- Principio de la técnica:

Antecedentes: La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de

vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se
hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija
se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas
presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía
líquida de alta resolución (UHPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con
las altas presiones requeridas.

La cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución (UHPLC) es una técnica que permite separar,
identificar y cuantificar los componentes de una mezcla compleja. La separación se basa en la
diferente distribución de los componentes entre dos fases inmiscibles, una móvil y una
estacionaria, esta última retenida dentro de una columna. Es utilizada frecuentemente en
Bioquímica y Química Analítica para la separación de componentes de una sustancia determinada,
basándose en diferentes tipos de interacciones químicas.

Ventajas:

 Técnica sencilla y rápida.

 Se puede usar desde la escala microanalítica, hasta la industrial.
 Permite tener un registro continuo del análisis.
 Puede aplicarse a sustancias lábiles, por ser poco destructiva.
 Volúmenes de inyección mayores.
 Mayor precisión.
 No se limita a analitos volátiles.

Equipo:

1. Recipiente de a fase móvil: es el que contiene e disolvente y puede ser vidrio o de acero
inoxidable.

2. Bomba: la misión de la bomba es a de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de

la fase móvil a través de la columna y está construida con materiales inertes frente a la
fase móvil. Las bombas que se emplean en HPLC son de tres tipos:
 - Jeringa remachada con tuerca.
- Bombas de vaivén.
- Neumáticas, o de presión constante.

Las bombas se encuentran adaptadas a un sistema de mezclado donde como su nombre

lo indica se van a mezclar el mezclado y de la presión con la cual va a trabajar el sistema
en la determinación. Básicamente hay dos tipos de sistema.

Sistema de mezcla en alta presión: el sistema de mezclado utiliza una bomba para cada
uno de los disolventes que se van a mezclar, conectadas a una cámara donde se van a
mezclar.

3. Sistema de inyección: Es el encargado de inyectar la muestra ya disuelta para que pueda

pasar por las columnas.

4. Columnas: Es el elemento fundamental de un cromatógrafo de líquidos, puesto que es en

ella donde tiene lugar la separación y por lo tanto debe seleccionarse una columna
adecuada para cada separación para obtener buenos resultados.

5. Detectores: es un dispositivo ubicado a la salida de la columna y para cuantificar la

cantidad de analito en la muestra analizada. Hay muchos tipos de detectores según el
analito a analizar y el objetivo del estudio.

Detectores de absorbancia.
Detectores de fluorescencia.
Detectores electroquímicos.
Detectores de dispersión de luz.
Detectores por espectrometría de masas.
Detectores de conductividad.
Detectores de UV visible.