AISLAMIENTO DE BACTERIAS

El aislamiento de un cultivo puro es el primer y necesario paso en la

identificación de un microorganismo. Hay una gran cantidad de pruebas que
permiten establecer a que especies pertenece un microorganismo. Estas
pruebas incluyen una determinación bioquímica complicada. En la identificación
de microorganismos que se encuentran en los de depósitos de minerales,
pruebas más simples pueden ser empleados desde que la diversidad de estos
microorganismos es limitado. Estas pruebas consisten en la determinación de la
fuente de energía, pH óptimo, temperatura, signos morfológicos, etc. En el
procedimiento de identificación el microorganismo aislado debe ser chequeado
en contraste con cultivos típicos.

En la identificación del crecimiento de microorganismo sobre azufre elemental

debe tomarse en cuenta que el T. Ferrooxidants puede también crecer en el
medio, por consiguiente es necesario hacer inóculos en medios con Fe para
chequear la capacidad de los microorganismos para oxidar fierro.

En cuanto concierne al medio con azufre, la bacteria ThionineMyxothrophic

puede también desarrollar en él, por consiguiente el crecimiento de un cultivo
puro debe ser chequeado en azucares, aminoácidos, sales. El medio Beijerinck
es el menos electivo, el grupo completo de bacterias Thionine pueden crecer en
él, para su identificación es también esencial hacer inoculaciones en medios con
sustancias orgánicas y determinar la concentración óptima de extracto de
levadura y otras sustancias orgánicas. Generalmente, en el aislamiento de un
microorganismo conocido es suficiente emplear pruebas de identificación
simples mientras que la identificación y descripción de un nuevo microorganismo
requiere de pruebas más complicadas incluyendo identificaciones bioquímicas
bosquejados en manuales especiales.

Medios de cultivo para el crecimiento de bacterias

Para cada bacteria a ser cultivada para cualquier propósito es necesario proveer
el ambiente bioquímico y biofísico apropiado. El ambiente bioquímico
(nutricional) se hace disponible como medio de cultivo, y dependiendo de las
necesidades especiales de cada bacteria particular se ha desarrollado una gran
variedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propósitos y utilizaciones.
Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de
cultivos puros de bacterias y también son utilizados para la identificación de
bacterias de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas.

El modo en que las bacterias son cultivadas, y el propósito de los medios de

cultivo, varían ampliamente. Los medios líquidos son utilizados para el
crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios sólidos son
ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimación
de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propósitos. El agar,
agente gélido más utilizado para medios sólidos o semisólidos, es un
hidrocoloide derivado de las algas rojas. El agar es utilizado por sus
propiedades físicas únicas (se funde a 100 grados y permanece líquido hasta
enfriarse a 40 grados, la temperatura a la que se vuelve gel ) y porque no puede ser
metabolizado por la mayoría de las bacterias. Por lo tanto, como un componente
del medio es relativamente inerte, simplemente mantiene (geliza) los nutrientes
que se encuentran en la solución acuosa.

Los medios de cultivo pueden ser clasificados en varias categorías dependiendo

de su composición o uso. Un medio químicamente definido (sintético) (Tabla
4ª y 4b) es un medio en el que se conoce la exacta composición química.

Un medio complejo (indefinido) (Tabla 5ª y 5b) es un medio en el que no se

conoce la composición química exacta. Los medios definidos están
habitualmente compuestos por bioquímicos puros sacados del stock; los medios
complejos habitualmente contienen materiales complejos de origen biológico
tales como la sangre, la leche, el extracto de levadura o el extracto de carne,
cuya composición química exacta es obviamente indeterminada.

Un medio medio mínimo definido (Tabla 4ª) si provee sólo los nutrientes
exactos (incluyendo algunos factores de crecimiento) necesarios para el
crecimiento del organismo. La utilización de medios mínimos definidos requiere
que el investigador conozca los requerimientos nutricionales exactos de los
organismos en cuestión. Los medios definidos químicamente son de valor para
el estudio de los requerimientos nutricionales mínimos de los microorganismos,
para cultivos enriquecidos, y para una amplia variedad de estudios fisiológicos.
Los medios complejos habitualmente proveen la gama completa de factores de
crecimiento que pueden ser requeridos por un organismo por lo que pueden ser
utilizados más prácticamente para cultivar bacterias desconocidas o bacterias
cuyos requerimientos nutricionales son complejos (por ejemplo, organismos que
requieren muchos factores de crecimiento).

