ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

(REACCIÓN CON H2O2)

1Liliana
Jiménez, 1Ángela Florez, 1María de los Ángeles Caraballo. Escuela de
Química, 1Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Pedagógica y
Tecnológica de Colombia- UPTC, Colombia.

OBJETIVOS

 Evaluar el efecto de la concentración de sustrato.

 Determinar la cinética catalítica en reacciones en donde se emplean enzimas
como catalizador.
 Comprobar la reacción sobre el peróxido de hidrógeno por acción de la enzima
catalasa, presente en tejidos vegetales determinando los productos de
reacción.

INTRODUCCIÓN

El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una

reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores
como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una
enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican
las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentración
de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros. Se
evalúa la influencia de estos factores en la reacción catalizada por enzimas
con la finalidad de determinar los intermediarios en una reacción y el papel
que juegan en la reacción enzimática, es decir, para predecir mecanismos de
reacción. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas
herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las
que se conoce a la enzima que la produce. También es usual medir la
actividad enzimática con diferentes sustratos para entender su especificidad o
bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para
entender cómo las diferencias en actividad están relacionadas con la función
y/o la fisiología del organismo del que proceden.1

1
Cinética enzimática. Disponible online en http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e obtenido el 29 de
noviembre del 2017.
FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimática.

Destacaremos dos: el pH y la temperatura.

 EFECTO DEL pH:

La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad
es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye
bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza
proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y pierden su actividad
si el pH varía más allá de unos límites estrechos. De ahí la conocida
importancia biológica de los sistemas tampón.

En la mayor parte de los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en

consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy
diverso según sea el pH del medio en el que habitualmente actúan (los
enzimas proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs óptimos próximos a 2 ya
que este es el pH de dicho jugo). Por último existen algunos enzimas a los que
el pH no afecta en absoluto.

 INHIBIDORES:
Son compuestos químicos que se unen al enzima, en distintos puntos del
mismo y disminuyen o incluso impiden su actividad. Estos compuestos pueden
ser de distintos tipos: iones, moléculas orgánicas y a veces el producto final de
la reacción. A la acción que realizan se la denomina inhibición. La inhibición
puede ser:
Inhibición irreversible: Cuando el inhibidor impide permanentemente la
actividad enzimática, bien porque se une de forma permanente con grupos
funcionales importantes del centro activo o bien porque altera su estructura. A
estos inhibidores se les denomina venenos y a la inhibición que realizan se la
denomina envenenamiento del enzima. Ej. La penicilina que inhibe las
enzimas que sintetizan la pared bacteriana. El ión cianuro actúa sobre la
citocromo oxidasa (enzima respiratorio).
Inhibición reversible: El inhibidor se une al enzima de forma temporal
mediante enlaces débiles e impide el normal funcionamiento del mismo, pero
no la inutiliza permanentemente. Puede ser de tres tipos:
- Competitiva: El inhibidor es similar al sustrato y se puede unir al centro
activo del enzima impidiendo que lo haga el sustrato. Es decir ambos,
 inhibidor y sustrato compiten por unirse al centro activo del enzima. La
acción suele anularse aumentando la concentración del sustrato.
- Acompetitivo: es una forma de inhibición mixta donde la unión del inhibidor
con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el sustrato.
Como resultado, el grado de inhibición depende solamente de la
concentración de inhibidor.
- No competitiva: El inhibidor no compite con el sustrato, puede actuar de 2
formas:-Sobre el enzima, uniéndose a él en un lugar diferente al centro
activo y modificando su estructura lo que dificulta que el enzima se pueda
unir con el sustrato.-Sobre el complejo E-S uniéndose a él y dificultando su
desintegración y por lo tanto la formación de los productos.2

PRELABORATORIO

1. Que es un homogenado.

RTA: Es una suspensión de fragmentos celulares y constituyentes celulares

obtenidos cuando se homogeneiza un tejido3.

