajo que incluyen PKC, PI3K / AKT / mTOR, JAK-STAT y
MAPK (Supplemental Fig. S8A; Shostak y Chariot 2015). En las células dependientes de EGFR, el
tratamiento con inhibidores de EGFR afecta la supervivencia celular mediante el cierre de tales
procesos. La identificación de las principales vías de señalización que sustentan la resistencia a
los medicamentos abre la posibilidad de orientar racionalmente los componentes clave de
dichas vías de resistencia y, por lo tanto, de volver a sensibilizar las células. La creación de líneas
celulares resistentes mutagenizadas, ya sea a través de la pantalla ENU o mediante la
modificación genética deliberada de la línea celular parental para mutaciones específicas, nos
permitió la oportunidad de que tales experimentos se llevaran a cabo in vitro. Como en la
práctica clínica, la vía más frecuentemente mutada en los clones de ENK resistente a fármacos
CCK-81 y NCI-H508 converge hacia los miembros de la familia MAPK, y se puede esperar que la
selección de estos nodos supere la resistencia (figura 3C). Por ejemplo, un clon mutante CCK-81
BRAF V600E resistente a Cetuximab (ENU-10) se volvió a sensibilizar cuando el anticuerpo
monoclonal de EGFR se combinó con el inhibidor de BRAF Dabrafenib (Figura complementaria
S9A). En las células mutantes, la mutación activadora de BRAF permitiría que tales células
continúen señalizando a través de la ruta de MAPK (y sobrevivan) a pesar del bloqueo de EGFR
(Fig. S8B suplementaria). Por lo tanto, solo atacando tanto a EGFR como a BRAF en combinación,
se pueden silenciar todos los efectores de supervivencia relevantes y se puede reducir la
viabilidad de las células. Los clones resistentes a Cetuximab que albergan mutaciones (en KRAS,
NRAS y MAP2K1) que se predice que activan la señalización de MAPK se volvieron a sensibilizar
cuando se combinó un inhibidor de MEK (Trametinib) con Cetuximab (Fig. S9B suplementaria).
De forma similar, la combinación de Cetuximab con Trametinib resensibilizó casi completamente
las células CCK-81 mutantes MAP2K1 resistentes (Fig. 5A, B). De hecho, tal combinación ya se ha
sugerido como estrategia terapéutica putativa para pacientes con cáncer de colon (Misale et al.,
2014).

Figura 5.

Figura 5.

Orientación racional de las vías de resistencia para resensibilizar mutantes resistentes a los
fármacos. (A) Ensayo de supervivencia clonogénica de células CCK-81 mutantes MAP2K1 cuando
se tratan con Cetuximab, Trametinib o una combinación de los dos fármacos. Mapas de calor de
viabilidad normalizada ... Figura 3.

La mutagénesis ENU identifica mutaciones y vías clínicamente relevantes. (A) La vía más
enriquecida con mutaciones, "Señalización a P38 a través de RIT y RIN", contiene muchos de los
genes clave de la vía canónica MAP quinasa, ...

Un análisis de enriquecimiento de mutaciones identifica genes de resistencia a fármacos

Estudios recientes de grandes conjuntos de datos mutacionales de estudios de secuenciación de

cáncer han utilizado enfoques estadísticos que consideran el espectro de mutación, la secuencia
de cada gen, el impacto de las sustituciones de codificación (sinónimo, sin sentido, sin sentido,
sitio de empalme) y la variación de la tasa de mutación para detectar nuevos genes de cáncer
(Nik-Zainal et al., 2016). Adaptamos este método "dN / dS" (no sinónimo / sinónimo) para
analizar las mutaciones identificadas en los clones resistentes a fármacos ENU (Métodos). Como
este enfoque fue diseñado para el análisis de muestras tumorales no relacionadas y tenemos
instancias de clones que comparten mutaciones que reflejan un origen subclonal común dentro
de las líneas celulares parentales originales, primero condensamos los 72 clones ENU en 19
grupos representativos, cada uno la unión de todos las mutaciones en clones que comparten
más de tres mutaciones. Se identificaron tres genes que tienen un patrón de mutaciones que
respaldan

Figura 4.

