Centro de Ciencias Básicas.

Departamento de Química.
Academia de Química.
Lic. Químico Fármaco Biólogo.

Pre-reporte 3
“Producción de piruvato durante la fermentación de
glucosa por levaduras.”

Materia: Bioquímica II
Profesora: María Cristina Serna Gutiérrez.
Alumnas
Flores Hernández Mayela.
Flores Ibarra Joselyn Georgina.
Palos Dueñas Dulce María.
Ramos Hernández Alejandra.

Fecha: 02/Marzo/2018
OBJETIVOS
Cuantificar la producción de piruvato mediante la fermentación de la glucosa por levaduras.
Determinar el efecto del pH de cultivo de las levaduras sobre la acumulación de piruvato.
1. Preparar un sistema fermentativo de la glucosa para la producción de piruvato.
2. Elaborar una curva patrón de piruvato de sodio por espectrofotometría a una
absorbancia de 505 nm.
3. Determinar cualitativamente la producción de piruvato mediante la reacción de
nitroprusiato de sodio.
4. Determinar cuantitativamente la producción de piruvato mediante 2,4-
dinitrofenilhidrazina.
INTRODUCCIÓN
La glucólisis, un conjunto de reacciones que tienen lugar en todas las células, se cree que
es de las rutas bioquímicas más antiguas. Tanto las enzimas como el número y mecanismos
de los pasos de la ruta son muy semejantes en procariotas y eucariotas. Además, la
glucólisis es un proceso anaerobio, que tuvo que surgir en la atmósfera con poco oxígeno
de la Tierra pre-eucariota. En la glucólisis, que también se denomina ruta de Embdem-
Meyerhof-Parnas, cada molécula de glucosa se divide y convierte en dos unidades de tres
carbonos (piruvato). Durante este proceso se oxidan varios átomos de carbono. La pequeña
cantidad de energía que se captura durante las reacciones glucolíticas (alrededor del 5 %
de la total disponible) se almacena temporalmente en dos moléculas de ATP y dos de
NADH. El destino ulterior del piruvato depende del organismo que se considere y de sus
circunstancias metabólicas. En los organismos anaerobios (aquellos que no utilizan oxígeno
para generar energía), el piruvato puede convertirse en productos de desecho. Entre los
ejemplos se encuentran el etanol, el ácido láctico, el ácido acético y moléculas semejantes.
Utilizando oxígeno como aceptor electrónico terminal, los organismos aerobios, como los
animales y los vegetales, oxidan totalmente el piruvato para formar CO 2 y H20 en un
mecanismo complejo por pasos, conocido como respiración aerobia. La glucólisis, que
consta de 10 reacciones, tiene lugar en dos fases:

 La glucosa se fosforila dos veces y se fracciona para formar dos moléculas de

gliceraldehído-3-fosfato (G-3-P). Las dos moléculas de ATP que se consumen
durante esta fase son una inversión, debido a que esta fase crea los sustratos reales
de la oxidación de una forma que se atrapan dentro de la célula.

 El gliceraldehído-3-fosfato se convierte en piruvato. Se producen cuatro moléculas

de ATP y dos de NADH. Debido a que se han consumido dos ATP en la fase 1, la
producción neta de ATP por molécula de glucosa es 2. (McKee et al., 2014).
La ruta glucolítica puede resumirse en la siguiente ecuación:
Destinos de piruvato
En términos de energía, el resultado de la glucólisis es la producción de dos ATP y dos
NADH por molécula de glucosa. El piruvato, el otro producto de la glucólisis, es aún una
molécula con abundante energía, que puede producir una cantidad sustancial de ATP. Sin
embargo, antes de que esto pueda suceder se forma una molécula transicional intermedia
mediante descarboxilación. Esta molécula es la acetil-CoA, que es el sustrato de entrada
del ciclo del ácido cítrico, una ruta anfibólica que oxida totalmente dos carbonos a CO2 y
NADH. En presencia de oxígeno, este ciclo opera al ceder los electrones del NADH (y el
FADH2, otro transportador electrónico) producido en el ciclo del ácido cítrico al oxígeno a
través del sistema de transporte electrónico para producir agua. El sistema de transporte
electrónico consiste en una serie de reacciones ligadas de oxidación-reducción que
transfiere los electrones desde los donadores, como el NADH, hasta los aceptores, como
el 02. Acoplado a este proceso está la generación de un gradiente de protones que impulsa
la síntesis de ATP. En condiciones anaerobias está impedida una posterior oxidación del
piruvato. Diversas células y organismos lo compensan convirtiendo esta molécula en un
compuesto orgánico más reducido y regenerando el NAD+ que se requiere para que
continúe la glucólisis. Este proceso de regeneración del NAD+ se denomina fermentación.
Las células musculares y determinadas especies bacterianas (p. ej., Lactobacillus)
producen NAD+ transformando el piruvato en lactato:

