La importancia de la densidad del epítopo en la selección de un control de

IHC positivo sensible

Resumen
Los laboratorios de inmunohistoquímica clínica (IHC) se enfrentan a desafíos únicos para la
realización de inmunotinciones precisas y reproducibles. Entre estos desafíos está el uso de
controles caseros derivados de muestras de descarte patológico. Dichos controles positivos tienen
un número desconocido de moléculas de analito por célula (densidad de epítopo). No está claro
cómo la falta de concentraciones definidas de analito afecta el rendimiento del control. Para
abordar esta cuestión, preparamos controles IHC positivos (IHControls) para el receptor del factor
de crecimiento epidérmico humano tipo II (HER-2), receptor de estrógeno (ER) o receptor de
progesterona (PR) con concentraciones de analito bien definidas, homogéneas y reproducibles .
Usando IHControls, examinamos el efecto de la concentración de analito en la sensibilidad de
control de IHC. IHControls y los controles de tejido convencionales se evaluaron en una serie de
experimentos de degradación de reactivos de anticuerpos primarios simulados. Los datos
demuestran que la capacidad de un control IHC positivo para revelar la degradación del reactivo
depende de (1) la concentración de analito en el control y (2) donde esa concentración recae en la
curva de respuesta analítica de la inmunotinción. Los controles IHC positivos más sensibles tienen
concentraciones de analito dentro o cerca del rango de respuesta dependiente de la concentración
del inmunosuero. Los controles positivos fuertemente teñidos que tienen concentraciones de
analito en la meseta de la curva de respuesta analítica son menos sensibles. Estos hallazgos
enfatizan la importancia de seleccionar controles de IHC positivos que son de intensidad de tinción
intermedia (en lugar de fuerte). (J Histochem Cytochem 65: 463-477, 2017)

Palabras clave
IHControl, inmunohistoquímica, péptido, control positivo

Introducción
El campo de la inmunohistoquímica clínica de diagnóstico (IHC) evoluciona desde una colección de
manchas inexacta y cualitativa a un conjunto cuantitativo de ensayos cuyos resultados
puede influir independientemente en el manejo del paciente.
Las revisiones publicadas, los requisitos reglamentarios y las pautas de consenso transmiten un
tema similar: los conceptos generales de validación de los ensayos y protocolos de control que son
un estándar de práctica en otras disciplinas de laboratorio clínico, como la Química Clínica,
generalmente son conceptos para practicar en el laboratorio clínico de IHC. .
Los protocolos de validación y control del ensayo que son sencillos cuando se trata de muestras de
sangre a veces no son sencillos cuando se aplican al tejido secciones, Por ejemplo, los protocolos
de validación de ensayo para un ensayo de suero generalmente implican verificar la calibración y la
linealidad. Estos parámetros no se miden fácilmente en cuanto a las tinciones
inmunohistoquímicas. Este artículo se centra en uno de los desafíos únicos asociados con IHC, la
selección de controles positivos de IHC.

La Ley de Mejora de Laboratorio Clínico de 1988 (CLIA 88, Sección §493.1202 (c)) exige que los
laboratorios clínicos que realizan pruebas moderadamente complejas ejecuten al menos dos
controles a diferentes concentraciones de analitos.
Por ejemplo, si una prueba de glucosa en suero tiene un rango analítico de medición (RAM) de 5 a
800 mg / dl, el laboratorio clínico ejecuta al menos dos controles, generalmente uno hacia el
extremo inferior de ese rango y otro hacia el extremo superior. Este concepto es difícil de aplicar a
IHC clínico, un campo donde los términos como "rango de medición analítico" aún no tienen
significado.