La mutagénesis ENU identifica una nueva mutación de resistencia MAP2K1 que se detecta en un
paciente con cáncer colorrectal después de una respuesta inicial a Cetuximab. (A) Un paciente
con cáncer colorrectal con metástasis hepáticas inoperables fue tratado con la combinación de
...

Tabla 1.

Tabla 1.

Identificación de alteraciones genéticas asociadas con la resistencia a anticuerpos anti-EGFR en

muestras de plasma de 22 pacientes con cáncer colorrectal

Para validar funcionalmente los efectos de resistencia de estas mutaciones MAP2K1, tratamos
células CCK-81 que expresan las nuevas mutaciones p.F53L y p.C121S, así como la mutación
p.K57N previamente identificada con Cetuximab (junto con vectores vacíos y controles de tipo
salvaje MAP2K1 ) Encontramos que todas nuestras mutaciones de resistencia candidatas
indujeron resistencia a Cetuximab, y la fuerza del efecto de resistencia para las mutaciones fue
comparable a la conferida por la sobreexpresión de la tirosina quinasa receptora MET, un
mecanismo de resistencia previamente identificado (Fig. 4B, izquierda; Bardelli et al. 2013). Los
ensayos de inhibición del crecimiento a largo plazo mostraron una resistencia robusta y
duradera a Cetuximab en las células mutantes MAP2K1 (Fig. 4B, derecha). El análisis de
inmunotransferencia demostró una fosforilación constitutiva elevada de ERK1 / 2 así como una
falla para suprimir completamente la expresión de pERK1 / 2 después del tratamiento con
Cetuximab en todos los clones mutantes de MAP2K1 (figura 4C).

El direccionamiento racional de las vías puede resensibilizar mutantes resistentes a los

medicamentos a Cetuximab

La señalización constitutiva de EGFR en tumores sólidos activa una serie de rutas pro-
supervivencia / proliferación corriente abajo que incluyen PKC, PI3K / AKT / mTOR, JAK-STAT y
MAPK (Supplemental Fig. S8A; Shostak y Chariot 2015). En las células dependientes de EGFR, el
tratamiento con inhibidores de EGFR afecta la supervivencia celular mediante el cierre de tales
procesos. La identificación de las principales vías de señalización que sustentan la resistencia a
los medicamentos abre la posibilidad de orientar racionalmente los componentes clave de
dichas vías de resistencia y, por lo tanto, de volver a sensibilizar las células. La creación de líneas
celulares resistentes mutagenizadas, ya sea a través de la pantalla ENU o mediante la
modificación genética deliberada de la línea celular parental para mutaciones específicas, nos
permitió la oportunidad de que tales experimentos se llevaran a cabo in vitro. Como en la
práctica clínica, la vía más frecuentemente mutada en los clones de ENK resistente a fármacos
CCK-81 y NCI-H508 converge hacia los miembros de la familia MAPK, y se puede esperar que la
selección de estos nodos supere la resistencia (figura 3C). Por ejemplo, un clon mutante CCK-81
BRAF V600E resistente a Cetuximab (ENU-10) se volvió a sensibilizar cuando el anticuerpo
monoclonal de EGFR se combinó con el inhibidor de BRAF Dabrafenib (Figura complementaria
S9A). En las células mutantes, la mutación activadora de BRAF permitiría que tales células
continúen señalizando a través de la ruta de MAPK (y sobrevivan) a pesar del bloqueo de EGFR
(Fig. S8B suplementaria). Por lo tanto, solo atacando tanto a EGFR como a BRAF en combinación,
se pueden silenciar todos los efectores de supervivencia relevantes y se puede reducir la
viabilidad de las células. Los clones resistentes a Cetuximab que albergan mutaciones (en KRAS,
NRAS y MAP2K1) que se predice que activan la señalización de MAPK se volvieron a sensibilizar
cuando se combinó un inhibidor de MEK (Trametinib) con Cetuximab (Fig. S9B suplementaria).
De forma similar, la combinación de Cetuximab con Trametinib resensibilizó casi completamente
las células CCK-81 mutantes MAP2K1 resistentes (Fig. 5A, B). De hecho, tal combinación ya se ha
sugerido como estrategia terapéutica putativa para pacientes con cáncer de colon (Misale et al.,
2014).

Figura 5.

Figura 5.