2. Cuáles son las ventajas y desventajas de emplear la catálisis enzimática.

Cuadro 1. Ventajas de emplear la catálisis enzimática4

VENTAJAS
 Aceleración de velocidad del
orden de 8 a 12 factores de
magnitud.
 Se usan a concentraciones del
1. Las enzimas son catalizadores
0.001 al 0.0001%, frente a los
muy eficientes
catalizadores químicos (0.1-1%)
 Si se considera las condiciones de
sus uso (T, presión) su eficacia es
aún mayor
 Las enzimas son proteínas y, por
lo tanto, biodegradables.
2. Las enzimas no producen  Si se usan soportes inertes (sílice,
contaminación medioambiental barro de diatomeas), el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo
para el medio ambiente.

2
Enzimas. Disponible online en http://www.bionova.org.es/biocast/tema14.htm obtenido el 29 de noviembre del 2017.
3
Oxford living dictionaries. Disponible online en https://en.oxforddictionaries.com/definition/homogenate obtenido el 29 de
noviembre del 2017.
4
Biocatálisis. Disponible online en http://webs.ucm.es/info/btg/personales/jmsanchez/Introduccion_1.pdf obtenido el 29 de
noviembre de 2017.
  Además, las condiciones suaves
de trabajo implican poco consumo
energético, y por lo tanto poco
costo y emisión de gases poco
contaminantes, por lo que no se
incrementa el efecto invernadero.
 Este es una de las ventajas más
importantes.
 Generalmente las enzimas
funcionan a T ambiente, presión
atmosférica y pH neutro o cercano
3. Las enzimas trabajan en
a la neutralidad.
condiciones suaves de pH,
 Por ello se minimiza la generación
temperatura y presión
de subproductos por reacciones
colaterales, lo que conlleva un
aumento de la conversión y facilita
los procesos de recuperación de
productos (down stream)
4. Las enzimas no están limitadas
____________
a su papel natural
 hidrolisis-síntesis de esteres,
amidas, lactonas, anhídridos,
epóxidos y nitrilos.
 oxidaciones-reducciones de
alcanos, alquenos, compuestos
aromáticos, alcoholes, aldehídos y
cetonas, sulfuros y sulfóxidos.
5. Las enzimas pueden catalizar
 adición-eliminación de agua,
un amplio espectro de
amoniaco, ácido cianhídrico.
reacciones
 halogenaciones y
dehalogenaciones, alquilaciones y
dealquilaciones, isomerizaciones,
condensaciones aldolicas,
aciloinica, adiciones de michael.
 transposiciones tipo claisen.
 cicloadiciones diels-alder

Cuadro 2. Desventajas de emplear la catálisis enzimática5

DESVENTAJAS
1. Las enzimas son  no existen "imágenes especulares"
producidas en la naturaleza de las enzimas formadas por D-
como un sólo enantiómero aminoácidos se debe hacer un
"screening" si se quiere la otra
enantioselectividad
5
Biocatálisis. Disponible online en http://webs.ucm.es/info/btg/personales/jmsanchez/Introduccion_1.pdf obtenido el 29 de
noviembre de 2017.
 2. Las enzimas requieren
parámetros operacionales ____________
muy estrechos
3. Las enzimas presentan su  productos orgánicos poco solubles
mayor actividad en medios en agua
acuosos
 por sustrato: mantener baja la
4. Las enzimas pueden sufrir
concentración inicial
procesos de inhibición
 por producto final: hay que retirar
el producto a medida que se forma

3. ¿Cómo se vería afectada una reacción enzimática variando el pH?

RTA: Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH;

amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus
aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga
eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas
depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la
conformación será la más adecuada para la actividad catalítica; Este es el
llamado pH óptimo (Figura 1). Por ejemplo la actividad catalítica puede
necesitar a un grupo amino, por ejemplo de una lisina en estado protonado (-
NH3+) o no (-NH2+), el pH modifica este estado y por tanto a la velocidad de la
reacción.

Figura 1. Cambio del pH óptimo a un pH mayor

 La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo
pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un
pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura
2). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la
proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos
para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos 6.