En general, se recomienda que los laboratorios clínicos IHC utilicen un control "bajo" y "alto".
Sin embargo, los términos bajo y alto son ambiguos porque, sin los calibradores, no existe una
correlación con las concentraciones reales de analito. Sin un estándar de calibración externo, los
resultados de las pruebas clínicas de IHC se expresan en términos de intensidad de color.
Actualmente no es posible cuantificar rutinariamente un resultado de prueba bajo o alto con
unidades de medida trazables a un estándar objetivo, como el número de moléculas por celda.
En consecuencia, surgen dificultades para estandarizar los resultados de las pruebas. En
particular, un "bajo" en un laboratorio puede ser "alto" en otro. Recientemente describimos la
observación
que las muestras que expresan aproximadamente 104 moléculas del receptor del factor de
crecimiento epidérmico humano tipo II (HER-2) por microperlas pueden ser fuertemente positivas
mediante una prueba comercial de HER-2 y completamente negativas por otra.
Esta discrepancia se debe a que las dos pruebas HER-2 comercializadas por la Administración de
Alimentos y Medicamentos (FDA) tienen diferentes curvas de respuesta analítica. Las diferencias
en la sensibilidad analítica entre las pruebas de IHC comercial aprobadas por la FDA se
sospechaban previamente en base a estudios de correlación10-16, pero nunca antes se habían
medido cuantitativamente.
Por ejemplo, dos controles separados "altos" pueden producir una tinción fuerte y aún tener
concentraciones de analito muy diferentes. Una vez que la concentración del analito está en la
meseta de la curva de respuesta del analito, la concentración del analito y la intensidad de la
tinción ya no se correlacionan entre sí.
En este estudio, abordamos la cuestión de cómo estas concentraciones de analitos no controlados
afectan la sensibilidad de los controles de IHC en la detección de la degradación primaria de
anticuerpos.
El propósito de un control de ensayo es detectar aberraciones en los reactivos, procedimientos o
condiciones que podrían afectar el resultado de la prueba. Idealmente, el control será sensible
incluso a aberraciones leves, permitiendo una intervención temprana antes de que los resultados
de la prueba del paciente se vean comprometidos.
Hasta donde sabemos, no hay datos publicados que describan la relación entre la concentración
de analito en un control positivo de IHC y la sensibilidad de ese control en la detección de
aberraciones de tinción de IHC.

Materiales y métodos

IHControls

Los IHControls han sido descritos previamente. 9,17,18 Brevemente, las microesferas del tamaño
de una célula sirven como una superficie sólida sobre la cual se anclan HER-2, receptor de
estrógeno (ER) o receptor de progesterona (PR). Los IHControls están compuestos por dos
microperlas diferentes: microesferas de vidrio recubiertas con analito (7-8 micras de diámetro) y
microperlas de colores estándar (4.5 micras de diámetro). Las microperlas recubiertas con analito
llevan epítopos peptídicos unidos covalentemente para HER-2, ER y / o PR. Entre todos los
diversos productos IHControls utilizados en este estudio, están representados los analitos
peptídicos para todas las principales pruebas clínicas de HER-2, ER y PR. Las microesferas se
suspenden en un líquido claro patentado que se endurece después de la aplicación en el
portaobjetos de vidrio, reteniendo así las microperlas en el portaobjetos de vidrio durante la
cocción, desparafinización, recuperación de antígenos y tinción de IHC. Una vez seco, la gota
puede tratarse como se trataría una muestra de tejido. Cada gota de microlitro seco en el
portaobjetos incorpora aproximadamente 5000 microperlas recubiertas con analito (prueba).

La suspensión de microperlas IHControls también incluye microperlas de colores más pequeños,

que son de color marrón oscuro permanentemente, independientemente del procedimiento de
tinción IHC. Estos han sido descritos previamente.17 Las microesferas de color estándar sirven
como una referencia de intensidad de color para estandarizar las mediciones de intensidad de
color mediante análisis de imágenes.
Los IHControls también incluyen un segundo tipo de microperlas de prueba que no es
inmunorreactivo con el anticuerpo en cuestión. Las microperlas antigénicamente irrelevantes sirven
como un control negativo interno no teñido (mostrado en la Fig. 2).
Las microperlas de prueba IHControls se fabrican en una serie de diferentes concentraciones de
analitos (péptidos) que difieren en aproximadamente un registro, de 106 / microperlas (la
concentración más alta) a 102 (la concentración más baja).
Las explicaciones detalladas de la cuantificación del analito con IHControls se han descrito
previamente.
Brevemente, cada uno de los analitos HER-2, ER o PR se sintetizan como péptidos con una sola
fluoresceína. Estos péptidos están conjugados químicamente con las microperlas.
Al determinar el número de moléculas de fluoresceína por perla, aprendemos la concentración de
analito.
Las concentraciones de analito en las microperlas son trazables a un estándar de fluorescencia de
microperlas ya existente llamado "moléculas de fluorocromo equivalente" (MEF).