Orientación racional de las vías de resistencia para resensibilizar mutantes resistentes a los
fármacos. (A) Ensayo de supervivencia clonogénica de células CCK-81 mutantes MAP2K1 cuando
se tratan con Cetuximab, Trametinib o una combinación de los dos fármacos. Mapas de calor de
viabilidad normalizada ...

Discusión

Al inicio de este estudio, propusimos que independientemente de la tecnología de

secuenciación que se utilice para detectar mutaciones de puntos de resistencia, algún
conocimiento a priori de los posibles candidatos de resistencia a los fármacos debería aumentar
en gran medida la sensibilidad de dichos ensayos. Identificar el catálogo completo de efectores
de resistencia a fármacos para cualquier fármaco requiere estudios in vitro que modelen la
resistencia en el tejido relevante y el entorno genético. En el pasado, tales estudios in vitro
presentaban líneas celulares que habían sido sometidas a pases seriados en presencia del
fármaco candidato con el fin de forzar la aparición de clones resistentes (Ogino et al., 2007;
Turke et al., 2010; Katayama et al., 2011; Eberlein et al. 2015). Aunque dichos estudios han
identificado con éxito mecanismos clínicamente relevantes de resistencia a los medicamentos
en algunos casos, están predispuestos a seleccionar aquellos subclones resistentes
preexistentes que son particulares de esa línea celular específica.

Como un medio para generar mutaciones puntuales aleatorias por todo el genoma, ENU
mutagénesis química y la detección posterior fenotipo impulsado ha sido fundamental para una
comprensión completa de la complejidad de los procesos biológicos operan en organismos
modelo clásico incluyendo la levadura (Forsburg 2001), moscas (St Johnston 2002 ), pez cebra
(Patton y Zon 2001) y, tal vez más ampliamente, ratones (Kile y Hilton 2005). El agente alquilante
N-etil-N-nitrosourea (ENU) puede introducir una alta tasa de mutaciones puntuales en el
genoma y tiene dos ventajas distintas sobre los mutágenos utilizados anteriormente. Primero,
es muy eficiente, induciendo una mutación puntual cada 1-2 Mb a lo largo del genoma en
modelos de ratón (~100 veces más que la tasa de mutación espontánea y tres veces más alta
que la irradiación X) (Concepción et al., 2004). En segundo lugar, a diferencia de la irradiación,
que induce deleciones multilocus, ENU es un mutágeno puntual y afecta a loci únicos. ENU
funciona mediante la transferencia de su grupo etilo a átomos de oxígeno o nitrógeno en el ADN,
lo que da como resultado una identificación errónea de estas bases etiladas durante la
replicación. Si la falta de coincidencia no se repara, se produce una sustitución de pares de bases
(Justicia 2000). Hasta la fecha, el uso de ENU para definir los mecanismos de resistencia a
fármacos en el cáncer se ha centrado en genes específicos en modelos de líneas celulares no
cancerosas en lugar de interrogar a todo el genoma codificador (Tiedt et al., 2011; Zhang et al.,
2011; Ercan et al. 2015). Los estudios de secuenciación previos de mutaciones derivadas de ENU
en modelos de ratón y mosca demostraron un fuerte sesgo en el espectro de mutaciones de
sustitución observadas, con un número especialmente bajo de mutaciones C> G, T> G y C> A.
Observamos una representación mucho más equilibrada de los seis posibles contextos de
sustitución de bases en nuestras células cancerosas humanas después de la exposición a ENU
(Tabla Suplementaria S8). Por lo tanto, debería haber un mayor potencial para identificar un
mayor número de mutaciones de resistencia, independientemente de su espectro de mutación.
Además, comparamos el espectro de mutación de ENU con el de otro mutágeno, a saber, la
radiación gamma. Se irradiaron dos líneas celulares de cáncer (MSI frente a MSS), y las células
individuales se expandieron a clones antes de la secuenciación del exoma. Observamos que el
espectro de la mutación difería bastante significativamente para las dos líneas celulares, lo que
sugiere que a diferencia de la mutagénesis ENU, hay un mayor efecto específico de la línea
celular en el patrón de mutaciones observadas (Fig. S10 suplementaria). Esto debería tenerse
en cuenta si se usara irradiación gamma para la detección de genes de resistencia a fármacos.

