UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS Y ÁCIDOS ORGÁNICOS

Objetivo:
-Realizar pruebas bioquímicas para poner de manifiesto las actividades metabólicas que
llevan a cabo los microorganismos sobre algunas azucares y ácidos orgánicos, que son
útiles en la identificación.

La descripción colonial y microscópica no son suficientes para la identificación por lo que

debemos observar su comportamiento fisiológico, es decir, como utilizan los nutrientes y
la sustancias que producen.
El metabolismo es la suma de todos los procesos químicos que ocurren dentro de un
individuo. Se divide en:
Anabolismo el cual se refiere a las reacciones bioquímicas que suceden en la célula para
formar macromoléculas.
Catabolismo se refiere a las reacciones involucradas en la conversión de los sustratos a
formas mas simples y generalmente mas oxidadas con lo que se obtiene la energía
requerida por el anabolismo.
Los procesos principales para la obtención de energía y su conversión a ATP son la
fermentación en la cual se obtiene ATP por fosforilación a nivel substrato; la respiración
en la que se obtiene ATP por fosforilación oxidativa y la fotosíntesis que forma ATP
mediante fosforilación.

Caldo Malonato
Medio usado para poner de manifiesto organismos capaces de utilizar Malonato como
única fuente de carbono.
El Malonato interfiere con la oxidación del acido succínico a acido fumárico mediante la
inhibición de la acción catalítica de la enzima succínico deshidrogenasa. El acido
malonico inactiva la enzima por un proceso denominado inhibición competitiva. La
succínico deshidrogenasa transfiere hidrogeno a un aceptor apropiado en la conversión
de acido succínico a fumárico, pero esta reacción puede ser inhibida por un compuesto
orgánico similar desde el punto de vista estructural al sustrato natural, el acido succínico.
El acido malonico presenta una estructura similar al acido succínico y compite por los
sitios de la enzima.
En consecuencia, la acumulación de acido succínico a causa de la inhibición de la
succínico deshidrogenasa interrumpe el ciclo de Krebs, lo que priva algunos
microorganismos de su fuente de energía y también interfiere con el ciclo del acido
glioxílico, lo que detiene la produccion de intermediarios requeridos para la biosíntesis de
nuevos compuestos necesarios para el metabolismo. El resultado final es que los
microorganismo no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentar o utilizar
el Malonato de sodio como única fuente de carbono.

Prueba de Voges Proskauer

Determina la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final
neutro, acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación de la glucosa.
Esta prueba se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro derivado del
metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a acido pirúvico, el principal
intermediario en la glucolisis. A partir del acido pirúvico, las bacterias pueden seguir
muchos caminos metabólicos; la produccion de acetoína es una de las vías metabólicas
de la degradación de la glucosa en las bacterias.
Prueba de rojo de metilo
Usado para probar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables
los productos finales ácidos a partir de la fermentación de la glucosa y para vencer la
capacidad buffer del sistema.
La prueba de rojo de metilo es un prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de
pH, el rojo de metilo, para determinar la concentración de ion hidrogeno cuando un
microorganismo fermenta la glucosa. La concentración de ion hidrogeno depende de la
relación de gases (CO2 y H2) lo que a su vez es índice de las diferentes vías metabólicas
de la glucosa.

Caldo Kligler
Medio usado para determinar la capacidad de un microorganismo para atacar un hidrato
de carbono especifico incorporado en un medio de desarrollo basal, con produccion de
gas o sin ella, junto con la determinación de la posible produccion de acido sulfhídrico.
Es un medio diferencial que determina la fermentación de hidratos de carbono y
determina la produccion de H2S.
La fermentación tiene lugar tanto en aerobiosis (en el pico de flauta) como en
anaerobiosis(en el fondo).
En el pico de flauta, el monosacárido glucosa es catabolizado inicialmente por vía
metabólica anaerobia de Embden-Meyerhof-Parnas, usada por aerobios y anaerobios
para producir el intermediario clave acido pirúvico.
En el fondo existen condiciones anaerobias, de forma que la glucosa se metaboliza por la
vía de Embden-Meyerhof-Parnas a ATP y acido pirúvico, que luego se convierten en los
diversos productos final estables: Acido láctico y /u otros ácidos orgánicos, aldehídos,
alcoholes, CO2, H2 y energía.