Fotomicroscopía
Las imágenes se adquirieron como se describió previamente.9 En pocas palabras, utilizamos (1)
un microscopio Nikon Eclipse E400 equipado con una cámara a color con dispositivo de carga
refrigerada por enfriamiento (CCD) Spot Imaging Solutions, Modelo 2.3.0 (Diagnostic Instruments,
Inc. Sterling Heights, MI), o (2) un microscopio Zeiss Axioskop equipado con una cámara Spot
Imaging Solutions Insight Gigabit CCD (Diagnostic Instruments, Inc.). Para cualquier experimento,
la misma cámara se utilizó para fotomicroscopía.
Antes de la fotomicroscopía, la cámara tenía un balance blanco y se realizó una corrección de
campo plano.
Para la fotomicroscopía de campo claro de IHControls, la óptica del microscopio se configura por
primera vez para la iluminación de Köhler.

Los controles tisulares se fotografían con la iluminación de Köhler. Para IHControls, una vez que se
estableció la iluminación de Köhler, la abertura del condensador se abre ampliamente porque las
microperlas tienen un contraste más que suficiente. Con este ajuste, las microperlas de prueba no
teñidas son levemente visibles junto con las microperlas teñidas.
El software de la cámara se configuró en una gama de 1.0,
usando tiempos de exposición fotográficos manuales (fijos).
Descubrimos que exagerar un poco las imágenes mejoró la precisión de la cuantificación de las
microperlas al crear un fondo ligeramente más blanco.

Este aumento en el contraste de la imagen. El beneficio del fondo ligeramente más blanco es que
el paso de segmentación de imágenes en el programa MatLab se fija más rápidamente en las
microperlas relevantes para la cuantificación.
Evitar errores esporádicos ocasionales de segmentación de imágenes mejoró la precisión de la
medición de la intensidad de las manchas. Este ajuste no afecta el
lectura final porque la intensidad de la tinción se calcula en relación con un estándar óptico interno
(la microperlas de intensidad de color). No se usaron imágenes de diapositivas enteras. La
intensidad de color de cada diapositiva se midió promediando tres imágenes por punto
(diapositiva). Cada punto de datos en la sección "Resultados" representa la media ± desviación
estándar (SD) de las diapositivas por triplicado.

IHControls cuantificación o estadificacion de la intensidad de la tinción

Para promover la coherencia, mantuvimos los ajustes de fotomicroscopía constantes dentro de

cada experimento. Esto incluye los ajustes ópticos, como el condensador y las aperturas de
iluminación, y la configuración de la cámara, como el tiempo de exposición. Para la cuantificación
de la intensidad de la mancha IHControls, desarrollamos un algoritmo personalizado incrustado en
MatLab (MathWorks Corp, Natick, MA), como se describió previamente.17 El algoritmo mide la
intensidad de la imagen de las microesferas de prueba en relación con las llantas de microesferas
estándar de color. Por consiguiente,

La intensidad de la mancha de IHControls se expresa como una relación. Una puntuación de 1.0
significa que las microesferas de prueba, teñidas para HER-2, ER o PR, son igualmente intensas
en color (expresadas en la intensidad media del píxel) que las microperlas estándar de color. Un
puntaje ≥1 representa una fuerte intensidad de mancha.

Controles tisulares
Para ER y PR, se obtuvieron bloques de tejido archivados con formalina, embebidos en parafina
(FFPE) del Biorepositorio de Tejidos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio,
Tufts Medical Center, bajo un protocolo aprobado por el comité de revisión institucional (IRB). Para
los controles de tejido ER y PR, se usó endometrio uterino normal. Medimos solo las células
estromales, ya que expresan niveles más bajos de ER y PR que el epitelio glandular. Los controles
HER-2 estaban compuestos por dos carcinomas de mama diferentes, uno que expresaba HER-2 a
un nivel 3+ y otro que expresaba HER-2 a un nivel 1+.

Cuantificación de imagen ER / PR de secciones de tejido

La tinción de ER y PR (nuclear) se cuantificó usando un algoritmo personalizado en Image-Pro
Premier 9.2 (Media Cybernetics, Rockville, MD).
Para cuantificar la intensidad de la mancha ER y PR, primero se aplicó un algoritmo de
deconvolución del color a la imagen, utilizando un vector de color para el color marrón de la
diaminobenzidina (DAB). El vector de color formaba parte de una subrutina en el software Image-
Pro Premier. La intensidad del color de los píxeles de la imagen se trazó en un histograma, en una
escala de 0 a 255. En esta escala inicial, las intensidades de tinción más oscuras tenían números
más bajos.
Un número de canal de umbral se identificó manualmente en este histograma que incluía núcleos
inmunoteñidos pero no otros elementos no teñidos en la imagen. En otras palabras, segmentamos
los núcleos teñidos de otros elementos de imagen en virtud del grado de tinción marrón. La
segmentación apropiada de la imagen se verificó mediante inspección visual. Con una
inmunotinción muy débil o ausente, la determinación del umbral más apropiado con un número de
canal preciso era impreciso.