Debido a que es probable que solo un alelo mute para cualquier gen específico, y <5% de las
mutaciones ENU son capaces de anular la expresión de proteínas (es decir, sin sentido,
frameshift o mutaciones esenciales del sitio de empalme), la pantalla está fuertemente sesgada
hacia la ganancia de función o mutaciones de punto dominante. Los genes de resistencia a la
pérdida de función se captarían mejor a través de pantallas de inactivación CRISPR de genoma
completo o utilizar ENU en el establecimiento de modelos de células haploides (aunque cuán
relevantes son para las células cancerosas aneuploidías podría ser un problema confuso).

Un desafío importante en la interpretación de la detección dirigida por fenotipo de los modelos

de mutación ENU es identificar las mutaciones del conductor de las mutaciones del pasajero.
Esto es de particular importancia en nuestro experimento porque la mutagénesis ENU genera
un promedio de casi 500 nuevas mutaciones por clon resistente a fármacos. Planteamos que,
además de la recurrencia, la evidencia de que las mutaciones múltiples se enriquecieron dentro
de la misma red o vía de una manera mutuamente exclusiva aumentaría la probabilidad de que
estos sean eventos del conductor. Existe una larga historia de uso de recursos públicos de dichas
redes para identificar genes enriquecidos. Usamos un algoritmo (SLAPenrich) para modelar la
probabilidad de observar un número dado de muestras con mutaciones en la ruta considerada
mediante una distribución binomial de Poisson. Es importante señalar que la identificación de
mutaciones de resistencia en dichos datos de mutagénesis ENU depende en gran medida de la
recurrencia de las mismas mutaciones en múltiples muestras; por lo tanto, la identificación de
mutaciones de resistencia raras será un desafío a menos que se generen y secuencien números
masivos de clones de resistencia. Esto es especialmente pertinente con respecto a los 30 clones
resistentes a los fármacos CCK-1 o NCH-H508, en los que SLAPenrich no pudo detectar el
enriquecimiento estadístico de las mutaciones en las vías específicas. Sugerimos al menos dos
explicaciones plausibles: (1) Estas mutaciones son raras (y por lo tanto no recurrentes) y, por lo
tanto, no se agrupan en vías previamente caracterizadas interrogadas por SLAPenrich; y (2) la
resistencia observada es el resultado de mutaciones fuera del exoma de codificación (por
ejemplo, en regiones potenciador / promotor o [UTR] no traducido) y por lo tanto no susceptible
de detección usando este enfoque de captura de exoma completo. Con respecto a la primera
posibilidad, volvimos a ejecutar SLAPenrich después de eliminar cualquier variante en los genes
putativos de resistencia previamente identificados (BRAF, KRAS, NRAS, MAP2K1, etc.) para
aumentar la potencia de detección de vías enriquecidas adicionales; encontramos nueve vías
que se enriquecieron al considerar un umbral de significación mucho menos estricto (FDR <20%).
Estos estaban dominados por vías de señalización de neurotransmisores (Tabla Suplementaria
S9). Dado lo que sabemos hoy sobre la señalización de EGFR, estos no son candidatos plausibles
para conferir resistencia a Cetuximab. Finalmente, investigar la posibilidad de mutaciones no
codificadoras como impulsores de resistencia requeriría la secuenciación del genoma completo
de estas muestras hipermutadas (cada una con aproximadamente 50,000 mutaciones por
genoma) y el desarrollo de enfoques estadísticos para la detección de recurrencia en regiones
no codificantes. Tales algoritmos se encuentran actualmente en desarrollo como parte del
análisis PanCancer de Whole Genomes (http://pancancer.info/) que está llevando a cabo el
análisis de más de 2000 genomas completos. Por lo tanto, a medida que caigan los costos de
secuenciación del genoma completo y se desarrollen herramientas analíticas para el genoma no
codificante, estos clones de ENU que albergan posibles mutaciones puntuales de resistencia no
codificadora podrían resecuenciarse y analizarse de nuevo.

