Problemas de Biología Molecular II – Segundo semestre 2015.

1. Recientemente se ha clonado el gen que codifica para una proteína específica de

una cepa de Staphylococcus aureus (cepa HQ) altamente virulenta. Dicho gen no está
presente en el genoma de cepas menos agresivas de esta bacteria ni en las bacterias
patógenas de humanos caracterizadas hasta la fecha. La mayoría de los pacientes
infectados con la cepa HQ mueren por septicemia si no son tratados antes de 7-10 días
post-infección con un antibiótico específico. Los síntomas de la enfermedad se presentan
a las 24 horas post-infección y son muy similares a los síntomas de pacientes infectados
con otras bacterias sensibles a otros antibióticos. Por lo tanto, es muy importante la
detección temprana y específica en pacientes infectados con S. aureus HQ. Basado en la
información anterior, diseñe dos estrategias distintas que permitan la detección de esta
bacteria, en pacientes infectados que presentan síntomas típicos de este tipo de patologías.
Describa las principales etapas de cada estrategia y discuta las condiciones críticas que le
proporcionan especificidad a cada una de sus metodologías propuestas.

2. Se desea clonar el gen de la hormona prolactina de cerdo el cual aún no ha sido

aislado y por lo tanto, tampoco ha sido secuenciado ni mapeado. Sin embargo, el gen de
la prolactina de ratón ha sido clonado, se conoce su secuencia y la secuencia de
aminoácidos de la prolactina de ratón.
Explique 2 estrategias diferentes que usted usaría para encontrar y clonar el gen de la
prolactina de cerdo.

3. Se desea sobreexpresar el gen de la DNA polimerasa I de Escherichia coli en

levaduras. Para ello se dispone de oligonucleótidos específicos de 25 mer que flanquean
el gen de la enzima, ya que se conoce la secuencia completa del gen.

a) Indique las etapas necesarias, en forma secuencial, hasta tener subclonado el gen
en un vector de expresión de levaduras. Especifique claramente los reactivos y
materiales que usaría.
b) Qué tipo de vector usaría y que características genéticas debería tener la cepa
hospedadora de ese vector? Haga un dibujo del vector de expresión indicando los
genes y regiones regulatorias más importantes. Para su respuesta considere que la
finalidad de este experimento es la sobreexpresión del gen.
c) Con los antecedentes entregados, podría usted elaborar una estrategia para
sobreexpresar sólo el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli?
Explique claramente y con precisión lo que haría.

4. Para aislar DNA cromosómico de Escherichia coli, un investigador decidió seguir

un protocolo descrito que consiste en las siguientes etapas:

i) Crecer un cultivo de E. coli en 50 mL de medio LB hasta la fase estacionaria (12-

15 horas con agitación constante).
ii) Centrifugar y resuspender las células en un amortiguador Tris-HCl, pH 7.4 que
contiene EDTA y NaCl.
iii) Adicionar SDS a 37C para romper las células.
iv) Realizar una extracción fenólica para eliminar proteínas.
v) Realizar una extracción con CHCl3:alcohol isoamílico=24:1.
vi) Precipitar el DNA con dos volúmenes de etanol absoluto.
vii) Resuspender el DNA en 100 µL de amortiguador Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA
1 mM.
viii) Adición de 2 µL de Ribonucleasa A e incubación a 37C por 1 hora para eliminar
el RNA.

Después de realizar estas etapas el investigador decidió cuantificar el DNA

obtenido. El protocolo indicaba que de acuerdo a estas condiciones se obtenía un
rendimiento máximo de 10 g/mL cuando el DNA se cuantificaba leyendo absorbancia a
260 nm. Sin embargo, para sorpresa del investigador la lectura de absorbancia indicaba
que tenía una concentración de 100 g/mL.

a) Cómo se puede explicar esta discrepancia?

b) Cómo comprobaría su explicación?
c) Podría usted indicar alguna etapa adicional que resolviera el problema?

5. Uno de los primeros genes de vertebrados caracterizados detalladamente fue el

gen que codifica para la hormona peptídica insulina. La insulina se sintetiza como un
precursor proteico (preproinsulina) y posteriormente sufre procesamiento proteolítico
para generar la hormona activa. En el año 1980, Efstratiadis y colaboradores (Cell 20
:555-566, 1980) aislaron el gen de la preproinsulina de pollo a partir de una genoteca de
DNA genómico de pollo, para compararlo con los clones de cDNA y de DNA genómico
de rata, previamente obtenidos.

a) ¿Por qué los investigadores necesitan analizar y comparar clones de

preproinsulina en ambas genotecas, de cDNA y de DNA genómico? Para su respuesta
haga un análisis molecular completo y preciso.

b) ¿De qué tipo de tejidos y/o fluidos biológicos, tanto de ratas como de pollos,
aislaría usted los ácidos nucleicos para construir las genotecas de cDNA y de DNA
genómico de la preproinsulina? Fundamente claramente.

6.a) La expresión del cDNA de la beta-hemoglobina en Escherichia coli da como

resultado un polipéptido completo y correcto. Sin embargo, al intentar expresar el gene
clonado proveniente del DNA genómico no se obtiene el producto génico. Explique en
términos moleculares la razón de que el gen se exprese correctamente en una condición
y no en la otra.