De todos modos, encontramos que esto no afectó materialmente los datos. Todos los ajustes del
umbral de segmentación de imágenes que parecían razonables para esas imágenes tenues
manchadas produjeron números similarmente bajos. Después de la segmentación de los núcleos
de imágenes, medimos la intensidad media de píxeles de esos píxeles. Luego restamos la
intensidad media de píxeles de 255, de modo que las intensidades de tinción más oscuras tendrán
números más altos y las intensidades de tinción débiles tendrán números más bajos. Encontramos
que esta escala es más intuitiva.

Entre paréntesis, inicialmente intentamos aplicar un algoritmo de imagen más sofisticado que
aprovechaba la contratinción de hematoxilina (para núcleos sin teñir). Inicialmente esperábamos
que la contratinción ayudaría a segmentar las imágenes, identificando los núcleos sin teñir.
Sin embargo, encontramos una variabilidad sustancial en la contratinción de diferentes fabricantes,
confundiendo el análisis. Por esta razón, adoptamos el algoritmo antes mencionado que no
incorporó la hematoxilina como un factor para la segmentación de imágenes. Se encontró que el
algoritmo de segmentación de imagen de un solo color (marrón) era confiable, al menos cuando se
usaba con el control de tejido ER / PR (endometrio uterino).
Antes de usar este algoritmo en estos experimentos, lo validamos contra el puntaje interpretativo
proporcionado por un panel de observadores,
usando una serie de diferentes imágenes de varias intensidades.
La prueba de validación se repitió en varios experimentos diferentes.
La precisión del algoritmo estrechamente alineada con el panel.
Cuando los puntajes de cuantificación de imagen se representaron gráficamente frente a las
puntuaciones de consenso del panel, hubo una fuerte correlación positiva con pendientes de 0,92 a
1,8.
Los coeficientes de correlación (R2) fueron> 0.90. Los datos de precisión en múltiples
experimentos arrojaron coeficientes de variación (CV) que van del 6% al 12%. Por estas razones,
creemos que el algoritmo de medición de la intensidad de las manchas nucleares ER / PR es
preciso y preciso.

HER-2 Cuantificación de imagen de las secciones de tejido

La intensidad de la tinción para HER-2 (secciones de tejido) se midió utilizando ImageJ (Institutos
Nacionales de Salud [NIH]; Bethesda, MD) con el plugin ImmunoMembrane.19 El programa está
disponible libremente. Anteriormente describimos detalles de su uso.17 El algoritmo incluye la
segmentación de color para distinguir el color marrón asociado con DAB del color azul asociado
con la tinción de contraste de hematoxilina. Usamos la puntuación de intensidad de la imagen del
programa, expresada en una escala relativa de 0 a 10.

Tinción inmunohistoquímica
La tinción de IHC se realizó utilizando tres inmunotincadores automáticos diferentes, en tres sitios
separados. Para inmunotinciones que usan anticuerpos HER-2, ER o PR suministrados por Dako
Corp./Agilent, se usó un Dako Autostainer (Dako Corporation; Carpinteria, CA). Estas
inmunotinciones incluyen HercepTest, PR 636, PR 1294 y ER 1D5 / 2-123. Los kits HER-2 y ER /
PR PharmDx (Dako / Agilent Technologies; Carpinteria, CA) se venden con soluciones y reactivos
prediluidos, y se tiñeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los portaobjetos se hornearon inicialmente a aproximadamente 57 ° C a 60 ° C durante 40 min, se
desparafinaron en xileno y luego se hidrataron en grados decrecientes de etanol. La recuperación
de antígenos se realizó utilizando las soluciones de recuperación de antígenos de Dako provistas
con los kits HER-2 o ER / PR. Para HER-2, la recuperación de antígeno se realizó en un baño de
agua de 97 ° C a 98 ° C durante 40 min, según las instrucciones del fabricante.
Para la recuperación de antígeno de ER / PR, los portaobjetos se procesaron durante 25 minutos
en una olla a presión de la Cámara médica de Biocare (Biocare Medical; Pacheco, CA). Para todos
los pasos posteriores, se siguieron los reactivos, tampones e instrucciones del fabricante.
El anticuerpo PR 636 se adquirió por separado de Dako y se acopló con el sistema de detección de
kit ER / PR PharmDx.