Aquí, establecemos un modelo para el uso de pantallas de mutagénesis química en todo el

genoma para capturar la diversidad de mutaciones de codificación de proteínas de resistencia a
fármacos clínicamente relevantes en células de cáncer aneuploide. Como prueba de concepto,
utilizamos esta pantalla en el marco de una terapia de EGFR y cáncer colorrectal, una
enfermedad en la cual la respuesta a dicha terapia es seguida invariablemente por la adquisición
de resistencia. Dichos mecanismos de resistencia están fuertemente dominados por mutaciones
puntuales en la vía de señalización MAP quinasa y se han validado ampliamente en cohortes de
pacientes (Tabla Suplementaria S1, Yonesaka et al., 2011, Diaz et al., 2012, Misale et al., 2012,
Montagut et al. 2012; Bardelli et al., 2013; Bettegowda 2014). Podemos identificar todas las
mutaciones de resistencia detectadas clínicamente para el tratamiento con Cetuximab en el
cáncer colorrectal y, además, posibles vías terapéuticas para resensibilizar las células
resistentes. Proponemos que la mutagénesis ENU debe incorporarse junto con las nuevas
tecnologías de edición de genes CRISPR en todo el genoma en la interrogación sistemática de la
resistencia a los medicamentos dada la prevalencia (y potencial para la orientación terapéutica)
de mutaciones puntuales como mediadores de resistencia en el cáncer.

Materiales

Todo el cultivo celular se realizó en medio RPMI o DMEM / F12 (de acuerdo con las
recomendaciones del proveedor) y se complementó con FBS al 5% y penicilina / estreptavidina.
Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO2 durante el cultivo. La identidad de todas las
líneas celulares utilizadas en este documento se confirmó utilizando un panel de 95
polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) utilizados previamente para la autenticación de línea
celular (Fluidigm).

Immunoblotting

La fosforilación diferencial de las proteínas en las vías de señalización se analizó mediante

transferencia de Western. Las células se plaquearon 24 h antes del tratamiento con fármaco y
se incubaron durante los tiempos y concentraciones indicados. Las células adherentes se lavaron
luego con PBS y se recogieron después del tiempo de incubación indicado con un tampón de lisis
que contenía 5% de β-mercaptoetanol, 150 mM de NaCl, 50 nM de Tris pH 7,5, 2 nM de EDTA
pH 8, 25 nM de NaF, 1% de NP-40 , inhibidores de la proteasa (Roche) e inhibidores de la
fosfatasa (Roche). Los lisados se normalizaron después del ensayo del ácido bicinconínico (BCA)
usando tampón de lisis. Los lisados de proteínas se resolvieron usando electroforesis SDS PAGE
en geles de Bistris 4% -12% Invitrogen prefabricados y se transfirieron durante 12 h. Anticuerpos
primarios: p44 / 42 MAPK, Phospho-p44 / 42 MAPK (Thr202 / Tyr204) y AKT se obtuvieron de
Cell Signaling, y phospho-AKT (pS473) se obtuvo de Invitrogen. La betaululina monoclonal se
obtuvo de Sigma.
Ensayos de sensibilidad a los medicamentos

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos para ensayos de 6 d y placas de seis pocillos
para ensayos clonogénicos de 20 d. Las células se incubaron en medios libres de drogas para
permitir la adherencia durante 24 h antes de la adición del fármaco a las concentraciones
indicadas. Cada línea celular se sembró para alcanzar ~ 70% de confluencia al final del ensayo.
Cetuximab se obtuvo de la farmacia del hospital Addenbrookes. Trametinib (GSK1120212) y
Dabrafenib se obtuvieron de Selleckchem.

Mutagénesis ENU de líneas celulares

Las líneas celulares CCK-81 y NCI-H508 se incubaron en un intervalo de concentración de ENU

(0-10 mg / ml), y la viabilidad se midió después de 48 h. Posteriormente, se seleccionó una
concentración de 0,1 mg / ml para que los modelos de resistencia tuvieran un efecto modesto
sobre la viabilidad celular mientras que todavía generaban una alta tasa de mutaciones (Fig. S11
suplementaria). Las células se incubaron en ENU a la concentración indicada durante 24 h antes
de lavarse tres veces con PBS y se incubaron en medio durante 24 h más. Las células se
seleccionaron luego con 10 μg / ml de Cetuximab 48 h después de la exposición a ENU durante
8 semanas. Los clones se recogieron usando cilindros de clonación pequeños de Scienceware y
se transfirieron a placas de 96 pocillos o se expandieron en matraces grandes para ensayos de
sensibilidad a fármacos. El ADN se extrajo en formato de placa de 96 pocillos utilizando el kit de
aislamiento de ADN genómico Agencourt DNAdvance.