Figura 2. pHs óptimos para la pepsina gástrica, la ureasa y la arginasa

4. Realice un diagrama de flujo de la practica

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
(REACCIÓN CON H2O2)

Parte A Parte B

Marcar 7 tubos
con 0, 10, 30, 60, Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
120, 180 y 360
segundos

6
Efecto del pH sobre la actividad enzimática. Disponible online en: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph
obtenido el 29 de noviembre de 2017
Seguir el Adicionar Adicionar
Adicionar
siguiente 0,7 ml de 0,7 ml de
0,7 ml de
procedimiento H2O2, un H2O2, un
H2O2, un
para cada uno trozo de trozo de
trozo de
papa y 5 papa y un
papa y 5
Adicionar 5 ml ml de trozo de
ml de HCl
H2O2 al tubo y NaOH papa
luego un trozo de
papa

Esperar el tiempo
que se ha Comparar el
marcado en el efecto del pH en
tubo. las tres
reacciones
Transcurrido el
tiempo retirar el
trozo de papa y
adicionar
adicione 5 ml de
H2SO4

Titular la reacción
(KMnO4) hasta
observar un viraje
rosa

Registrar
observaciones
RESULTADOS Y DISCUCIÓN

Reacción de la catalasa proveniente de la papa sobre H2O2

Catalasa
𝐻2 𝑂2 𝐻2 𝑂 + 1⁄2 𝑂2
Parte A

Figura 3. Procedimiento

Al adicionar la papa en el peróxido de hidrógeno (H2O2) lo que sucedió fue que La

enzima catalizó la conversión de H2O2 a H2O y O2 (gas).

Antes de que todo el H2O2 se convierta en H2O y O2, la reacción se detuvo al

agregar ácido sulfúrico (H2SO4), pues este redujo el pH, desnaturalizando la
enzima y, por lo tanto, detuvo la actividad catalítica. Después de detener la
reacción, se mido la cantidad de sustrato (H2O2) que quedaba en el tubo de
ensayo. Para medir esta cantidad, se usó permanganato de potasio hasta que
toda la mezcla virara ligeramente rosada o marrón, permanentemente. El
permanganato de potasio (KMnO4), en presencia de H2O2 y H2SO4, reaccionaron
químicamente de la siguiente manera:

5𝐻2 𝑂2 + 2𝐾𝑀𝑛𝑂4 + 3𝐻2 𝑆𝑂4 → 2𝑀𝑛𝑆𝑂4 + 𝐾2 𝑆𝑂4 + 8𝐻2 𝑂 + 5𝑂2

Tabla1. Resultados parte A

Tiempo (segundos)
60 90 120 140 360

A. Volumen
inicial (mL)
KMnO4 25 24,8 24,6 24,3 23,8

B. Volumen
final (mL)
KMnO4 24,8 24,6 24,3 23,8 23,1

C. Cantidad de
KMnO4
consumido 0,2 0,2 0,3 0,5 0,7
(mL) (A-B)

Gráfica 1. Tiempo Vs permanganato de potasio consumido

Los datos obtenidos en la práctica fueron erróneos pues lo esperado era que a
medida que la enzima reaccionara durante más tiempo, se debía valorar con
menos permanganato de potasio, por lo que se debería consumir cantidades
crecientes de peróxido de hidrógeno. Esto se debe a que cuanto más tiempo la
catalasa reacciona, más peróxido de hidrógeno puede descomponerse, porque las
enzimas tienen más tiempo para pasar a más sustrato después de romperlo.
Perno nuestros datos dieron lo contrario a más tiempo más permanganato se
necesitaba.

El error pudo ser ocasionado pues inicialmente no se dio viraje a color rosa en la
titulación y se tuvo que cambiar concentraciones del permanganato; pero viendo
referencias de otras universidades lo que se tenía diferente en la práctica era el
H2O2 pues ello lo utilizaban en solución a 1.5%7.