6.b) Se desea caracterizar un gen en el cual se producen mutaciones que causan una
seria enfermedad al ser humano. Dicho gen, incluyendo sus secuencias regulatorias
flanqueantes posee un tamaño de 200 kpb. La distancia desde la primera a la última base
codificante es de 140 kpb, la que comprende 10 exones y 9 intrones. El tamaño total de
los exones es de 38.7 kpb y los intrones contienen 101.3 kpb de DNA. Para la total
caracterización del gen se necesita:

i) Un clon intacto del gen completo incluyendo sus secuencias flanqueantes.

ii) Un clon conteniendo sólo las secuencias codificantes.
iii) Un clon del exón 3, el cual es el principal sitio de las mutaciones que causan la
enfermedad.

Basado en el tamaño de los insertos, qué vectores usaría para la obtención de cada
uno de los clones. Fundamente brevemente.

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7. Para clonar un gen bacteriano de 1800 pares de bases (pb) que codifica para una
enzima, se utilizó la técnica de PCR ya que se conocía la secuencia de los extremos del
gen (50 pares de bases de cada extremo). Para ello se procedió de la siguiente manera:

i) Se diseñaron y se sintetizaron dos primers, de 30 mer cada uno para cada extremo
del gen.
ii) Se amplificó la secuencia del gen por PCR (30 ciclos), utilizando condiciones de
apareamiento de los primers altamente estrictas.
iii) Se analizó el fragmento amplificado por electroforesis en gel de agarosa
visualizándose sólo una banda de 1800 pares de bases.
iv) El fragmento amplificado se clonó en un vector diseñado para clonar productos
de PCR. De los clones recombinantes obtenidos se seleccionó uno al azar para
experimentos posteriores.
v) El inserto de 1800 pb del vector recombinante seleccionado se subclonó en un
vector de expresión bacteriano conteniendo el promotor tac y un terminador
dependiente de Rho, para la sobreproducción del producto génico.

a) Se obtuvo gran cantidad del polipéptido de tamaño molecular correcto, pero

carecía de la actividad enzimática esperada. Esto causó gran sorpresa en los
investigadores, ya que se esperaba que se mantuviera intacta su actividad
catalítica. i) Discuta la(s) probable(s) causa(s) de la producción de un polipéptido
inactivo y ii) explique de qué manera podría usted solucionar (o haber evitado)
este problema.
b) Explique: i) cómo se regula la expresión del gen clonado bajo el comando del
promotor tac, ii) el mecanismo de la terminación dependiente de Rho y iii) cuáles
son las características genéticas más importantes de la cepa hospedadora.
c) Explique brevemente una metodología alternativa para el clonamiento de este gen,
sin usar PCR.

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8. Para la producción de una enzima monomérica de importancia industrial, se ha

demostrado que transformando una cepa de Saccharomyces cerevisiae con un
vector que contiene el cDNA del gen bajo el comando de un promotor potente la
producción de la enzima aumenta aproximadamente 100 veces, ya que el
promotor natural de este gen es muy débil.
a) Qué tipo de vector usaría para producir la enzima a nivel industrial? Considere
que a nivel industrial se crece la levadura en cientos o miles de litros de medio de
cultivo y que se utilizan medios de cultivos completos ricos en todo tipo de
nutrientes. Fundamente su respuesta.
b) Qué promotor cree usted que es adecuado para que la expresión de este gen sea
eficiente. Explique.
c) Qué otro tipo de secuencias regulatorias adicionaría usted al vector además de un
promotor potente para asegurar la expresión eficiente del gen? Justifique.

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8. Se desea marcar radiactivamente un fragmento de DNA puro de 4350 pares de

bases por el método de nick-translation. Para ello, se necesita conocer la concentración
de la preparación de dicho fragmento purificado. La idea es utilizar un método
densitométrico que son más exactos que los métodos espectrofotométricos. La primera
etapa del método es realizar una electroforesis en gel de agarosa para comparar el
fragmento puro con un estándar de tamaño molecular, en este caso DNA del fago 
digerido con HindIII (ver figura). El análisis densitométrico arrojó los siguientes datos
(ver tabla):

1 S

Tamaño molecular Intensidad relativa

23130 10,0
9416 4,0
6557 4,5
 4361 5,0
2322 4,5
2027 4,3
564 0,2
125 0,15

Los datos de las intensidades de las bandas del estándar se calcularon considerando que
la intensidad relativa de la muestra problema (fragmento puro, carril 1) corresponde a 1.
En el carril S, se cargaron 5 L del estándar cuya concentración es de 0,1 g/L.

a) Calcule la cantidad de DNA contenida en la banda del carril 1, exprese este valor
en nanogramos.
b) Si en el carril 1 se cargó 5 L de la muestra del fragmento purificado, ¿cuál es la
concentración de esa preparación de DNA?
c) Inicialmente el investigador tenía 50 L de la preparación del fragmento puro,
gastó 5 L para cargar el gel y por lo tanto, le quedan 45 L ¿qué cantidad de
DNA tiene disponible para hacer la marcación radiactiva?
d) Haga un listado secuencial de los principales reactivos que necesita el
investigador para marcar el DNA mediante la técnica de nick-translation. Para ello
considere que el DNA que tiene que marcar es de doble hebra lineal con extremos
romo. A cada uno de los reactivos indicados asígnele una función en el proceso.

NOTA: Todos sus cálculos numéricos deben ser explicados teóricamente, es decir, se
debe explicar el razonamiento y todos los cálculos intermedios se deben incluir.
Resultados numéricos sin dichos fundamentos, aunque sean correctos no tendrán
puntaje.