Recibido: 19/09/2015, Aceptado: 12/12/2015 Artículo original

Producción de embriones bovinos (Bos taurus) in vitro en co-

cultivo a partir de ovocitos vitrificados en estadío maduro

In vitro embryo production (Bos taurus) in co-culture system

from vitrified mature oocytes

Yander Mavila Briceño Mendoza1, Ilse Cayo Colca2

RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto del co-cultivo en la producción de embriones in vitro a partir de
ovocitos vitrificados en estadío maduro. Los ovocitos fueron aspirados de ovarios colectados del Camal
Municipal de la ciudad de Chachapoyas, luego vitrificados en estadío maduro in vitro (MIV). Posteriormente a su
vitrificación y descongelamiento, se fertilizó con espermatozoides seleccionados y capacitados, finalmente se
realizó el co-cultivo. La producción de blastocistos del grupo control (óvulos sin vitrificar), sin co-cultivo y con
co-cultivo (células del cumulus) fue de 24,9, 9,9 y 9,6%, respectivamente. Los estudios continúan realizándose.

Palabras claves: blastocitos, células del cumulus, co-cultivo, ovocitos, vitrificación.

ABSTRACT

The aim of this investigation was to study the effect of co-culture system on the in vitro production of embryos
from vitrified matured oocytes. The oocytes were aspirated from ovaries collected from the local slaughterhouse
from the city of Chachapoyas, then they were matured in vitro. Next, they were vitrified and fertilized in vitro with
selected sperm. Finally they were cultured in a co-culture system. The production of blastocysts was 24.9, 9.9 y
9.6%, in control, culture system and without co-culture system, respectively.

Key words: blastocysts, cumulus cells, oocytes, co-culture, vitrification.

1
Ingeniera Zootecnista. Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas. Correo electrónico:
mavila.briceño@untrm.edu.pe
2
Ingeniera Zootecnista. Profesora auxiliar de la Facultad de Ingeniería Zootecnista, Agronegocios y Biotecnología de la Universidad
Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas. Jefa del Laboratorio de Biotecnología Animal, Reproducción y Mejoramiento
Genético.