En las células musculares que se contraen rápidamente la demanda de energía es elevada.

Tras reducirse el suministro de O2, la fermentación del ácido láctico proporciona NAD+
suficiente para permitir que continúe la glucólisis (con su bajo nivel de producción de ATP)
durante un período de tiempo corto.
Los microorganismos que utilizan la fermentación del ácido láctico para generar energía
pueden separarse en dos grupos. Los fermentadores homolácticos sólo producen lactato.
Por ejemplo, varias especies de bacterias del ácido láctico cortan la leche. Los
fermentadores heterolácticos o mixtos producen varios ácidos orgánicos. Por ejemplo, la
fermentación ácida mixta se produce en el rumen del ganado. Los organismos simbióticos,
algunos de los cuales digieren la celulosa, sintetizan ácidos orgánicos (p. ej., ácidos láctico,
acético, propiónico y butírico). Los ácidos orgánicos se absorben del rumen y se utilizan
como nutrientes. Se producen también gases como metano y dióxido de carbono. (McKee
et al., 2014).
Cuando se dispone de oxígeno, los organismos aerobios oxidan totalmente el piruvato a
CO2 y H2O. En ausencia de oxígeno, el piruvato puede convertirse en varias clases de
moléculas reducidas. En algunas células (p. ej., levaduras), se producen etanol y CO 2. En
otras (p. ej., células musculares), tiene lugar la fermentación homoláctica en la cual el
lactato es el único producto orgánico. Algunos microorganismos utilizan reacciones de
fermentación heteroláctica que producen además de lactato otros ácidos o alcoholes. En
todos los procesos de fermentación el fin principal es regenerar el NAD+, de forma que
pueda continuar la glucólisis. (McKee et al., 2014).
La ruta glucolítica como tal no requiere oxígeno para funcionar, siempre que el NADH
producido se reoxide, lo que es posible gracias al proceso de la fermentación. Así, la
glicolisis forma parte de algunos procesos fermentativos de azúcares. En general,
fermentación es cualquier proceso en el que la energía liberada por el catabolismo de
sustratos orgánicos es invertida en la síntesis de ATP por fosforilacion a nivel del sustrato.
El mantenimiento del balance redox es esencial y se puede alcanzar a) mediante una
compensación redox interna o dismutación, que origina productos finales con diferentes
estados de oxidación, o b) con la participación de un oxidante exógeno. La fermentación
láctica es un ejemplo del primer tipo. La transformación glucolítica de glucosa en piruvato
se acopla a la reducción del piruvato a L-lactato por la acción del lactato deshidrogenasa.
El NADH producido en la glicólisis es reoxidado durante la síntesis de lactato. (Lehninger,
1980).