Para las inmunotinciones que usan anticuerpos suministrados por Leica Corp. (Leica Biosystems,
Buffalo Grove, IL), realizamos la prueba en un instrumento Bond III. Los portaobjetos se cocieron a
60 ° C a 62 ° C durante 20 a 30 min.
La desparafinación y la recuperación de antígenos se realizaron en el instrumento usando los
reactivos y protocolos del fabricante. Usamos el Leica ER 6F11, PR 16, y Anticuerpos HER-2 CB11
con los reactivos de detección del kit.
Para las inmunotinciones que usan anticuerpos suministrados por Ventana Medical / Roche Corp.
(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ), realizamos la prueba
en un Benchmark XT. Estas muestras no se hornearon, según el protocolo habitual para ese
laboratorio clínico de IHC.
La desparafinación y la recuperación de antígenos se realizaron en el instrumento, utilizando las
soluciones y los protocolos del fabricante. Usamos Ventana ER SP1,
PR 1E2, y anticuerpos HER-2 4B5 acoplados con los reactivos de detección del kit.
Al final de cada protocolo de inmunotinción, los portaobjetos se retiraron de los instrumentos, se
deshidrataron a través de grados crecientes de etanol, se sumergieron en xileno y se cubrieron con
cubreobjetos usando Permount (Thermo Fisher Corp, Waltham, MA).
Al diluir anticuerpos primarios, para simular la degradación del reactivo, los anticuerpos se
diluyeron en solución salina tamponada con Tris 10 mM (TBS) / 0,05% Tween20 / 0,34%.
Brij-35 / 0.05% ProClin, a pH 7.6. El grupo no diluido representa el anticuerpo primario del
fabricante que se proporciona a la concentración recomendada.

Evaluación de Controles de los Patólogos

Los portaobjetos asociados con las inmunotinciones HercepTest y PR 1294 también fueron
evaluados por cuatro patólogos (S.N., M.P., J.D.G. y K.G.C.). El objetivo de la evaluación de los
patólogos fue comparar el análisis de imagen (objetivo) con el puntaje manual (subjetivo). Los
portaobjetos se cubrieron con una etiqueta adhesiva de 3x1 pulgadas. Se creó un pequeño orificio
en la etiqueta, de modo que solo un solo control era visible en cada diapositiva.

Las diapositivas se codificaron con un número aleatorio y se organizaron en un orden aleatorio. A

los patólogos también se les proporcionó tres diapositivas que muestran el nivel normal ("base") de
la intensidad de la tinción para el control particular que se evalúa. Estas diapositivas iniciales
demostraron el nivel esperado de intensidad de la mancha si la mancha funciona correctamente.
Se le pidió a cada patólogo que revisara primero las diapositivas iniciales, seguidas de las
diapositivas desconocidas. Le pedimos a los patólogos que aprobaran o fallaran cada una de las
diapositivas numeradas. Si la intensidad de la mancha del control (en la diapositiva numerada) es
indistinguible de la del control de la línea de base, entonces debería pasar. Si, por el contrario, el
control tiene una intensidad de tinción visiblemente menor en relación con el control de línea de
base, entonces debería fallar. Como cada grupo experimental está compuesto por portaobjetos por
triplicado, cada grupo experimental (es decir, cada dilución) en la evaluación del patólogo también
se evaluó por triplicado.

Después de que cada uno de los cuatro patólogos revisó el primer conjunto de diapositivas,
relacionado con un tipo de control (por ejemplo, un control IH), se cambiaron todas las etiquetas.
Se aplicaron nuevas etiquetas a la diapositiva, esta vez revelando un control diferente (por
ejemplo, un control de tejido) en la misma diapositiva.
Se realizó otra ronda de revisión, en la que se evaluó un control de tejido. Los patólogos evaluaron
solo un control de IHC durante cada ronda para que la apariencia de uno no influya en la
interpretación de otro en la misma diapositiva. Este proceso se repitió hasta que todas las
evaluaciones se completaron.

