INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLOGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE
ANÁLISIS

Carrera: Químico Bacteriólogo y Parasitólogo.

Profesores:

Práctica: Efecto de pH y la concentración en la intensidad de

fluorescencia de riboflavina.
Objetivos:
 Determinar el efecto del pH sobre el disolvente.
 Elegir el mejor disolvente para la riboflavina.
Fundamento:
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de
espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Es un proceso de
emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las
especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de
fotones. una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad
inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor que las de la
espectroscopía de absorción. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que
los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que se
pueden hacer fluorescer. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita
los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía,
generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la
espectrometría de absorción.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.
Su fundamento es la fluorescencia que es la emisión de radiación por electrones excitados. En el
fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación electromagnética y debido a ello los
electrones pasan de un estado basal a otra fase de excitación.
La Vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble. Bajo esta denominación, o la genérica de "riboflavina"
se agrupan la riboflavina propiamente dicha y las coenzimas derivados suyos, cuya estructura está
formada por el ribitol (un polialcohol de 5 átomos de carbono) y la 7,8-dimetilisoaloxazina.

En forma sólida, la riboflavina es de color amarillo anaranjado intenso. En solución acuosa, tienen una
fluorescencia amarillo-verdosa muy intensa. En solución alcalina, es soluble con facilidad, pero es
bastante inestable al calor, y a la luz forma lumifavina, un producto de degradación fluorescente que
carece de actividad biológica. Las soluciones de riboflavina tienen una fluorescencia amarillo verde
característica, con una absorción máxima en 565nm en el rango de pH ácido.
Resultados:

Tabla 1. Resultados de Curva de Calibración de riboflavina en diferentes medios

Intensidad de Emisión
Riboflavina (ppm)
Agua HCl 0.1M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M

0 4.88 4.85 4.87 4.88

1 5.86 5.01 5.68 4.88
2 6.75 5.14 6.41 4.90
3 7.54 5.28 7.03 4.91
4 8.36 5.34 7.59 4.92
5 9.03 5.51 8.25 4.92
10 12.63 5.98 10.64 4.96
50 17.98 6.91 14.90 4.80
pH 5 1 3 13

10 Chart Title
9

7
Intensidad de Emisión.

0
0 1 2 3 4 5 6
Concentración (ppm)
H2O HCl CH3COOH NaOH

Gráfica 1. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la
concentración de 0 a 5 ppm.
 25

20
Intensidad de Emisión. (RFU)

15

10

0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración (ppm)

H2O HCl CH3COOH NaOH

Gráfica 2. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la
concentración de 0 a 50 ppm.

Preguntas adicionales:
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión?:

Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un

espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de
máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

2. Diga cuáles son las formas enzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en el metabolismo
molecular:

Dinucleótido de flavina y adenina (FAD), coenzima que transfiere átomos de hidrógeno;

interviene en las oxidorreducciones, para la producción de energía.
Flavina Mononucleótido (FMN): Requerida en reacciones de óxido-reducción catalizadas por
las deshidrogenasas ligadas a la flavina.
 3. 3 formas resonantes de riboflavina en pH ácido, neutro y alcalino:

4. 3 diferencias entre fluorescencia y fosforescencia:

Lo que las hace diferentes:

La capacidad de almacenar la energía es la principal diferencia entre ambos fenómenos.
La fluorescencia absorbe la energía de la luz ultravioleta e, inmediatamente, emite la radiación
luminosa. Así funcionan, por ejemplo, las lámparas fluorescentes. La descarga eléctrica al
encenderla hace que el mercurio que hay en el interior de estos focos emita una luz ultravioleta,
pero hay una capa de fósforo que absorbe esa luz y la reemite en una longitud de onda que sí
podemos ver y que nos ilumina la habitación.