Radiación gamma de líneas celulares

La línea de células de cáncer de colon MSI HCT116 y la línea de cáncer de pulmón MSS NCI-
H3122 se irradiaron cada una con 1 Gy o 10 Gy. Al día siguiente, las células individuales se
clasificaron por flujo y se expandieron como colonias. El ADN se extrajo de nueve colonias de
cada línea celular y se sometió a secuenciación.

Secuenciación de todo el exoma

La secuenciación del exoma se llevó a cabo utilizando el conjunto de cebo Agilent SureSelectXT
Human All Exon de 50 Mb. Se extrajeron ADN de 72 clones y se sometieron a construcción de la
biblioteca, preparación de células de flujo y generación de clústeres de acuerdo con el protocolo
de preparación de la biblioteca Illumina. Realizamos secuenciación Illumina de 75 pares de
extremos emparejados. La alineación de lectura con el genoma humano de referencia (GRCh37)
se realizó con el Alineador de Burrows-Wheeler (BWA) (http://bio-bwa.sourceforge.net/) (Li y
Durbin 2010). Las lecturas no asignadas se excluyeron del análisis. La cobertura promedio entre
los clones derivados de CCK-81 y NCI-508 fue de 65x y 62x, respectivamente. Las líneas celulares
parentales combinadas se secuenciaron a mayor profundidad (158 x en CCK-81 y 144 x en NCI-
H508).

Detección de variantes

Las sustituciones de un solo nucleótido se llamaron mediante el algoritmo CaVEMan C (Variantes

del cáncer mediante la maximización de las expectativas), y las inserciones / deleciones se
llamaron mediante la asignación de lectura dividida implementada en el algoritmo Pindel
(https://github.com/cancerit). El algoritmo CaVEMan solo analiza lecturas que están
emparejadas correctamente y no están marcadas como duplicadas. Las variantes se
identificaron en comparación con una muestra de referencia de una sola coincidencia que
consiste en un control de línea celular parental contemporáneo de alta cobertura de secuencia.

Filtrado de datos para eliminar variantes subclonales preexistentes

Un número de clones compartió mutaciones que estaban presentes en un pequeño porcentaje

de lecturas en su correspondiente secuencia de línea celular parental contemporánea. Estas
mutaciones subclonales podrían confundir el análisis de la ruta posterior al causar el
enriquecimiento en una vía debido a mutaciones que estaban presentes antes del tratamiento
con ENU, pero no se llamaron debido a su baja representación. Para superar este problema, las
variantes se filtraron contra el control parental contemporáneo secuenciado profundo después
de la llamada de mutación a través de CaVEMan y Pindel. El algoritmo SAMtools mpileup se usó
para eliminar cualquier mutación que estuviera presente en lecturas del 0,5% o más en el control
de línea celular parental de alta cobertura (Li et al., 2009). El conjunto final de mutaciones se
utilizó para generar una matriz de eventos para los 72 clones (Tabla Suplementaria S6) y se utilizó
como el archivo de entrada para el análisis SLAPenrich descrito a continuación.

Descifrar las firmas mutacionales marcando secuencias exómicas de clones expuestos a ENU

El contexto inmediato de la secuencia 5 'y 3' de las sustituciones de bases identificadas en los
clones resistentes a Cetuximab se extrajo utilizando las API centrales de Ensembl para la
construcción del genoma humano GRCh37 y se utilizó para generar catálogos mutacionales para
el análisis posterior. El catálogo mutacional de clones resistentes a Cetuximab CCK-81 contenía
7198 sustituciones, mientras que los clones NCI-H508 contenían un total de 23,862
sustituciones. Las firmas mutacionales se descifraron por separado en ambos catálogos de
mutaciones, utilizando un marco computacional desarrollado previamente (Alexandrov et al.,
2013b). Brevemente, el algoritmo identifica un conjunto mínimo de firmas mutacionales que
explica de manera óptima las proporciones de tipos de mutaciones encontradas en un catálogo
mutacional dado (es decir, a través de todas las sustituciones identificadas en clones CCK-81 y
NCI-H508) (Fig. S4 suplementaria) y luego estima la contribución de cada firma identificada a un
espectro de mutación de cada muestra incluida en el análisis (es decir, a un espectro de
mutación de cada clon individual, ver para los clones NCI-H508) (Supplemental Fig. S5).
Análisis del nivel de muestra del enriquecimiento de las vías (SLAPenrich)

