Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional De Ciencias Biológicas

Prolongación Manuel Carpio y Plan de Ayala s/n, Miguel Hidalgo, Santo Tomás, 11350 Ciudad de México, CDMX.

Precipitación, Separación y Punto Isoeléctrico de Proteínas

Objetivos:
- Analizar el efecto que produce la 3.- Precipitación por metales pesados
modificación de factores
fisicoquímicas sobre la solubilidad de Tabla 3.- Precipitación de proteínas
las proteínas. por metales pesados
- Determinar el punto isoeléctrico de la
insulina, basándose en sus
propiedades de solubilidad a
diferentes valores de pH.

Resultados:

1.- Separación de proteínas por

precipitación con sales (Salting out).
Tabla1. Resultados de prueba Salting out en
proteína. 4.- Determinación del punto
isoeléctrico de la insulina
Biuret Interpretación
Filtrado 1 + Presencia de proteínas Tubo Ácido Acetato Insulina pH Observaciones
Precipitado 1 + Presencia de proteínas No. acético de 40 U/ml
0.2M sodio
Filtrado 2 - Ausencia de proteínas (ml) 0.2M(ml)
Precipitado 2 + Presencia de proteínas
1 0.23 0.02 6U 3.67 Ausencia de
precipitado
2 0.15 0.10 6U 4.56 Ausencia de
2.- Precipitación por efecto del pH y de precipitado
solventes. 3 0.05 0.20 6U 5.34 Formación del
precipitado

1 2 3
HCl 0.1 N (ml) NaOH 0.1 N Regulador de
(ml) acetatos 0.1M,
pH 4.7 (ml)
Clara de huevo 3.0 3.0 3.0
filtrada, dil. 1:3
(ml)
La proteína se La proteína La proteína se
precipito se solubiliza, precipito
ligeramente, se observa ligeramente,
haciendo un totalmente haciendo un
poco turbia la transparente poco turbia la
solución, además . solución, en el
presentaba una fondo del tubo
viscosidad. una pequeña
acumulación de
precipitado.
Etanol 96° (ml) 3.0 3.0 3.0

Observaciones Se forma un La proteína Se forma un

precipitado color se solubilizó precipitado de la
blanco en el proteína color
tubo, además se blanco en la
hizo un poco más mayor parte del
viscoso tubo.
 4 0.01 0.24 6U 6.12 Ausencia tienede la finalidad de poner en evidencia la
precipitado
5 0.00 0.25 6U 9.03 Ausencia presencia
de de proteínas. Nuestro
precipitadoresultado es positivo; al añadir el NaOH
al 40 % estamos proporcionando el
medio básico que requiere la reacción,
Discusión tomemos en cuenta que el OH- no
interviene. Una vez añadido el CuSO4, el
1. Separación de proteínas por Cu2+ forma un complejo por la interacción
precipitación con sales con los grupos –NH del péptido, dando la
coloración violeta que se observa.

Por otro lado al resto del filtrado 1 se

añadió hasta saturación sulfato de
amonio, donde a concentraciones altas
de sal, están solvatados tantos iones
que se reduce la actividad del solvente
aún más. Por tanto, las interacciones
entre solutos se vuelven más fuertes que
las que se producen entre solutos y
solvente, lo que genera la separación
Filtrado 1. – Izquierda (positivo)
total de la proteína. Por ello la prueba de
Precipitado 1.- Derecha (positivo)
Biuret aplicada al filtrado 2 es negativa,
presentando una coloración azul, lo que
indica que no había más proteína o que
no hubo grupos mayores de 3 enlaces
peptídicos necesarios para formas el
complejo; por otro lado, esta prueba
aplicada al precipitado 2 es positiva,
dando una coloración violeta, que indica
positivo a presencia de proteína.

2.- Precipitación por efecto de pH y

solvente.
Filtrado 2.
Precipitado
Negativo Efecto de pH
2.Positivo

Se reduce la solubilidad de la proteína al

añadir el sulfato de amonio, debido a que
la presencia de la sal en la dilución
genera una competencia por las
moléculas de solvatación entre lo iones
salinos agregados y la proteína disuelta.
La proteína tiene en su superficie
distintas cargas que quedan expuestas
cuando ésta rompe su interacción En los tubos 1 y 3 que contenían HCl y
hidrolítica con las moléculas polares del regulador de acetatos (pH 4.7)
agua, por ello comienza la interacción respectivamente se observa la
entre los grupos cargados de proteína. precipitación de proteínas y baja
solubilidad ya que el pH de estas
Esto es evidente al realizar la prueba de sustancias se encuentra cercano al punto
Biuret en el filtrado y precipitado 1, que isoeléctrico de una de las proteínas
predominantes en la clara de huevo: la
ovoalbúmina, con un pI de 4.9.
En el tubo 2 que contenía NaOH, la clara
de huevo se solubilizó debido a que las
proteínas se encontraban en un pH
básico, alejado del punto isoeléctrico,
donde las moléculas tienen carga neta
negativa y son capaces de moverse en el
campo eléctrico.
Efecto de pH y solvente
Al agregar un solvente orgánico como el
etanol, disminuye la constante dieléctrica
de la solución acuosa de proteínas y
aumenta la interacción proteína-proteína
favoreciendo la precipitación de éstas.
Dicho hecho se observa en el tubo 1 y 3.
En el tubo 2 no se observa precipitado ya
que las proteínas se encontraban
solubilizadas y la cantidad de etanol
agregada no fue la suficiente para
disminuir la constante dieléctrica y
acercar las moléculas de proteínas.
3.- Precipitación por metales pesados
Los metales pesados son iones positivos
que tienden a precipitar las proteínas, lo
hacen a un pH superior al isoeléctrico de
cada proteína, porque a este pH la
proteína esta disociada como proteína
negativa, lo que ocurre a un pH básico
ocasionado por añadir sal, por lo tanto,
las proteínas con carga neta negativa
interaccionan con el ion metálico positivo
para dar un precipitado insoluble de
proteinato metálico. Este precipitado fue
observado en la prueba que contenía Pb,
Ag y Hg. Con Ba se un observó un ligero
precipitado en la parte inferior del tubo.
Mientras que aquellas pruebas con Na y
agua sólo lograron solubilizar la proteína.
4.- Determinación del punto isoeléctrico
de la insulina
En el tubo 3 se observó la formación de
un precipitado a un pH de 5.3, por lo que
podemos decir que este es el punto
isoeléctrico de la insulina, pues a este pH
la carga neta de esta proteína es igual a
cero y sus moléculas pueden formar
agregados que precipitan.
En el resto de los tubos no hay presencia
de precipitado porque la proteína se
encuentra pura.
Conclusión
- Las proteínas pueden precipitar o
solubilizarse dependiendo de la
carga que tengan sus moléculas,
 la constante dieléctrica del medio
y el pH del mismo.
- El punto isoeléctrico de la insulina
fue de 5.34.

Bibliografía

Libros electrónicos:

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