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Francine Ramos
Existem aproximadamente 23000 genes no genoma humano. Genes raros são de difícil
localização. Em resumo, a técnica de PCR é uma ferramenta de biologia molecular que permite
a replicação in vitro de DNA de forma rápida a partir de quantidades muito pequenas de
amostra sem a utilização de clonagem.
Reagentes da reação:
H2O → agente de solubilização.
DNA molde → DNA alvo não precisa ser isolado (definição se dá pelos primers), uma
única molécula de DNA é suficiente, as amostras podem ser de várias fontes (exceto
hemácias, pois são anucleadas). A amostra pode ser acondicionada em parafina e ser
viável por milhares de anos.
Taq DNA polimerase → enzima responsável pela síntese de DNA, direção 5’→3’,
sequências muito longas ou ricas em CG a enzima comete erros que precisam ser
reparados, temperatura ótima de atividade = 72°C.
Mg+2 → cofator enzimático da taq, auxilia nas transformações bioquímicas.
Primers → se anelam na fita simples para dar início à reação complementando as
extremidades 5’ das regiões de interesse.
dNTPs (deoxinucleotídeo trifosfato) → “tijolinhos” para síntese das bases
nitrogenadas, concentrações equivalentes.
Tampão (10x) → mantém o pH ótimo para atividade enzimática.
Desnaturação → ocorre a 94°C. Separação das duplas-fitas pela ação do calor (DNA
melting).
Anelamento → ocorre a 57°C. Ligação dos primers nas suas sequências alvo. Melting
point dos primers: temperatura na qual 50% dos templates alvo estão pareados com
os primers.
Extensão → ocorre a 72°C. Taq polimerase inicia sua atividade sintetizando novas fitas
de DNA.
Cinética da PCR:
A amplificação é geométrica → após n ciclos, 2n moléculas de DNA fita dupla. Na prática,
somente de 10 a 30% é a quantidade de amplificação, mas ainda assim é visível no gel de
agarose.
Fase de screening → ciclos iniciais.
Fase intermediária → acúmulo exponencial de fragmentos de DNA.
Fase de amplificação linear → amplificação atinge nível sub-ótimo.
Fase de platô → a quantificação de produto é estável. Over amplification. 10 8 ou 1012
moléculas de DNA/100 µL
Cuidados com a reação → como a reação é muito sensível (amplifica a partir de pouca
amostra) contaminação vai afetar o resultado final. É necessário adicionar dois controles:
negativo (mix sem DNA molde → será sempre o último tubo, representativo dos demais) e
um positivo (DNA contendo a sequência alvo → pode ser comprado).
Amplificação inespecífica → região do DNA molde que não a de interesse onde também
ocorre anelamento dos primers (pode ser a causa de bandas “arrastadas”).
Variações possíveis:
Anelamento dos primers → a temperatura e o tempo dependem da composição
das bases (quantidade de CG), tamanho e concentração dos primers na reação. A
temperatura aplicável é 5°C abaixo da Tm (temperatura de melting) dos primers
que pode variar entre 55 e 72°C. Aumento da temperatura → aumento da
ESPECIFICIDADE!
Extensão → a temperatura e o tempo dependem do tamanho e da concentração
dos fragmentos na reação. 72°C é a temperatura ótima da atividade da Taq
polimerase. Extensão de 1 minuto = 2Kb.
Desnaturação → temperatura recomendada é na faixa de 94-97°C, temperaturas
mais altas são recomendadas para fragmentos ricos em CG, porém temperaturas
altas em tempo demais diminuem a atividade enzimática.
A DNA polimerase mais utilizada é a Taq que em altas concentrações gera produtos
inespecíficos e em baixas concentrações gera quantidade insuficiente de produto desejado.
Execução da PCR:
Áreas diferentes de manipulação do DNA pré e pós amplificação desejáveis para evitar
contaminação.
APLICAÇÕES DA PCR
Áreas de pesquisa:
Genética molecular → análise de polimorfismos, mutações gênicas.
Análise de expressão de RNA (rt-PCR).
Micro e virologia → investigação da presença de micro-organismos, determinação de
cepas ou análise filogenética.
Genética molecular:
Extração de DNA, amplificação de determinadas regiões do DNA (para isso é necessário
desenho de primers específicos), análise dos fragmentos amplificados para conhecer a
sequência de DNA (clivagem com enzimas, sequenciamento ou hidridização).
Diagnóstico:
Doenças genéticas, infecciosas (presença ou ausência do patógeno. Para isso, os primers
devem ser específicos anelando unicamente no genoma do patógeno de suspeita), análises
forenses.
Mas e se houver um inibidor da Taq na amostra? → A reação não ocorrerá, não aparecerá
banda no gel = falso-negativo. Possibilidade de melhora → inclusão de mais um par de primers
que anele apenas no DNA do hospedeiro.
E se a investigação for de um vírus com genoma de RNA? → Aí será necessário usar a
transcrição reversa para transformar este genoma de RNA em DNA.
