Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometri menghasilkan sinar dan spektrum dengan panjang gelombang dan fotometri adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi spektrofotometri digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar, 1990: 325). Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis yaitu suatu molekul yang dikenai sinar dari sumber radiasi akan diteruskan menuju monokromator. Cahaya dari monokromator di arahkan terpisah melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi. Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian dan berulang, sinyal listrik dari detektor diproses sehingga di dapatkan nilai absorbansi. Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif parasetamol dengan metode spektrofotometri UV-Vis serta menentukan mutu parasetamol dengan berdasarkan data spektrum UV-Vis dan hasil penetapan kadar. Parasetamol dapat dianalisis menggunakan spektrofotometer karena secara struktur diketahui bahwa parasematol mempunyai gugus kromofor dan gugus auksokrom yang menyebabkan parasetamol dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet. Penggunaan alat spektrofotometer UV-Vis dipilih karena spektrofotometer merupakan instrumen yang tidak rumit, selektif, serta kepekaan dan ketelitiannya tinggi. Selain itu, parasetamol yang akan dianalisis memiliki gugus kromofor berupa ikatan rangkap terkonjugasi sehingga memenuhi syarat senyawa yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometer ini. Gugus kromofor pada parasetamol ditunjukkan pada gambar berikut ini:
Tujuan dari analisis kualitatif ini adalah untuk membandingkan panjang gelombang parasetamol uji dengan parasetamol standar, dimana nilai panjang gelombangnya harus sama. Setelah diketahui panjang gelombang maksimum dari parasetamol uji dapat digunakan untuk analisis selanjutnya yaitu analisis kuantitatif. Tahap pertama untuk melakukan analisis kualitatif adalah menyiapkan larutan standar. Larutan standar dibuat dari campuran parasetamol standar yang digunakan sebagai pembanding dengan HCl 0,1 N dalam metanol (1 dalam 100), sehingga diperoleh konsentrasi 500 ppm. HCl dan metanol berperan sebagai pelarut, karena parasetamol mudah larut dalam metanol, selain itu HCl juga berperan dalam pergeseran batokromik dan hipsokromik agar seimbang. Selanjutnya dibuat larutan standar dengan berbagai konsentrasi yaitu 50 ppm dan 5 ppm. Lalu dibuat juga larutan uji yang terbuat dari bahan baku parasetamol yang akan di tentukan panjang gelombang maksimumnya dengan HCl 0,1 N dalam metanol (1 dalam 100), hingga diperoleh konsentrasi 500 ppm dan dibuat juga pengenceran hingga diperoleh beberapa konsentrasi yaitu 50 ppm dan 5 ppm. Pembuatan berbagai konsentrasi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pada konsentrasi berapa larutan uji yang mendekati larutan standarnya. Selanjutnya larutan standar dan larutan uji ditentukan panjang gelombang maksimumnya. Berdasarkan hasil yang diperoleh, panjang gelombang maksimum larutan standar dan larutan uji adalah 248 nm, hasil tersebut mendekati panjang gelombang maksimum menurut literatur yaitu 249 nm. Dapat diketahui panjang gelombang maksimum parasetamol tersebut karena parasetamol memiliki gugus kromofor yang menyerap atau mengabsorbsi radiasi elektromagnetik di daerah panjang gelombang ultraviolet dan daerah cahaya tampak. Selanjutnya dilakukan analisis kuantitatif dengan tujuan untuk menentukan kadar parasetamol, serta menyimpulkan mutu parasetamol tersebut apakah layak untuk dikonsumsi atau tidak. Berdasarkan literatur (Depkes RI, 1995: 649) kadar parasetamol tidak boleh kurang dari 98% dan tidak boleh lebih dari 101%, sehingga dalam rentang kadar tersebut parasetamol dapat menghasilkan efek farmakologi yang diharapkan. Analisa kuantitatif berkaitan dengan penetapan