Se incluye una breve descripción del modelo estadístico implementado en SLAPenrich en los
Métodos Suplementarios, junto con las especificaciones de los parámetros de entrada y
parámetros utilizados para los análisis presentados en este manuscrito. SLAPenrich se
implementa como un paquete R, y está disponible públicamente en
https://github.com/saezlab/SLAPenrich. La canalización computacional para reproducir los
resultados presentados se implementa en el script adjunto BrammeldEtAl_analysis.R (también
disponible en los Métodos suplementarios).

En resumen, como primer paso, SLAPenrich estima la probabilidad de observar al menos un gen
que pertenece a una vía dada mutada en una muestra dada, en función de la longitud de los
bloques de exones totales de los genes en esa ruta, y la carga de la mutación de la muestra. Una
vez que se ha estimado esta probabilidad para cada muestra individual, SLAPenrich modela la
probabilidad de observar un número dado de muestras con mutaciones en la ruta considerada
mediante una distribución binomial de Poisson. Esta es la distribución discreta de una suma de
ensayos de Bernoulli en la que la probabilidad de éxito no es constante. Es utilizado por
SLAPenrich para calcular la desviación del número de muestras observadas con mutaciones en
una vía dada desde su expectativa a través de una asignación de valor P correspondiente.

Identificación de genes de resistencia a fármacos basados en el impacto de mutaciones de

codificación

Para identificar genes controladores mutados recurrentemente, un método dN / dS que

considera el espectro de mutación, la secuencia de cada gen, el impacto de las sustituciones de
codificación (sinónimo, missense, sin sentido, sitio de empalme) y la variación de la tasa de
mutación entre genes usado. Debido a la falta de una referencia neutral para la tasa de indel en
las secuencias de codificación, se requirió un enfoque diferente (para más detalles, ver Métodos
Suplementarios). Debido a que este enfoque se ha desarrollado para la detección de genes
controladores en grandes conjuntos de datos de muestras de cáncer, las muestras que
comparten más de tres mutaciones (es decir, poblaciones subclonales relacionadas) se
fusionaron para crear un único conjunto de variantes compuesto por la unión de todas las
variantes observadas en las muestras similares. En el caso de los 72 clones ENU, esto dio como
resultado la creación de 19 muestras informativas que se utilizaron para el análisis dN / dS.

Mutagénesis dirigida al sitio de vectores de expresión MAP2K1

Con el fin de validar mutaciones candidatas de resistencia a fármacos a partir de la selección

genética avanzada basada en ENU, intentamos crear vectores mutados para expresar dentro de
líneas celulares colorrectales sensibles a Cetuximab. La construcción de tipo salvaje para
MAP2K1 se ordenó a partir de Dharmacon y se llevó a cabo para reacciones de mutagénesis in
vitro dirigidas al sitio usando el sistema de mutagénesis dirigida al sitio GENEART de Thermo
Fisher Scientific. Para lograr esto, se diseñaron dos cebadores de oligonucleótidos mutagénicos
complementarios (obtenidos de Sigma-Aldrich) y se usaron para generar construcciones de
expresión de ADNc génico con mutaciones deseadas. Las mutaciones se confirmaron mediante
la secuenciación de Sanger, antes de ser administradas a las células con infección lentiviral.

Secuenciación de ADN plasmático

La extracción de ADN se realizó con QIAmp DNA Mini kit (Qiagen). La preparación de la biblioteca
se realizó con el Oncomine Focus Assay (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Después de la codificación de barras, las bibliotecas se igualaron a 100 pM. La
plantilla de secuenciación se preparó usando el IonPGMSequencing 200 Kit v2 y se secuenció en
un chip Ion Select 318 usando el PGM Sequencing 200 Kit v2 con 500 flujos. Las mutaciones de
hotspot en 35 genes se seleccionaron usando el Oncomine Focus Assay (Thermo Fisher) (Tabla
Suplementaria S7). Variant Caller v4.0.r73742 se usó para la llamada de variante con el software
Ion Reporter. Todas las variantes filtradas también se analizaron con el software Integrative
Genomic Viewer (IGV v2.3).