Parte B

Tabla 2. Resultados parte B

Tubo Reacción
1 Rápida, Exotérmica, efervescencia,
espuma, a los 10 min empezó a
rebosar del tubo de ensayo
2 Violenta, Exotérmica, efervescencia y
después de 30 min desnaturalizo la
enzima no se observó papa
3 Lenta, efervescencia

7
http://portal.mypisd.net/documents/802157/0/AP+Lab+Enzyme+Catalysis+Student+for+print.pdf/a60649c8-3769-4942-
9a2d-1301f3ff63c4/AP+Lab+Enzyme+Catalysis+Student+for+print.pdf
Los resultados mostraron que la reacción fue mucho más lenta cuando se agregó
ácido clorhídrico a la solución para que el pH bajara (tubo 2), y mucho más rápida
cuando se añadió base (hidróxido de sodio, tubo 1) a la solución para crear un pH
más alto. Esto sucedió ya que al agregar ácido a la solución, se desnaturalizo la
enzima, lo que provocó que la reacción ocurriera a un ritmo mucho más lento pues
esta quedaba en menor cantidad para trabajar como catalizador; mientras que al
añadir la base, aumentó la enzima pues la catalasa ya era una base, provocando
que la reacción fuera más fuerte y mucho más rápida. En el tubo 3 como no se le
adicionó ni una base ni un ácido este reaccionara normalmente. Las burbujas o
efervescencia observada en los tubos se debe a la descomposición del H2O2 en
agua y oxígeno y este último al ser un gas tiende a salir de esa forma.

CUESTIONARIO

 ¿Cuál es el papel del ácido sulfúrico en el experimento?

Se desnaturaliza la enzima mediante la alteración del sitio activo ya que el

ácido sulfúrico baja el pH. De esta manera la enzima ya no funcionará, ya
que Cada enzima funciona mejor dentro de un cierto intervalo de pH. Por
ejemplo, la enzima pepsina, que trabaja en el estómago, funciona mejor en
un ambiente fuertemente ácido. La lipasa, una enzima que se encuentra en
el intestino delgado, funciona mejor en un entorno de base. Cuando el pH
cambia, el sitio activo se distorsiona progresivamente y afecta a la función
enzimática.

 ¿Que otro tipo de muestras pueden emplearse para realizar esta práctica?

De las enzimas que se utilizan industrialmente más de la mitad son hongos

y levaduras, un tercio provienen de bacterias, el 8% proviene de fuente
animal (hígado) y el 4% de plantas (espinaca); y estas también se podrían
utilizar en esta práctica.

 ¿Qué sucedería si se realiza la prueba empleando una temperatura de

80°C?

La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las células y

ayuda a descomponer el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Existe
una variación de los efectos de la temperatura en la catalasa en diferentes
hojas. 55 °C destruirá completamente la catalasa en los tubérculos de
papa. Un rango de 65 °C a 80 °C destruirá la catalasa en la mayoría de los
casos.

CONCLUSIONES

Las reacciones dieron positivas con respecto a la descomposición del

peróxido de hidrogeno pues en todas se observaron desprendimiento de
burbujas que era perteneciente al oxigeno obtenido del producto de la
reacción. No se pudo desarrollar correctamente la parte A pues los
resultados dieron de forma inversa a lo teórico, esto pudo ser ocasionado
por la concentración de permanganato el cual era muy bajo o se debía
aumentar la concentración de catalasa. Cuando se emplean enzimas como
catalizadores se debe tener en cuenta los factores que las desnaturalizan
pues estos pueden provocar que la actividad enzimática se ralentice o
simplemente no se produzca por ello para que la catalasa funcionara
correctamente debía tener un pH neutro.

BIBLIOGRAFÍA

Cinética enzimática. Disponible online en

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e obtenido el 29 de
noviembre del 2017.

Enzimas. Disponible online en

http://www.bionova.org.es/biocast/tema14.htm obtenido el 29 de noviembre
del 2017.

Oxford living dictionaries. Disponible online en

https://en.oxforddictionaries.com/definition/homogenate obtenido el 29 de
noviembre del 2017.

Biocatálisis. Disponible online en

http://webs.ucm.es/info/btg/personales/jmsanchez/Introduccion_1.pdf
obtenido el 29 de noviembre de 2017.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática. Disponible online en:

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph obtenido el 29 de
noviembre de 2017
http://portal.mypisd.net/documents/802157/0/AP+Lab+Enzyme+Catalysis+
Student+for+print.pdf/a60649c8-3769-4942-9a2d-
1301f3ff63c4/AP+Lab+Enzyme+Catalysis+Student+for+print.pdf