Un medio selectivo es aquel que tiene agregados componentes que inhibirán o

prevendrán el crecimiento de ciertos tipos o especies de bacterias y/o
promoverán el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede también
ajustar las condiciones físicas del medio de cultivo, como el pH y temperatura,
para hacerlo selectivo para organismos capaces de crecer bajo esas
condiciones.

Un medio diferencial si permite al investigador distinguir entre diferentes tipos

de bacterias basado en algún rasgo observable de su pauta de crecimiento en el
medio. Así, un medio selectivo, diferencial para el aislamiento de
Staphylococcusaureus, el patógeno bacteriano más común en los humanos,
contiene una concentración muy alta de sal (que el estafilococo tolerará) que
inhibe a la mayoría de las otras bacterias, mannitol como fuente de azúcar
fermentativo, y un tinte de indicador de pH. De los especimenes clínicos, sólo el
estafilococo crecerá. S. aureus es diferenciado de S. epidermidis (un
componente no patógeno de la flora normal) por su capacidad de fermentar el
mannitol. Las colonias fermentadoras de mannitol (S. aureus) producen ácidos
que reaccionan con el tinte indicador formando un halo coloreado alrededor de
las colonias; las no fermentadoras del mannitol (S. epidermidis) utilizan otros
sustratos no fermentadores en el medio para el crecimiento y no forman un halo
alrededor de sus colonias.

Un medio enriquecido (Tabla 5a y 5b) contiene algunos componentes que

permiten el crecimiento de tipos o especies específicas de bacterias,
habitualmente porque ellas solas pueden utilizar el componente de su ambiente.
Sin embargo, un medio enriquecido puede tener características selectivas. Un
medio enriquecido para bacterias no simbióticas fijadoras de nitrógeno omite la
fuente de nitrógeno agregado al medio. El medio es inoculado con una fuente
potencial de esta bacteria (por ejemplo, una muestra de suelo) e incubado en la
atmósfera en donde la única fuente de nitrógeno disponible es es N 2. Un medio
selectivo enriquecido (Tabla 5b) para el crecimiento de la halofílica extrema
(Halococcus) contiene cerca de un 25% de sal [NaCl], que es requerido por la
halofílica extrema y que inhibe el crecimiento de otros procariotes.

Tabla 4a. Medio mínimo para el crecimiento de Bacillus megaterium. Un ejemplo

de medio químicamente definido para el crecimiento de bacterias heterotróficas.

Componente Cantidad Función del componente

sucrose 10.0 g C y fuente de energía
K2HPO4 2.5 g buffer pH; fuente de P y K
KH2PO4 2.5 g buffer pH; fuente de P y K
(NH4)2HPO4 1.0 g buffer pH; fuente de N y P
MgSO4 7H2O 0.20 g fuente de S y Mg++
FeSO4 7H2O 0.01 g fuente de Fe++
MnSO4 H2O 0.007 g fuente de Mn++
agua 985 ml
pH 7.0

Tabla 4b. Medio definido (también medio enriquecido) para el crecimiento de

Thiobacillus thiooxidans, una bacteria litoautotrófica.

Componente Cantidad Función del componente

NH4Cl 0.52 g fuente de N
KH2PO4 0.28 g fuente de P y K
MgSO4 7H2O 0.25 g fuente de S y Mg++
CaCl2 2H2O 0.07 g fuente de Ca++
Azufre elemental 1.56 g fuente de energía
C02 5%* fuente de C
agua 1000 ml
pH 3.0
* Aerear el medio en forma intermitente con aire conteniendo 5% de CO 2.

Tabla 5a. Medio complejo para el crecimiento de bacterias fastidiosas.

Componente Cantidad Función del componente

Fuente de vitaminas y otros factores
Extracto de carne 1.5 g
de crecimiento
Fuente de vitaminas y otros factores
Extracto de levadura 3.0 g
de crecimiento
Peptona 6.0 g Fuente de aminoácidos, N, S, y P
Glucosa 1.0 g C y fuente de energía
Agar 15.0 g Agente inerte solidificante
agua 1000 ml
pH 6.6

Tabla 5b. Medio selectivo enriquecido para el crecimiento de halofílicas extremas.