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 Producción de embriones
I. INTRODUCCIÓN
El interés por la criopreservación del ovocito ha
aumentado con la creciente importancia en la
producción de embriones in vitro, la transferencia
nuclear y el almacenamiento de información en los
bancos de genes (Dinnyés et al., 2000). Además, el
corto tiempo que un ovocito permanece viable y el
limitado número de ovocitos que pueden colectarse
por día, hacen que el éxito de la crio preservación de
ovocitos mamíferos sea de gran interés para la
investigación básica y la aplicación comercial
(Albarracín et al., 2005).
Entre los sistemas de criopreservación existentes
destaca la vitrificación que significa "la vidrio
formación" (Hwang y Hochi, 2014), la cual es una
técnica de congelación ultrarrápida basada en el
contacto directo entre la solución de vitrificación que
contiene agentes crioprotectores con células y el
nitrógeno líquido (Rall y Fahy, 1985). La solución
vitrificante posee crioprotectores en alta
concentración que al ser enfriados no cristalizan, sino
que se torna viscosa y pasa del estado líquido al sólido
(Rall y Fahy, 1985).
La producción de embriones bovinos a partir de
ovocitos vitrificados está siendo investigada
ampliamente, así como las condiciones en las que
deben cultivarse; sin embargo hasta el momento no
está claro si la adición de células del cúmulos puede
mejorar el desarrollo de cigotos bovinos cultivados,
generados a partir de óvulos congelados, el cual es el
objetivo principal de esta investigación.
II. MATERIAL Y MÉTODOS
Todos los reactivos y medios de cultivo usados fueron
de SIGMA-ALDRICH (USA) a menos que se
especifique lo contrario.
Obtención y selección de los ovocitos
Los ovarios se transportaron del Camal Municipal de
Chachapoyas, región Amazonas, en un recipiente
isotérmico conteniendo cloruro de sodio al 0,9% (p/v)
con 0,025 mg/ml de estreptomicina, temperado a
37°C.
Los complejos cúmulos ovocitos (COCs) se aspiraron
de folículos de 2-7 mm con una jeringa de 10 ml y una
aguja de 18 G. Los COCs fueron seleccionados usando
un estereoscopio (Olympus, Japón) y solo los que
presentaron un citoplasma homogéneo y al menos dos
capas completas de células del cúmulos fueron usados.
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Yander Mavila Briceño Mendoza
Maduración in vitro
Los COCs se cultivaron en grupos de 25 en una placa
de cuatro pocillos de 500 µL durante 24 horas a una
temperatura de 38,5°C y 5% de CO2, con aire saturado
de humedad en medio de maduración TCM-199
suplementado con 0,1 mg/ml de L-glutamina, 0,25
mg/ml de piruvato de sodio, 0,01 U/ml de hormona
folículo estimulante (FSH), 0,01 U/ml de hormona
luteizante (LH), 50g/ml de gentamicina, 1 µg/ml de
17β estradiol y 10% de suero fetal bovino (SFB).
Fertilización in vitro
Los COCs madurados in vitro fueron colocados en el
medio de fertilización el cual estuvo compuesto por
Talp FIV (Vajta et al., 2000) suplementado con 0,044
g/L de piruvato de sodio, 0,03 mg/ml de heparina, 50
µg/ml de gentamicina y 3,0 mg/ml de suero albumina
bovina (BSA-FAF). La fertilización se realizó con
espermatozoides seleccionados y capacitados con la
técnica de gradientes de percoll; y se incubaron por 18
horas a 38,5°C y 5% de CO2.
Cultivo in vitro
Los cigotos se denudaron con hyaluronidasa de 0,5
mg/ml y se cultivaron en grupos de 25 en una placa de
cuatro pocillos durante 7 días a 38,5°C, con mezcla de
gases, utilizando el medio SOF base (Vajta et al., 2000)
suplementado con 0,044 g/L de piruvato de sodio,
0,039 g/L de L-glutamina, 3 mg/ml de BSA-FAF, 1X
de amino ácidos esenciales, 1X de amino ácidos no
esenciales, 10 mg/ml de EGF, 0,1 mg/ml de ácido
cítrico, 0,5 mg/ml de myo-inositol, 50 µg/ml de
gentamicina y 2% de SFB. Se consideraron ovocitos
degenerados a aquellos que no presentaron división
celular y tenían poco o nada de contenido
citoplasmático.
Co-cultivo de las células del cúmulos

Las células del cúmulos de los ovocitos madurados
fueron retirados ligeramente y centrifugados en medio
de maduración a 1000 rpm por 10 minutos, luego se
cultivaron en una placa de cuatro pocillos con DMEN-
F12 suplementado con 0,044 g/L de piruvato de sodio,
0,039 g/L de glutamina, 10% de SFB, 10 mg/ml de
EGF y 0,5 mg/ml de kanamicina-estreptomicina a
38,5°C y 5% de CO2 hasta que las células crezcan
llenando toda la placa.
Vitrificación y descongelamiento de ovocitos
Los COCs fueron denudados hasta dejarlos con al
menos dos capas homogéneas de células de cúmulos y
luego se sumergieron en una solución equilibrante
(SE) por 3 minutos. La SE consistió en 7,5% de etileno
glicol (EG) y 7,5% de dimetil sulfóxido (DMSO) en
Producción de embriones Yander Mavila Briceño Mendoza

solución base (SB). La SB estuvo compuesta por

TCM-199 HEPES y 20% de SFB. Asimismo, los
COCs fueron expuestos por un minuto a la solución de
vitrificación (SV), que consistió en 15% de EG, 15%
de DMSO y 0,5 M de sucrosa en SB. A continuación,
los COCs fueron colocados en los cryotops y
sumergidos en nitrógeno líquido. Después de tres
días, se descongelaron. La descongelación se realizó
sumergiendo el cryotop directamente en la solución
de descongelamiento (SD) por 30 segundos a 40°C (1
M de sucrosa en solución base), para posteriormente
exponerlos a la solución de dilución (SDi) por 5
minutos a 40°C (0,5 M sucrosa en solución base).
Finalmente los ovocitos fueron lavados tres veces en
SB dejándolos reposar 5 minutos entre cada lavado.