En el caso de la fosforescencia, comienza igual, absorbiendo la radiación ultravioleta, pero

almacena la energía, retardando la posterior emisión, siendo capaces de emitir esa radiación
luminosa poco a poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente de radiación
excitadora inicial. Los ejemplos más conocidos de este efecto son el de las agujas de los relojes
que brillan en la oscuridad, o esas pegatinas de estrellas y planetas que poníamos en el techo de
nuestras habitaciones para cuando, al apagar la luz, pareciera que teníamos el cielo en nuestro
techo. También utilizada esta tecnología para, como vemos en la foto, mostrar los carteles de
‘Salida’ (‘Exit‘) o de extintores tras un apagón en un edificio.

Discusión:
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de
radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su
exceso de energía en forma de fotones. Hay factores que afectan este proceso:
-Efecto del pH:
La riboflavina, en estado neutro de pH (6 y 7) va a tener estructuras resonantes, las cuales le van a
conferir fluorescencia, y cuando hay mayor resonancia va a haber mayor fluorescencia.
Al estar en medio ácido la resonancia va a disminuir, pues al protonarse los grupos amino de la
estructura, ya no se tendrá la deslocalización de electrones, y a pH de 3 se protona un poco, mientras
que a pH de 1 se protonará totalmente, causando que la resonancia disminuya y la fluorescencia sea
muy baja.
Al estar en medio alcalino a pH de 13 no se protona la estructura, sino que se va a desprotonar, esto
afectará la resonancia, provocando que no presente fluorescencia. La riboflavina es inestable a pH
alcalinos, por eso se disolvió tan rápido en medios alcalinos, como lo pudimos ver en la práctica con
el Hidróxido de sodio, es por eso no fluoreció.
Esto lo podemos ver reflejado en la gráfica 1, con los cambios de pH´s de las soluciones.
Algo que podemos hacer antes de realizar un experimento con fluorescencia, es revisar el pH
adecuado con el que vamos a trabajar, para que la estructura con mayor resonancia sea la que
obtengamos para que la fluorescencia sea mayor. Esto se realiza teniendo una proporcionalidad entre
la emisión y la concentración.
-Efecto de la concentración:
A diferentes concentraciones va a ir aumentando la fluorescencia, pero no proporcionalmente (como
podemos observar en la tabla 1), pues esperaríamos el doble con cada concentración. Al no
mantenerse la proporcionalidad, va a bajar la fluorescencia en altas concentraciones, esto en un
método fluorométrico (observar gráfica 2). Este efecto se puede dar por dos fenómenos: El fenómeno
de autoabsorción, pues la cantidad de tantas moléculas de la muestra, al emitir, otra molécula
absorberá esa energía emitida. O también pudo haberse dado por el fenómeno de interconversión, la
interna (choques entre moléculas, pasa energía de una a otra) y externa (hay choques en el medio en
el que está disuelto el analito, chocan las moléculas), pues se liberará energía en forma de calor, lo
que va a causar que la fluorescencia disminuya.
Si estuviera en un método espectrofotométrico no lo podríamos detectar, pues la concentración es
muy baja.
Conclusión:
 Aprendimos a manejar el fluorómetro de filtros.
 El pH alcalino y muy ácido, disminuye la intensidad de fluorescencia.
 La proporcionalidad de la concentración de riboflavina y la intensidad de fluorescencia es
importante para que nuestro analito tenga alta intensidad de fluorescencia.
Referencia bibliográfica:
Espectroscopia de fluorescencia molecular. [En Línea] [Disponible en:
http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111d-
archivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF]
Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia. Universidad de Alicante. [En Línea] [Disponible en:
http://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-
optica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-5.pdf]
Douglas A. Skoog, F. James Holler, Timothy A. Nieman, Principios de análisis instrumental, McGraw-
Hill, 2000, 1028 pages, consultado el 15 de marzo de 2018.
Salvador Badui Dergal, Química de los alimentos, Alhambra Mexicana, Editorial, S.A. de C.V., 1993,
648 pages, consultado el 15 de marzo de 2018.