Análisis estadístico
Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de las diapositivas por triplicado.
Cada diapositiva lleva un punto IHControl que contiene aproximadamente 5000 microperlas
recubiertas de analito.
Para cuantificar un único punto de control IH, hemos muestreado tres áreas microscópicas
diferentes. Esto es análogo al muestreo de tres campos del carcinoma de mama de un paciente
para evaluación de HER-2 o ER / PR. De estos tres campos, calculamos la intensidad media de la
mancha por mancha (diapositiva). Cada punto de datos en las Figs. 1B, 5B y 5E representan
la media ± SD de tres puntos separados de IHControl, cada uno en una diapositiva separada. Los
datos para las Figs. 1C, 5C y 5F representan la media de dos campos microscópicos separados.
Curvas de regresión en las Figs. 1 y 5 se calcularon usando la herramienta de regresión lineal de
Excel (método de cuadrados mínimos).

La sensibilidad de los controles se define como su capacidad para identificar aberraciones en la

inmunotinción. En este estudio, simulamos una de estas aberraciones. La degradación del
anticuerpo primario se simula por dilución. Independientemente de la aberración de inmunotinción
específica (reactivos degradados, tiempos o temperaturas incorrectos, suministro incorrecto de
reactivo, etc.), el resultado es la misma disminución en la intensidad de la tinción. Por lo tanto,
expresamos la sensibilidad de los controles de inmunotinción como el grupoespecífico
pendiente de la línea de regresión para la intensidad de la mancha frente a la dilución.
Para estimar estos parámetros, el modelo de regresión incluye covariables para el grupo, la
dilución y una interacción entre el grupo y la dilución.
El término de interacción nos permite probar la significación estadística de las diferencias entre las
pendientes para los tres grupos.
Figura 1. (A) Curva de respuesta de HercepTest con IHControls, que correlaciona la intensidad de
la tinción inmunohistoquímica (eje y) en función de la concentración de HER-2 (eje x). La
concentración de HER-2 (eje x) se expresa en unidades de moléculas por microperlas, trazables a
unidades de MEF.
Cada punto de datos es la media ± DE de las láminas por triplicado, es decir, tres réplicas de
tinción independientes. (B) Representación gráfica de la intensidad de la tinción de IHControls
después de diluir el anticuerpo primario HercepTest por el factor indicado en el eje x. La velocidad
de disminución de la intensidad de la tinción es evidente a medida que la pendiente de las líneas
de regresión. (C) Representación gráfica de la intensidad de la tinción de control de la sección
tisular después de las mismas diluciones de anticuerpos primarios. Los controles de tejido y
IHControls están montados en la misma diapositiva.
Abreviaturas: HER-2, receptor
del factor de crecimiento
epidérmico humano tipo II; MEF,
moléculas de fluorocromo
equivalente.
Resultados
Evaluación de la sensibilidad de control de inmunotinción
En esta investigación, medimos y comparamos la sensibilidad de varios controles de
inmunotinción, utilizando IHControls y controles de tejido. Los IHControls
están disponibles en una amplia gama de concentraciones de HER-2, ER o PR, de
aproximadamente 100 a 1,000,000 de moléculas por microperlas. Las concentraciones de HER-2,
ER o PR en los controles de tejido no se conocen. Para todos estos experimentos, colocamos uno
o dos controles de tejido en la misma diapositiva que IHControls (consulte la sección "Materiales y
métodos"). Al estar en la misma diapositiva, los controles de tejido y los controles IH se vieron
expuestos al mismo tratamiento de tinción. Posteriormente, la intensidad de la tinción se cuantificó
mediante análisis de imágenes (ver la sección "Materiales y métodos"). El análisis cuantitativo se
realizó usando todos los principales anticuerpos HER-2, ER y PR comerciales.

Definimos la "sensibilidad" de un control positivo en términos de su capacidad para revelar una

anormalidad en los reactivos, protocolo o condiciones que producen atípicamente (baja)
intensidad de la mancha
Para medir la sensibilidad, simulamos la degradación primaria de anticuerpos diluyéndola (ver la
sección "Materiales y métodos"). Por ejemplo, una dilución 1: 2 simula una degradación del 50% de
la eficacia del anticuerpo. Un control que muestra una tinción medible más débil a una dilución 1: 2
es más sensible que un control que requiere una dilución 1: 4 para mostrar una intensidad de
tinción débil similar. Datos representativos (para HercepTest)
se muestran en la Fig. 1.