 Componente Cantidad Función del componente
Acidos Casamino 7.5 g Fuente de aminoácidos, N, S y P
Extracto de
10.0 g Fuente de factores de crecimiento
levadura
Citrato trisódico 3.0 g C y fuente de energía
KCl 2.0 g fuente de K+
MgSO4 7 H2O 20.0 g fuente S y Mg++
FeCl2 0.023 g fuente Fe++
fuente de Na+ para halofílicas e
NaCl 250 g
inhibidor para no halofílicas
agua 1000 ml
pH 7.4

2.1.PROCEDIMIENTOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS

El enriquecimiento de cultivo se lleva a cabo de una manera efectiva en el laboratorio,

todos los microorganismos incluyendo los thermofílicos puede sobrevivir durante un
tiempo en nuestras originales a temperatura ambiente.
Para la obtención de cultivos a partir de minerales y soluciones, pueden hacerse uso del
medio nutriente 9k con fierro ferroso, el cual sirve como substrato generador de energía
(para el T. Ferroxidans y Leptospirillun ferrooxidans) o el mismo medio con azufre en
lugar de fierro (para el T. Acidophillus) o con cualquiera o con cualquier otro sulfuro
(para el sulfobacillus Thermosulfidooxidans ).

La composición del medio 9k ( Silverman, lundgren ) se da a continuación:

1ra. Solución 2da. Solución

(NH4 )2 SO4 3.0 g FeSO4 . 7H20 44.2 g
KC1 0.1 g H2SO4 1 ml de soluc.1.0 N
K2HPO4 0.5 =
MgSO4 + 7H20 0.5 =
Ca (N03) 2 0.1 =
Disolver en 700 ml de agua destilada Disolver en 300 ml de agua destilada

Las soluciones son esterilizadas separadamente, la primera solución a 1 atm. y la segunda

a 0.5 atm. Antes de usar, ambas soluciones se mezclan para tener el pH deseable de 2.5-
2.7.
En lugar de sulfato ferroso se puede usar sal de Mohr: FeS04.(NH4)2S04.6H20, el cual es
adicionado a la segunda solución en una cantidad de 63 g. en este caso la concentración
final de fierro en el medio también alcanza a 9 g/1.
Los cultivos del Tiobacillus ferroxidans y Leptospirillun Ferroxidans se llevan a cabo
a una temperatura de 28ºC bajo condiciones aeróbicas. El crecimiento de estos
microorganismos se evalúa por la aparición de un color marrón en el medio, debido a la
formación de fierro férrico. Para propósitos de comparación un frasco o un tubo de
prueba se deja sin inocular para servir como control (blanco). Los contenidos de fierro
ferroso y férrico se determinan químicamente.
En casos, donde un sulfuro es usado como un substrato, se adiciona al medio una
cantidad de 3 a 5 g / 100 ml. de agua.
Es esencial determinar la cantidad de sulfatos y iones de metales que han entrado en
solución. En casos donde el azufre es usado como substrato en medio 9K, 1-2 g.de
azufre estéril se agrega para 100 ml. de medio. La incubación de la bacteria sobre el
medio se evalúa por la aparición de turbidez y una marcada disminución del pH.
Para aislar los microorganismos oxidantes de compuestos reducidos de azufre a altos
pH’s, se hace del medio Beijerinck. La composición se da a continuación:
Na2S2O3.5H2O 5.0 g
NaHCO3 1.0 =
NH4C1 0.1 =
Na2HPO4.12H20 0.2=
MgC12.6H2O 0.1 =
PeSO4.7H2O Trazas
Agua 1,000 ml
pH 9.0 – 9.2

Para preparar un medio sólido, se utiliza 20 g/1 de agar. Es mejor esterilizar thiosulfato y
bicarbonato de sodio separadamente a 0.5 atm. En una pequeña cantidad de agua y
adicionarlos a la solución básica.
La evaluación del crecimiento de estas bacterias se hace por la aparición en la superficie
del medio o una especie de arena sobre las paredes del tubo de prueba debido a la
precipitación de azufre elemental. La oxidación del Thiosulfato se determina por
titulación. La turbidez del medio es generalmente causado por la bacteria heterotrófica
oxidante de Tiosulfato a Tetrationato. Sobre medio sólido las bacterias Thionic forman
colonias no transparentes de un color amarillento o blanco.
La bacteria comienza a desarrollarse en 3 a 5 días después de su propagación.
Los cultivos enriquecidos obtenidos son sometidos a un análisis microscópico. Un
aparato de contraste de fase con inmersión se emplea en microscopia. Mediante esta
técnica es posible obtener información de la composición de las especies. Todas las
bacterias Thionic son de forma bacilar, el leptospirillum puede ser distinguido por un
espiral de la célula. El sulfolobus se caracteriza por su forma redondeada. La
disponibilidad de esporas es también útil en la determinación de la composición de
especies permitiendo distinguir a los Sulfobacillos.