MATERIAL REACTIVOS
 

PROCEDIMIENTO

CUESTIOARIO
1. Explique lo que ocurre a nivel molecular en la estructura de la enzima piruvato
descarboxilasa en condiciones alcalinas.
La piruvato decarboxilasa se presenta como un dímero de dímeros con dos sitios activos
compartidos entre los monómeros de cada dímero. La enzima contiene una estructura beta-
alfa-beta. Contiene 563 aminoácidos en cada dímero. La enzima tiene atracciones
intermónomero fuertes, pero los dímeros interaccionan débilmente para formar el
tetrámero.( Dyda F. 1993)
La piruvato decarboxilasa es un homotetrámero y tiene cuatro sitios activos. Los sitios
activos están dentro de una cavidad en el núcleo de la enzima en donde se pueden producir
puentes de hidrógeno y en donde el piruvato reacciona con la tiamina pirofosfato (TPP).
Cada sitio activo tiene 20 aminoácidos incluyendo el Glu-477 que contribuye a la estabilidad
del anillo de la TPP, y el Glu-51 que ayuda en la unión del cofactor. Estos glutamatos
también contribuyen a formar el dipolo neutro de la TPP, actuando como donante de
protones al anillo aminopirimidina de la TPP. El microambiente alrededor de Glu-477 es
muy no polar, contribuyendo a un pKa más alto de lo normal. (Lobell M, Crout DHG 1996)
Los residuos lipofílicos Ile-476, Ile-480 y Pro-26 contribuyen a la no polaridad del área
alrededor de Glu-477. El otro residuo cargado negativamente separado de la coenzima TPP
es el Asp-28, que también ayuda a incrementar el pKa de Glu-477. El medioambiente de la
enzima debe permitir que la protonación del grupo γ-carboxilo del Glu-477 sea alrededor
del pH 6.4. (Lobell M, Crout DHG 1996)
A un Ph mayor no permite la protonación.
2. Defina la reacción química que ocurre cuando el piruvato reacciona con el
nitroprusiato de sodio y con el 2,4-dinitrofenilhidrazina.
El nitroprusiato de sodio detecta grupos cetónicos como el presente en los piruvatos, esto
para evitar que la piruvato descarboxilasa siga transformando el piruvato enacetaldehido.
El piruvato generado al reaccionar con el 2,4-dinitrofenilhidrazina, forma la
dinitrodenilhidrolaza (de color amarilla). (Wong. D 1995)
3. Proponga alguna técnica para caracterizar acetaldehídos.
a. Reactivo de Tollens
El reactivo es una disolución amoniacal de AgOH que se prepara en el momento de su
utilización. Las cetonas no dan esta reacción, excepto las hidroxicetonas y las dicetonas 1
-2, que son reductoras y algunos compuestos nitrogenados como las hidrazinas,
hidroxilaminas, aminofenoles, que no están comprendidos en este grupo, por lo que no
interfieren.
Ag NO3 + NH4OH  Ag(NH3)OH
R-CHO + 2Ag(NH3)OH  R-COOH + 2NH3 + 2Ag0 (espejo) + H2O
Las cetonas no dan esta reacción, excepto las hidroxicetonas y las dicetonas 1 -2, que son
reductoras y algunos compuestos nitrogenados como las hidrazinas, hidroxilaminas,
aminofenoles, que no están comprendidos en este grupo, por lo que no interfieren.
b. Reactivo de Fehling
Se prepara en el momento de su utilización mezclando Fehling A (solución cúprico) con
Fehling B (solución alcalina de tartrato sódico-potásico) en partes iguales. Se forma un
complejo con el ión cúprico que es reducido por los mismos compuestos que reducían al
reactivo de Tollens. Si la reacción es positiva se forma un precipitado rojo de Cu 20
RCHO + 2Cu++ + OH-  RCOOH + CuO2 + H2O
(GEISSMAN, T.A. 1974)
BIBLIOGRAFÍA

 Dyda F, Furey W, Swaminathan S, Sax M, Farrenkopf B, Jordan F (junio de 1993).

«Catalytic centers in the thiamin diphosphate dependent enzyme pyruvate
decarboxylase at 2.4-A resolution». Biochemistry
 GEISSMAN, T.A. 1974. Principios de Química Orgánica. Segunda Edición. Editorial
Reverté.
 Lehninger, A. (1980). Fundamentos de bioquímica. Sao Paulo (SP): SARVIER,
pp.250-254.
 Lobell M, Crout DHG (1996). «Pyruvate Decarboxylase: A Molecular Modeling Study
of Pyruvate Decarboxylation and Acyloin Formation». J. Am. Chem. Soc.
 McKee, T., McKee, J., Araiza Martínez, M. and Hurtado Chong, A. (2014).
Bioquiḿ ica. México; Madrid: McGraw-Hill Interamericana, pp.234-248.
 Wong. D. (1995). QUIMICA DE LOS ALIMENTOS. 1° edición. ACRIBIA EDITORIAL.
México D.F.