Análisis de sensibilidad HER-2 (HercepTest) con IHControls

Nuestros datos demuestran que la sensibilidad de un control positivo de IHC depende de la
concentración del analito y de dónde cae esa concentración en la curva de respuesta analítica de
la inmunotinción. Por lo tanto, ilustramos la curva de respuesta analítica de cada inmunosuero
junto con los datos de sensibilidad.
La Figura 1A representa la curva de respuesta analítica para la tinción HercepTest en un rango de
tres niveles de concentraciones de HER-2 usando IHControls, como se describió previamente.
La concentración de HER-2 se representa gráficamente en el eje x, expresada en moléculas por
microperlas.
La concentración de HER-2 se puede rastrear a unidades estandarizadas de MEF, como se explica
en la sección "Materiales y métodos" y se publicó anteriormente.
El eje y de la Fig. 1A representa la intensidad de la tinción, medida por análisis de imágenes (ver
la sección "Materiales y Métodos"). La intensidad de la mancha de IHControl (en el eje y) se
expresa como una relación (consulte la sección "Materiales y métodos").
La Figura 1A ilustra que los dos IHControls más altos, con concentraciones de HER-2 de 1.086.658
y 77.913 moléculas (MEF) por microperlas, se encuentran en la meseta de respuesta analítica.
Aunque sus concentraciones son más que un logaritmo diferente, sus intensidades de tinción son
similares. IHControls o una muestra de paciente en cualquier parte de esta región de la meseta se
manchará al mismo nivel máximo.
La Figura 1A también ilustra que las muestras con concentraciones de HER-2 entre
aproximadamente 1000 y 10.000 moléculas (MEF) por microperlas producen una intensidad de
tinción variable, dependiendo de la concentración de HER-2.
La intensidad de la mancha en esta porción de la curva depende de la concentración. Luego
buscamos identificar la concentración óptima de HER-2 IHControl que detectaría con mayor
sensibilidad la dilución del reactivo del anticuerpo primario (HER-2).

Las diluciones de anticuerpos primarios HercepTest se grafican en el eje x de la Fig. 1B. Los
diversos HER-2 IHControles (cada uno con diferentes concentraciones) se grafican como curvas
separadas en la Fig. 1B. La Figura 1B ilustra el efecto de la dilución del anticuerpo primario (eje x)
sobre la intensidad de la tinción (eje y). Como se esperaba, la dilución del anticuerpo primario
HercepTest da como resultado una intensidad de tinción más débil. Sin embargo, existen
diferencias significativas entre los diversos IHControls, dependiendo de sus concentraciones de
HER-2.

El IHControl con la concentración más alta de HER-2, en la porción de meseta de la curva de

respuesta analítica (Fig. 1B, línea roja), es el menos sensible para detectar la degradación del
reactivo. Muestra una tasa de disminución mucho más lenta en la intensidad de la tinción (a
medida que se diluye el anticuerpo primario) en comparación con las moléculas 8187 HER-2 por
microperlas IHControl (Fig. 1B, línea púrpura).
Las moléculas 8187 HER-2 por microperlas IHControl son las más cercanas a la porción
dependiente de la concentración de la curva de respuesta analítica. Produce una intensidad de
tinción alta en condiciones de tinción normales (es decir, dilución de 0), y la tasa más rápida de
disminución de la intensidad de la tinción a medida que se diluye el anticuerpo primario.
Por lo tanto, es el más sensible para detectar grados sutiles de falla de reactivo de anticuerpo
primario.
Figura 2. Fotomicrografías de IHControls que portan 8187 moléculas (MEF) HER-2, después de la
inmunotinción con HercepTest en diversas diluciones de anticuerpos primarios. La Figura 2A ilustra
la apariencia en condiciones normales, sin dilución de reactivo de anticuerpo primario.
Se destacan los ejemplos de una microperla teñida que lleva HER-2 y una microperla de color
estándar. Los contornos de microperlas débiles de las microperlas no teñidas se deben a la
refracción de la luz, no a la tinción. Las fotomicrografías también ilustran las microperlas de color
estándar más pequeñas a las que se comparan las microperlas de prueba teñidas. La Figura 2B y
C ilustran la inmunotinción representativa con el anticuerpo primario indicado
dilución. Se destaca un ejemplo de una microperla no teñida que contiene un analito
antigénicamente irrelevante. En la Fig. S1 se muestra un conjunto similar de imágenes con una
exposición fotomicrográfica ligeramente más corta. Barra de escala 10 μm. Abreviaturas: MEF,
moléculas de fluorocromo equivalente; HER-2, receptor del factor de crecimiento epidérmico
humano tipo II.
En resumen, los IHControls que tienen concentraciones de antígeno en las mesetas de la curva de
respuesta analítica son menos sensibles. A medida que la concentración del analito aumenta a lo
largo de la región de la meseta, los controles son progresivamente menos sensibles; se requieren
mayores diluciones de reactivos de anticuerpos primarios antes de que la intensidad de la tinción
disminuya.
Los controles que tienen concentraciones de analito en o cerca de la región dependiente de la
concentración son los más sensibles. Comparamos cuantitativamente las sensibilidades de los
diversos IHControles comprobando si las pendientes de las líneas de regresión difieren
significativamente para los tres grupos IHControls.