2.2 MEDIOS DE CULTIVOS PUROS

Para obtener cultivos puros se hace uso de cultivos enriquecidos estables que pueden ser
obtenidos realizando varias transferencias de un cultivo inicial a partir de nuestras
originales. Desde que el agar contiene sustancias inhibitorias para la incubación del T.
Ferroxidans, esta bacteria crece pobremente sobre medios agarosos.

Na2S2O3.5H2O 5.0 g
NH4C1 0.1 =
CaC12.6H2O 0.25 =
MgC12.6H2O 0.1 =
KH2 PO4 3.0 =
Leached-Out Agar o Difco Agar 20.0 =
Difco Agar
Agua destilada 100 ml
pH 5.0

Las colonias se forman en 5 a 10 días y son resembradas en medio líquidoWaskman con

azufre. Verificación de la pureza del cultivo se realiza por inoculación sobre los mismos
medios mencionados en el caso del T. Ferroxidans.

(NH4)2 SO4 0.2g

KH2PO4 3.0=
MgSO4.7H2O 0.5=
CaC12.6H20 0.25 =
FeSO4.7H20 Trazas
Sº 10.0 g
Agua destilada 100 ml

La reacción del medio se lleva hasta pH 4.0

El azufre se introduce en un medio estéril, primero se esteriliza separadamente con
alcohol. Este azufre final se pone en un frasco estéril con agua y el frasco se sella con un
tapón y por un espacio de 2 horas se mantiene en un termostato o un secador a 50-60ºC.
es mejor adicionar el azufre estéril al medio esterilizado separadamente en cada frasco o
tubo de prueba. El medio con azufre puede también ser esterilizado por una corriente de
vapor durante 3 días. Un cultivo puro se mantiene en este medio, las transferencias se
hacen una vez cada 3 o 4 semanas.

Para los microorganismos citados anteriormente, hay un número de bacterias Thionine

que facilitan la oxidación de compuestos de azufre.

El T. Dinitrificans es la única bacteria Thioninecapaz de crecer bajo condiciones

anaeróbicas a costa del oxígeno de nitratos. Se cultiva sobre medio Baalsrud con
Tiosulfato. Este microorganismo es capaz de oxidar ciertos sulfuros tales como galenita,
antimonita pero solamente bajo condiciones aeróbicas. El T.Intermedius, T.
Perometabolis y el T. Organoparus se incuban en un medio con tiosulfato y extracto de
levadura y el T. Acidophilus es capaz de crecer en medio acido con azufre elemental y
también se desarrolla heterotróficamente utilizando ciertos aminoácidos de azúcar y
sales.

Es mejor emplear geles plásticos impregnado con medio 9k para obtener colonias de T.
Ferrooxidans. Colonias muy pequeñas de color marrón rojizo aparecen sobre el gel
plástico en 8 a 12 días. Algunas colonias son tomadas en fiolas o tubos de pruebacon una
pequeña cantidad del medio. Después aparece un color marrón por la formación del
fierro férrico, se hacen transferencias en frascos con medio 9k y sobre un medio con
diferentes sustancias orgánicas para chequear la pureza del cultivo.

Un cultivo puro de TFerrooxidans se puede también aislar por el método de dilución. Un

cultivo enriquecido se diluye 1y 10 millones de veces tomando 1 al de un tubo de prueba
a otro cada vez. Consecuentemente uno puede esperar que en 6 a 9 diluciones solamente
células solas de T. Ferrooxidansocurran mientras otras especies disponibles en el cultivo
en cantidades más pequeñas solamente en 1 a 5 diluciones.