beberapa banyak suatu zat tertentu yang terkandung dalam suatu sampel. Zat yang ditetapkan tersebut, yang sering kali dinyatakan sebagai konstituen atau analit, menyusun sebagian kecil atau sebagian besar sampel yang di analisis (Day dan Underwood, 2002). Pada perocobaan analisis kuantitatif terhadap paracetamol dilakukan dengan menggunakan cara kurva kalibrasi dan metode one point. Tahap pertama yaitu pembuatan larutan standar. Larutan standar adalah larutan analit yang konsentrasinya sudah diketahui, larutan ini dibuat agar dalam pengukuran menggunakan instrumen (spektrofotometer Uv - Vis) tidak melampaui batas linearitas dari instrumen. Larutan standar dibuat dengan melarutkan paracetamol ke dalam 10 ml metanol di dalam labu takar 100 mL dan ditambah akuadest sampai tanda batas, metanol dipilih sebagai pelarut karena paracetamol mudah larut dalam methanol selain itu metanol merupakan salah satu pelarut yang banyak digunakan karena sifatnya yang transparan pada daerah uv vis sehingga tidak menggangu pengkukuran. Kemudian larutan dipipet (1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, dan 4 mL) yang diencerkan dengan air hingga diperoleh seri larutan dengan konsentrasi nya masing- masing. Larutan dibuat beberapa konsentrasi agar dapat diketahui konsentrasi yang mana yang paling tepat dan pas dengan konsentrasi larutan standarnya. Selanjutnya dibuat larutan uji dari campuran paracetamol dan metanol yang diencerkan. Selanjutnya dilakukan pengukuran serapan untuk mengetahui nilai absorbansi. Kuvet yang akan digunakan harus dibilas terlebih dulu dengan aquadest untuk menghilangkan pengotor sehingga pengukurannya akurat, kemudian kuvet yang sudah diisi larutan disimpan ke spektrofotometer dengan bagian bening dihadapkan ke alat detektor dan monokromator. Panjang gelombang yang digunakan merupakan panjang gelombang maksimum dalam pengukuran larutan standar paracetamol yaitu 248 nm. Pertimbangan penggunaan panjang gelombang maksimum dalam pengukuran absorbansi yaitu karena pada panjang gelombang maksimum, kepekaan larutan sampel yang diidentifikasi lebih maksimal dibanding panjang gelobang yang lain. Berdasarkan hasil diperoleh nilai absorbansi dari berbagai konsentrasi 3 ppm; 4,5 ppm; 6 ppm; 7,5 ppm; 9 ppm; 10,5 ppm; dan 12 ppm adalah berturut-turut 0,207; 0,284; 0,368; 0,454; 0,541; 0,587; dan 0,731. Semakin tinggi konsentrasi maka nilai absorbansi nya semakin meningkat ini sama dengan hukum Lambert- Beer yang menyatakan bahwa konsentrasi dan absorbansi berbanding lurus. Kemudian ditentukan nilai a, b dan r dengan regresi linier , diperoleh nilai a = 0,033, b = 0,559 dan nilai r= 0,9952. Setalah diperoleh nilai absorbansi kemudian dilakukan perhitungan dengan cara kurva kalibrasi dengan menggunakan rumus y= a + bx. Dimana x menunjukkan nilai konsentrasi, hasil yang diperoleh adalah 7,4365 ppm yang setara dengan 743,65 mg/100 ml, Selanjutnya dihitung kadar, hasilnya 97,85% ~ 98%. Metode kurva kalibrasi merupakan metode analisis kuantitatif dengan cara mengukur absorban sampel dalam beberapa konsentrasi, yang kemudian akan dibuat kurva kalibrasi konsentrasi terhadap absorban. Selain menggunakan cara kurva kalibrasi untuk menentukan kadar parasetamol uji, digunakan juga cara one point, berdasarkan cara one point diperoleh kadar sebesar 97,63% ~ 98%. Metode one point digunakan untuk penentuan kadar secara rutin pada pelarut, suhu, dan instrumen yang sama. Berdasarkan hasil penetapan kadar dengan kedua cara tersebut dapat dilihat hasilnya tidak jauh berbeda, dimana hasil tersebut mendekati kadar yang dianjurkan dalam Farmakope IV. Metode yang paling banyak digunakan yaitu metode analisis kuantitatif dengan one point karena metode ini merupakan metode yang paling sederhana, banyak digunakan dan hanya membutuhkan satu titik pengukuran.