Cuidados para utilizar a PCR em diagnóstico: cuidado com contaminação das amostras tendo
atenção à manipulação e trabalho em fluxo laminar horizontal com higienização prévia.
Pode-se fazer o diagnóstico de qualquer micro-organismo por PCR? → A princípio sim, mas a
técnica apresenta limitações e é indicada quando: a cultura é difícil, presença de anticorpos é
inconclusiva, necessário quantificar a carga viral, necessário determinar o subtipo devido ao
prognóstico.
Alguns exemplos de diagnóstico por PCR: HPV, infecções por Chlamydia sp., hepatite C (quanti
e qualitativo utilizando-se a transcrição reversa), HIV (quanti e qualitativo utilizando-se a
transcrição reversa), herpes humana, infecções por Micobacterium tuberculosis, análise de
resistência a antivirais por mutações no vírus.
VARIAÇÕES DA PCR
rt-PCR → é uma amplificação onde o molde para amplificação é RNA e não DNA, por
isso é necessário transformar o RNA em cDNA. É baseado em uma transcrição reversa
seguida de uma PCR. Aplicações → detecção e quantificação da expressão de mRNAs
em tecidos diferentes ou no mesmo tecido submetido a tratamentos diferentes, em
tecidos normais ou alterados. Primers poli-T → reconhecimento da cauda poli-A.
PCR convencional alelo-específico → para diferenças na sequência de DNA, utiliza 3
pares de primers.
PCR multiplex → análise de diversos genes. Usado para diagnóstico de doenças
infecciosas.
PCR-RFLP → PCR seguido de clivagem com enzimas de restrição.
Nested PCR → “PCR da PCR”.
REAL-TIME PCR
Aplicações:
Todas as aplicações da PCR convencional;
Quantificação de carga viral;
Quantificação de expressão gênica;
Testes de eficiência terapêutica;
Detecção de agentes infecciosos;
Caracterização do agente (genotipagem).
ELETROFORESE
Tipos de eletroforese:
Horizontal → utiliza gel de agarose. Usada para DNA total ou fragmentos grandes,
ideal para separação de fragmentos com diferença superior a 20 pares de bases.
Vertical → utiliza gel de acrilamida. Usada para fragmentos menores (apresenta maior
sensibilidade), ideal para separação de fragmentos com diferença inferior a 20 pares
de bases.
Materiais necessários para eletroforese:
Cuba;
Fonte → dispositivo necessário para produção do campo elétrico, proporciona uma
diferença de potencial entre os polos negativo e positivo. É necessário ajustar a
intensidade do campo (W = V. A).
Tampão → uma solução tampão é composta por um aceptor e um doador de prótons,
permitindo assim, o fluxo de elétrons. TBE, EDTA.
Suporte ou gel → é um material poroso que permite a migração diferencial das
moléculas. Agarose (polissacarídeo, possui grau de pureza variável, diversas variações
para aumentar a resolução, diminuir ponto de fusão, etc.)
Corantes → para migração (azul de bromofenol, xileno cianol. É necessário adicionar
uma substância de alta densidade como sucrose ou glicerol para permitir a aplicação
no gel), para visualização do DNA (brometo de etídeo que é mutagênico, prata, SYBR
safe, Gel Red → ultrassensível, não citotóxico nem mutagênico, não apresenta risco
ambiental, detecta vários tipos de material genético, visualização no transiluminador.
Terapia gênica;
Vacinas gênicas;
Animais e plantas transgênicas;
Produção de proteínas raras (insulina, hormônio do crescimento, vacina para hepatite
B);
Construção de bibliotecas de DNA para sequenciamento genômico.
O que são vetores? → veículos. Transportam o inserto de DNA para dentro da célula
hospedeira onde será replicado e/ou expressado em alguns casos. Devem possuir capacidade
de replicação autônoma.
Características necessárias dos vetores:
Principais vetores:
Promotor forte;
Sítios de ligação ao ribossomo;
Vários sítios de clonagem imediatamente a jusante destes sinais;
Os promotores podem ser induzíveis.
SEQUENCIAMENTO
Sequenciamento automatizado:
Problemas no sequenciamento:
Aplicações do sequenciador:
HIBRIDIZAÇÃO
Uma sonda de DNA é um DNA fita simples, de tamanho pequeno (50-300pb) que é marcado
com uma substância radioativa ou conjugado com um produto que permita sua visualização. O
objetivo de uma sonda é encontrar (hibridizar com) um trecho de DNA para o qual ela seja
pelo menos parcialmente complementar e permitir sua localização em outro ensaio como
Southern Blot, ELISA, etc.
Southern blotting → uma das primeiras técnicas de biologia molecular a utilizar a hibridização.
Utilizada para DNA.
Aplicações:
Aplicações:
Tecnologia de microarray:
Pode ser utilizado para genotipagem → para isso utilizam pequenas sondas com a sequência
de cada alelo, ou seja, para cada gene duas sondas. Amplificação de vários sítios por PCR, a
verificação não é feita em gel, mas sim no próprio chip, permite a genotipagem de um grande
número de variantes simultaneamente.