En laboratorio el T. Ferrooxidans se mantiene en estudio 9k, después que la bacteria ha

incubado, los frascos son colocados en una refrigeradora a 4º -6ºC. Para conservar al
cultivo es necesario hacer transferencias sobre un medio fresco una vez al mes.
El aislamiento de un cultivo puro de T. Thioxidans se lleva a cabo la inoculación de un
cultivo enriquecido en el medio sólido Waksman conteniendo:

Extracto de levadura 0.1%

Azufre 10 g/1
Temperatura de cultivo 70ºc

El microorganismo que está cercano al sulfolobus acidocaldarios llamado

sulfolobusbrieerley y que es capaz de oxidar azufre, fierro y minerales sulfurados
incluyendo la molibdenita, es aislado y cultivado sobre medio Brierley conteniendo.
(NH4) 2 SO4 0.5 g
NaC1 0.3=
KH2 PO4 0.1=
Ca (NO3)2º 4H 2O 0.01=
MgSO4 7H2O 0.01=
Difcoyeastextract 0.02% por 1000 ml de agua destilada.

Mezcla de microelementos según Appleby 0.5 ml.

FeC13.6H2O 3.6 g/1
H3BO3 0.57 º
ZnSO4.7H2O 0.44=
 CoC12.6H2O 0.02 =
CuSO4.5H2O 0.02=
MnC12.4H2O 0.02=
Na2 MoO4.2H2O 0.05=

El azufre o fierro es la fuente de energía. “flores de azufre” o azufre coloidal se esteriliza

haciendo pasar una corriente de vapor 3 veces durante 30 minutos. Luego, 0.25 g de
sustancia esterilizada se adiciona por cada 50 ml. de medio básico.
Para preparar una solución de fierro, 25 g. de FeS04.7H20 se diluye en 95 ml de agua
destilada, al cual se adiciona 5 ml de H204 1N. la esterilización se lleva a cabo en
autoclave 0.2 ml de esta solución se agrega a 50 ml de soluciónbásica de sal, la
temperatura de incubación es 35ºC-75 ºC , el óptimo es de 60 ºC, el Ph del medio con
azufre es 3.0. las inoculaciones deberán efectuarse cada 3 semanas. El
sulfobacillusthermosulfidooxidans se puede también cultivar en medio Brierley con
azufre, hierro o sulfuros, en este caso la temperatura optima es de 50 ºC- 60 ºC.

2.3. AISLAMIENTO DE UN CULTIVO PURO

El primer y necesario paso en la identificación es establecer a que especies pertenece un
microorganismo. Estas pruebas incluyen una determinación bioquímica complicada. En
la identificación de microorganismos que se encuentran en los depósitos de minerales.
Pruebas más simples pueden ser empleados desde que la diversidad de estos
microorganismos es limitado. Estas pruebas consisten en la determinación de:
La fuente de energía,
El pH optimo,
La temperatura,
Los signos morfológicos, etc.

2.4.CULTIVO CONTINUO DE BACTERIAS

Con el propósito de disponer de volúmenes suficientes de cultivos en forma continua,
para la inoculación de columnas y pilas, se desarrolla el sistema de cultivo continuo.
 Fig. 1.-Sistema de Cultivo continúo

El sistema básicamente consiste en un reactor, en el cual se puede disponer

constantemente de cultivos de bacterias para inoculación o preparación de concentrados
de bacterias. La disposición del equipo y secuencia de operaciones se muestra en la Fig.
1. un aspecto importante que debe tenerse en cuenta en el sistema de cultivo continuo, es
la uniformidad del pH a través de todo el circuito, de tal manera que la pulpa preparada
tenga el mismo pH de la pulpa del reactor para evitar problemas de inhibición por un
shock por medio de pH.
Las etapas de crecimiento de las bacterias en un determinado cultivo estánrepresentadas
en forma genérica en la Fig. 2.

Fig. 2.-Etapa de crecimiento de las bacterias en función del tiempo.

Como puede observarse, inicialmente las bacterias pesan por un periodo de adaptación,
luego del cual su reproducción es logarítmica. Su alta velocidad de reproducción y las
condiciones del medio llegan a limitar las características de su hábitat de tal manera que
en algún momento su reproducción se detiene y se mantiene estacionaria, hasta que los
subproductos de su propia actividad envenenan su ambiente provocando su inhibición y
posterior muerte, siendo el momento adecuado de efectuar la transferencia de un cultivo
a otro, precisamente en la fase de crecimiento logarítmico.