LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA No 1.- Desnaturalización y reconocimiento de aminoácidos

I. EL PROBLEMA.

- Identificar los diferentes factores que afectan la estabilidad de las proteínas y conocer algunas de las pruebas
más comunes en la identificación de aminoácidos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS

Reacción Xantoproteica
Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados
de color anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina y Triptófano.

Reacción con acetato de Plomo alcalino

Los Aminoácidos azufrados como la cisteína se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris
oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización consiste en el desdoblamiento total o parcial de la conformación nativa de una cadena

polipeptídica o una proteína. Consiste en romper las fuerzas que estabilizan la estructura secundaria, es decir, los
puentes de hidrógeno entre enlaces peptídicos y/o terciaria o cuaternaria, como las fuerzas esquematizadas en la figura
1.

FIGURA 1

1) Puentes disulfuro. 3) Puente de hidrógeno.

2) Puente salino o interacción electrostática. 4) Interacción hidrofóbica.

Las proteínas tal como se encuentran dentro de las células o en los fluidos corporales, tienen una conformación nativa y
se encuentran solubilizadas en soluciones coloidales o suspensiones coloidales, si se producen ciertas alteraciones en
las condiciones del medio acuso las proteínas se desdoblan pierden solubilidad y precipitan o coagulan.
Diversos agentes desnaturalizantes pueden inducir estas alteraciones como la agitación, el cambio de temperatura, la
adición de sustancias ácidas o básicas, sales, metales pesados, reactivos con grupos tiol, solventes orgánicos, etc.
III. MATERIALES Y REACTIVOS.

Material por grupo

Veinte tubos de ensayo
Dos pipetas graduadas de 5ml
Dos probetas de 10 ml
Dos gradillas
Una propipeta
Una pinza para tubo de ensayo
Una espátula
Cinco goteros plásticos

Material y reactivos generales.(volúmenes calculados para diez grupos de laboratorio)

- Acido tricloroacético (ATA) al 20% (200ml)

- isopropanol al 96% (100mL)
- Hidróxido de sodio 20% (300 ml)
- Solución de acetato de plomo 0,1 M (100ml) (en gotero)
- Acido nítrico concentrado (100ml)
- Hidróxido de sodio 40% (100 ml) (en gotero)
- Hielo

Posibles muestras: (volúmenes calculados para un grupo de laboratorio)

- BSA al 2% en NaCl al 0,9% (200ml)

- Gelatina sin sabor en NaCl al 0,9% (200ml)
- Peptona al 2% en NaCl al 0,9% (200ml)
- Clara De Huevo 1: 3 en NaCl al 0,9%( 200ml)
- Yema De Huevo 1:1 en NaCl al 0,9%( 200ml)
- Leche Cruda ( 200ml)
- Suplemento dietario: Protizyme banana creme (metabolic nutrition) al 2% en NaCl al 0,9% (200ml)
- Caseína en NaOH al 1% (200ml)
- Lactosuero (5.7 g/L) disuelta en NaCl 0.9%

NOTA: EL PROFESOR ESCOGERÁ UNA MUESTRA PARA CADA UNA DE LAS PRUEBAS E
INFORMARÁ A LOS ESTUDIANTES CON ANTERIORIDAD EL NOMBRE DE LA MUESTRA
PARA PODER ELABORAR EL PREINFORME.

IV. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTOS DE DESNATURALIZACIÓN.

1. Desnaturalización térmica:

Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución acuosa de la muestra, calentar al baño maría y observar si se
presenta algún cambio.

2. Desnaturalización por pH extremo:

Colocar en un tubo de ensayo 3ml de solución acuosa de la muestra, adicionar 0.5ml de ácido tricloroacético (ATA) y
observar.

3. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos:

Coloque en un tubo de ensayo 5ml de solución acuosa de la muestra, adicione 5ml de isopropanol agite y deje en
reposo. Observe.
4. Desnaturalización por metales pesados:

En un tubo de ensayo coloque 3ml de solución acuosa de la muestra, adicione gota a gota (hasta 10 gotas) la solución
de Acetato de plomo 0.1M, agite y déjelo en reposo. Observe.

PROCEDIMIENTOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS.

5. Reacción con acetato de Plomo alcalino

En un tubo de ensayo coloque 3ml de solución acuosa de cada muestra, adicione 2 ml de solución de NaOH al 20% y
luego 20 gotas de solución de acetato de plomo 0.1 M. Caliente al baño maría y observe.