La pendiente estimada para la intensidad de la tinción (para cada duplicación de la dilución) para el
grupo 8187 IHControl (pendiente: -0.24, intervalo de confianza [IC] del 95%: -0.28 a -0.20) es
estadísticamente significativamente menor que el grupo 77.913 IHControl (pendiente : -0,15, IC del
95%:
-0.19 a -0.11, p = 0.005), que a su vez es menor que el grupo 1.086.658 IHControl (pendiente: -
0.08, IC del 95%: -0.12 a -0.03, p = 0.015). Estos datos demuestran una
aumento progresivo de la sensibilidad a medida que la concentración de HER-2 cayó más cerca de
la región dependiente de la concentración de la curva de respuesta analítica.

Análisis de sensibilidad HER-2 (HercepTest) utilizando controles de tejido

La Figura 1C ilustra la misma curva de intensidad de la tinción que en la Fig. 1B pero para los
controles de sección de tejido que expresan niveles bajos (1+) y altos (3+) de HER-2. A diferencia
de IHControls, las concentraciones de HER-2 en estas secciones de tejido tumoral son
desconocidas. La intensidad de la tinción tisular se mide con el complemento ImmunoMembrane
utilizando ImageJ y se expresa en una escala numérica relativa de 0 a 10 (consulte la sección
"Materiales y métodos"). Figura
1C demuestra que para el control 3+, la intensidad de la tinción disminuye progresivamente con
diluciones crecientes hasta que no hay tinción detectable en un anticuerpo primario a 1:32
dilución de reactivo Este perfil de curva de dilución se compara más estrechamente con el grupo
IHControl 8187 moléculas (Fig. 1B, línea púrpura).

La curva de dilución de control de tejido 1+ HER-2 es difícil de cuantificar porque los números de
intensidad de la tinción son muy bajos. En tales puntajes de baja intensidad,
el error de medición es más significativo (como un porcentaje).
La razón principal del error es que el programa de análisis de imágenes ImmunoMembrane no
puede expresar las puntuaciones de intensidad tisular en números fraccionarios menores que 1. En
consecuencia, aunque la intensidad de la tinción en la dilución 1: 2 es subjetivamente más débil
que el grupo de anticuerpos primarios no diluidos, los puntajes registrarse como 1. Por ejemplo, se
calcula que el grupo de dilución 1: 4 tiene una intensidad de tinción de 0.5 porque la mitad de
los campos de imagen no tenían tinción detectable, mientras que la otra mitad se registró como
puntuación de 1.

Imágenes fotomicroscópicas representativas:

IHControls and Tissue Controls
Las Figuras 2 y 3 representan imágenes representativas del conjunto de datos asociado con la Fig.
1B y C, respectivamente.
La Figura 2 ilustra la apariencia del 8187 IHControl en tres diluciones de anticuerpos primarios
diferentes.
Las microperlas recubiertas con HER-2 se tiñen fuertemente en el grupo de anticuerpo no diluido
(figura 2A). Serie sucesiva
Figura 3. Fotomicrografías de inmunotinción de control tisular con HercepTest después de las
diluciones de anticuerpos primarios indicadas. Estas imágenes son ejemplos representativos del
conjunto de datos asociados con la figura 1C. Los paneles A a C son del control del tejido del
receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo II (HER-2) alto (3+). Los paneles D a F
son del control tisular HER-2 bajo (1+). Las imágenes elegidas para la ilustración se seleccionaron
como representativas de las diluciones que muestran los extremos de la tinción y una dilución
intermedia. Estas diluciones difieren para los controles de tejido 3+ y 1+. Barra de escala 10 μm.