4H + 4e- + 3S3O2 tiosulfato 2SO3 + 2H2s

reductasa
Medio inclinado de Citrato de Simmons
Medio usado para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento con alcalinidad resultante.
La energía puede ser proporcionada a lagunas bacterias en ausencia de fermentación o
produccion de acido actico, por la utilización del citrato como única fuente de carbono.
Los microorganismos que poseen un mecanismo de transporte o permeasa permiten que
el citrato penetre al interior de la célula. En las bacterias, el desdoblamiento del citrato
involucra un sistema enzimático sin la participación de la coenzima A, la citrasa( citrato
oxalacetato liasa) o la citrato desmolasa. La citrasa requiere un catión divalente para su
actividad, magnesio o manganeso.
El medio para la fermentación del citrato también contiene sales inorgánicas de amonio.
Un microorganismo que pueden utilizar el citrato como su única fuente de carbono
también utiliza las sales de amonio como su única fuente de nitrógeno. Las sales de
amonio son degradadas a amoniaco lo cual aumenta la alcalinidad.

Carbohidratos en tubos de Durham

La fermentación es un proceso metabólico anaerobio de oxidación-reducción, en el cual
un sustrato orgánico actúa como el aceptar final de hidrógeno (aceptor de electrones) en
lugar de oxígeno. Al final de la fermentación de carbohidratos se producen ácidos y CO 2.
Los tubos de Durham tienen un indicador de pH (rojo de fenol), si hay fermentación del
carbohidrato en específico, el medio vira a amarillo, siendo una prueba positiva.
Resultados
De izquierda a derecha: K. pneumoniae, B. subtilis, S. flexneri y P. vulgaris
Medio con campana de Durham, caldo base y rojo de fenol con:

Manitol Glucosa Sacarosa

Voges Proskauer
Kligler Citrato de Simmons

Caldo Malonato

Rojo de metilo
Análisis de resultados
En la prueba de Durham, Klebsiella pneumoniae fue positivo a las 3 pruebas esto lo
observamos ya que en relación a la producción de gas, las campanas que tenían la
burbuja de aire se desplazó y saco el liquido que tenia dentro lo que significa que
fermento glucosa, sacarosa y manitol lo que tuvo como producto final la producción de
gas.
Bacillus subtilis y Shigella flexneri no produjeron gas y Proteus vulgaris sólo produjo gas
en el tubo de glucosa, entonces solo fermentó ese carbohidrato.
En la misma prueba Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli y Shigella flexneri
fermentaron los tres carbohidratos pues el medio viró a amarillo, y Proteus vulgaris solo
fermento glucosa y sacarosa, el manitol no viró.
En el medio de Kligler Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Bacillus subtilis y Proteus
vulgaris fermentarón la glucosa pues el medio viró en el pico de flauta a rojo y el fondo
amarillo.
Klebsiella pneumoniae también fermentó lactosa pues todo el tubo viro a amarillo, B.
Subtilis, P. vulgaris y S. flexneri no fermentaron la lactosa y el medio se quedo de color
rojo.
Klebsiella pneumoniae produjo gas ya que en el medio se veían burbujas debido a la
fermentación de los carbohidratos y B. Subtilis, P. vulgaris y S. flexneri no produjeron
burbujas ya que utilizaron las peptonas y alcalinizaron el medio.
En la produccion de acido sulfhídrico solo Proteus vulgaris lo produjo, el H2S es incoloro
pero al reaccionar con el citrato de amonio férrico produce un precipitado negro insoluble
de sulfuro ferroso.
Klebsiella pneumoniae y Proteus vulgaris dieron positivo a la prueba de citrato y malonato
ya que viro a azul lo que indica que estas dos bacterias pueden utilizar el citrato y/o
malonato como fuente de carbono. B. subtilis y S. flexneri dieron resultado negativo ya
que el medio no viró, entonces son incapaces de usar como fuente de carbono el
malonato y citrato.
En la prueba de rojo de metilo Shigella flexneri y Proteus vulgaris dieron positivo ya que
se formo un anillo rojo lo que indica que el cultivo es lo suficientemente acido para permitir
que el reactivo rojo de metilo permanezca estable en la superficie del medio, los
microorganismo producen mas ácidos y vencen el sistema buffer fosfato y mantienen la
acidez. Bacillus subtilis dio un color naranja rojizo lo que indica que produjo menos acido.
En la prueba de Vogues Proskauer Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Proteus
vulgaris dieron positivo al pintarse de rojo el tubo lo que indica que al final de la
fermentación de la glucosa produjeron el compuesto estable acetoína.

La reacción de VP es la siguiente:
Conclusión:
En esta practica podemos concluir que por medio de la identificación de la fermentación
de diversos nutrientes que utilizamos en los medios, podemos saber parte de su actividad
enzimática.

Bibliografía:

Gutiérrez Eduardo. “Medios De Cultivo, Tinciones Y Pruebas Bioquímicas” 2°

edición, editorial grupo revelación

MacFaddin, J. F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica. Ed. Médica Panamericana.