6. Reacción xantoproteíca
En un tubo de ensayo coloque 3ml de solución de la muestra, adicione 1 ml de HNO3 concentrado y caliente al baño
maría. Luego enfrié en un baño con agua –hielo y adicione gota a gota una solución de NaOH al 40% agitando
cuidadosamente y en frío. Observar.

VII. BIBLIOGRAFÍA.

- Aspectos teóricos relacionados con el laboratorio de Bioquímica. (1991). Medellín: Politécnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid.
- Cheftel, J. (1989). Proteínas alimentarias. Zaragoza: Editorial Acribia.
- Plummer, D. (1981).Bioquímica Práctica. México: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana.
- Rentina, G. (1974 ).Técnicas de Bioquímica aplicada. México: Editorial interamericana.
 PREINFORME / DESNATURALIZACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS
Nombre____________________________ Grupo____
Recuerde que solo entregará por escrito el título, las fichas técnicas, diagramas de flujo, resultados esperados y
bibliografía. En su quiz de laboratorio(oral o escrito) se le evaluarán sus diagramas de flujo y la consulta.
1. Consulta

a) Revise sobre la composición de su muestra y diseñe una tabla con la siguiente información según
corresponda:
-)Una sola proteína: dé el nombre de esta y muestre la concentración o el número dentro de la estructura
primaria, de cada uno de los 20 aminoácidos en su muestra.
-) Una mezcla de péptidos: mencione cómo se obtiene esta muestra y muestre la concentración de cada
uno de los 20 aminoácidos en su muestra.
-) Una mezcla de varias proteínas: lista de las proteínas constituyentes y muestre la concentración de cada
uno de los 20 aminoácidos en su muestra.
-) Varias proteínas junto con otras biomoléculas: realice una lista de las proteínas constituyentes e indique el
contenido de proteína en porcentaje y además muestre la concentración de cada uno de los 20 aminoácidos en
una tabla.

b)Mencione en general si su muestra es inestable, es decir se desdobla y precipita con todos los agentes
desnaturalizantes a usar (temperatura alta, pH extremo, metal pesado y solvente orgánico), o si por el contrario es
estable en algunos.
*Para responder esta consulta revisé libros de química de alimentos que incluyan la naturaleza química, propiedades y
posibles procesos de extracción de los materiales biológicos originales.
 2. Fichas técnicas
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio
Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Primeros auxilios

*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),
extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o
peligroso para el medio ambiente (N).
3. Bibliografía (normas APA)

4. Procedimiento
4.1 Desnaturalización térmica

Resultado
esperado:_________________________________________________________________________________
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 Diagrama de flujo:

Procedimiento
4.2 Desnaturalización por pH extremo

Resultado
esperado:_________________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo:
4.3. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos

Resultado esperado:
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Diagrama de flujo:

4.4. Desnaturalización por metales pesados

Resultado esperado:
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Diagrama de flujo:
4.5. Reacción con acetato de Plomo alcalino
Resultado esperado:
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Diagrama de flujo:

4.6 Reacción xantoproteíca

Resultado esperado:
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Diagrama de flujo:
INFORME Nombre________________________________________________ / Grupo____
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1.Tablas
Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento (evite limitarse a escribir tubo 1, tubo 2,etc)
y describa en forma organizada las observaciones en cada tubo y si la prueba puede considerarse
positiva o negativa.
Incluya fotos de tubos debidamente marcados

2.Discusión de resultados
Recuerde que no es simplemente un cuestionario a responder y que deben corresponder con tablas y FOTOS.
Para cada prueba de desnaturalización explicar y no solo describir, en forma concreta:

1- ¿Si ocurrió o no la desntauralización y cómo se evidenció?

2-Los enlaces o interacciones que se ven afectadas por al exposición al agente desnaturaliznate.

3-Aclare si se altera la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria.

4-La relación con el fundamento teórico, el resultado esperado y consulta (naturaleza química, composición y
estabilidad de la muestra) del preinforme.

Para cada prueba de reconocimento de aminoácidos y proteína explicar:

1- El o los grupos funcionales que reaccionaron o los responsables de la coloración positiva del ensayo con
aminoácidos o proteína, use imagenes de fórmulas estructurales.
2-La ecuación química correspondiente con el o los aminoácidos particulares que pudo identificar .
3-Describir el fundamento químico de la prueba realizada.
4-La relación con toda la información del preinforme:consulta (tablas de composición de aminoácidos y proteínas)
y resultado esperado.

*Recuerde explicar tanto las pruebas positivas o negativas y usar citas que correspondan con la bibliografía.

4.Redacte la bibliografía correspondiente en normas APA.