Análisis estadístico
Con el análisis de varianza (ANOVA) se evaluó la
diferencia entre promedios de mórulas y blastocitos
obtenidos en los grupos experimentales con un α=5%.
La prueba de Dunnet se usó para determinar en qué
par de tratamientos hubo mayor diferencia
significativa (α=5%). Figura 1. Embriones producidos a partir de ovocitos
vitrificados (A. Con co-cultivo; B. Sin co-cultivo). La barra
representa 100 µm

III. RESULTADOS
IV. DISCUSIÓN
La tabla 1 muestra la producción de embriones por
fertilización in vitro post descongelamiento, a partir de
COCs vitrificados en estadío maduro. Se observa que Fernández et al. (2012), observaron que después del
el porcentaje de mórulas fue de 11,6, 4,2 y 6,9%, y la proceso de vitrificación y descongelamiento la
viabilidad de los ovocitos sufre una disminución
producción de blastocistos de 24,9, 9,9 y 9,6%, para
estadísticamente significativa (p<0,05); tratando de
ovocitos del grupo control (sin vitrificación), sin co- mejorar este proceso se tomó como opción el uso del
cultivo (ovocitos vitrificados y cultivados co-cultivo para la producción de embriones in vitro.
normalmente) y con co-cultivo (ovocitos vitrificados
El uso de co-cultivo en la producción de embriones in
cultivados sobre las células del cúmulos), vitro ha sido ampliamente estudiado; pero la
respectivamente (figura 1). información referente a sistemas de co-cultivo en la
producción de embriones fertilizados in vitro a partir
Tabla 1. Estadío de desarrollo de embriones in vitro al de ovocitos vitrificados es escasa.
séptimo día de cultivo En esta investigación se trabajó con tres grupos
experimentales: control, cultivo normal y co-cultivo
n Degenerado <32cel Mórula Blastocisto con células de cúmulos para evaluar si influyen en la
n (%) n (%) n (%) n (%)
producción de embriones a partir de ovocitos
18 42 73 21 45 vitrificados, encontrando una producción de
Control 1 (23,2) (40,3) (11,6)a (24,9)a
blastocistos de 24,9%, 9,9% y 9,6%, respectivamente.
Sin co- 71 42 19 3 7
cultivo (59,1) (26,8) (4,2)b (9,9)b Estos resultados son diferentes a los reportados por
Goovaerts et al. (2009) quienes observaron que el co-
Con co- 73 39 22 5 7 cultivo era beneficioso para la producción de
cultivo (53,4) (30,1) (6,9)b (9,6)b
blastocistos provenientes de ovocitos no vitrificados,
obteniendo un aumento en la producción de
a,b
. Letras diferentes significa diferencias significativas (p<0,05) blastocistos de 2,9 a 21,8% (p<0,05).
Los resultados contradictorios a este autor podría
deberse a que los cigotos cultivados en esta
investigación proceden de ovocitos vitrificados, se

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sabe además que al momento de la criopreservación de cryopreservation of bovine oocytes. BioMed

ovocitos ocurren daños causados por las bajas
temperaturas (Martino et al., 1996) como alteraciones
citológicas, ruptura de membranas, daño de
cromosomas, fragmentación del ADN,
endurecimiento y fractura de la zona pelúcida y
anomalías bioquímicas como deshidratación y pérdida
de función de proteínas (Men et al., 2003). Estas
alteraciones disminuyen la competencia del ovocito
por el incremento en la tasa de degeneración durante el
cultivo posterior (Lim et al., 1992).
El efecto de la vitrificación de los ovocitos no solo
estaría ocasionando daños al óvulo en sí, sino también
a las células del cúmulos. Asimismo podría estar
aminorando los efectos positivos del co-cultivo,
haciendo las diferencias no significativas.
V. CONCLUSIÓN
No existe diferencia significativa en el uso del co-
cultivo frente al cultivo normal para la producción de
embriones in vitro procedentes de ovocitos
vitrificados en estadío maduro.
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