TEMA 4: MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos
I. OBJETIVOS
En cualquier laboratorio de
microbiología es fundamental el
mantenimiento y conservación de las
colecciones de microorganismos con
las que trabajamos ya que, obviamente,
son nuestro reactivo primordial.
Existen una gran variedad de métodos
de mantenimiento y conservación de
los microorganismos cuya utilización
va a depender en parte del tiempo
previsto (Mantenimiento ---->Cortos
períodos de tiempo, días; Conservación
----> Largos períodos de tiempo, años)
y en parte de las características de los
diferentes microorganismos (bacterias,
hongos, virus, algas, protozoos).
Los objetivos de las colecciones de los
microorganismos son muy simples:
1.- Mantener los cultivos viables a lo
largo del tiempo.
2.- Mantener los cultivos puros, sin
contaminaciones.
3.- Mantener los cultivos sin cambios
en sus características, es decir estables.
II. TECNICAS DE
MANTENIMIENTO Y
CONSERVACION DE LOS
MICROORGANISMOS
1.- Subcultivo seriado
Consiste en resembrar el
microorganismo cada cierto tiempo en
un medio adecuado; generalmente se
utiliza agar inclinado ya que en medio
sólido se detectan mejor los
contaminantes que en medio líquido y
el hacerlo inclinado tiene por objeto el
evitar la desecación rápida del medio.
Este método es válido para cortos
períodos de tiempo (semana - 15 días)
por lo que deben ser resembrados con
frecuencia lo que incrementa el riesgo
de contaminación. Además, al
mantenerlos a temperatura ambiente,
pueden crecer y espontáneamente
cambiar sus características genéticas
(mutación, pérdida de plásmidos, etc.)
que pueden afectar al carácter por el
que fueron seleccionados. Estos dos
inconvenientes pueden subsanarse en
parte enlenteciendo el metabolismo de
los microorganismos al mantenerlos a
4˚C con lo que su crecimiento es
inferior y la necesidad de hacer
subcultivos se prolonga a 1 - 3 meses.
En microbiología industrial hay que
pensar en mantener las colecciones
durante períodos de años y no de
meses, por lo tanto se utilizan otras
técnicas que nos ahorran trabajo y
disminuyen los riesgos.
2.- Desecación
La eliminación del agua
(deshidratación) es un método de
conservación que reduce drásticamente
el metabolismo. Sin embargo, no todos
los microorganismos sobreviven a
estos métodos de secado, por lo que se
hace necesario añadir agentes
protectores (leche descremada,
glutamato sódico al 10%). Una vez
secos es importante mantener el
producto sellado (tapón de rosca,
ampolla) para evitar el contacto con el
aire ya que son higroscópicos.
Los soportes que se suelen utilizar son
arena, suelo, sílica gel previamente
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secados y esterilizados por
calentamiento con aire caliente (no
utilizar autoclave y sí calor seco).
Sobre estos soportes se añade la
suspensión de los microorganismos y
se deja secar a temperatura ambiente.
También se pueden utilizar como
soportes discos o tiras de papel, agar ,
discos de gelatina donde se añade la
suspensión de microorganismos y
posteriormente se seca al vacío
evitando la congelación, lo que se
denomina L-secado (L-drying).
Estos métodos de secado son
particularmente útiles para conservar
microorganismos productores de
esporas, p.j. actinomicetos.
3.- Congelación
Al bajar la temperatura hasta el punto
de congelación o por debajo de éste se
reduce el metabolismo drásticamente
hasta el caso de prácticamente anularlo
con nitrógeno líquido (-196˚C).
Sin embargo, existen una serie de
problemas que debemos tener en
cuenta. La formación de cristales de
hielo pueden romper las células,
además al eliminar el agua líquida por
convertirse en hielo existe una
concentración de sales que puede ser
perjudicial. Para evitar estos problemas
se deben utilizar suspensiones que
contengan el mínimo de sales posibles
así como utilizar agentes protectores
como el glicerol (25%) o
dimetilsulfóxido (DMSO c.a. 10%)
que neutralizan el efecto de las sales.
El realizar el proceso de congelación
de una forma rápida o gradualmente no
está claro. Algunos recomiendan una
bajada gradual (1˚C/min) hasta -20˚C
para posteriormente enfriar
rápidamente. Sin embargo, la
descongelación debe ser rápida.
Las distintas temperaturas que se
utilizan para la conservación de los
microorganismos por congelación son:
-30˚C: congelador de frigorífico. No se
recomienda debido a la formación de
eutécticos (suspensión con distintos
puntos de congelación debido a los
solutos que pueden dañar a las células).
-70˚C: nieve carbónica (CO2 sólido) o
ultracongeladores. Es el método más
utilizado en los laboratorios de
microbiología.
-196˚C: nitrógeno líquido. Se utiliza
para la conservación de bacterias, virus
y líneas celulares. Existen varios
problemas prácticos: el nitrógeno se
evapora continuamente por lo que se
debe rellenar regularmente; se deben
utilizar recipientes que resistan bien
estas temperaturas y que estén bien
cerrados para evitar la entrada de
nitrógeno líquido.
4.- Liofilización
Es el método más utilizado por las
colecciones internacionales de cultivos
tipo para la conservación de los
microorganismos. Básicamente
consiste en congelar rápidamente una
suspensión de microorganismos y
eliminar el agua como vapor de agua
directamente del hielo sin pasar por el
estado intermedio líquido. Por lo tanto,
combina las dos técnicas anteriormente
citadas ya que es una desecación por
sublimación. El sistema requiere tres
componentes: mecanismo de
congelación, bomba de vacío y una
trampa de agua.
Los liófilos se conservan entre 0 y 5˚C
durante muchos años. Para su
recuperación se resuspende el liófilo en
el medio de cultivo adecuado y se
incuban a la temperatura adecuada. No
obstante, hay que estudiar, como en los
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casos anteriores (desecación y conservación durante largos períodos
congelación), las condiciones óptimas de tiempo el nitrógeno líquido.
de supervivencia de nuestro
microorganismo. 4.- Hongos

La mayoría de los hongos pueden

III. CONSERVACION DE conservarse por desecación en suelo.
DIFERENTES GRUPOS DE Aunque, al igual que las bacterias,
MICROORGANISMOS presentan una gran diversidad
encontrándonos de todo.
Debido a la gran variedad que
presentan los microorganismos no
existe ningún método óptimo para
todos e incluso para un grupo
particular de microorganismos ya que
lo que funciona bien para algunos no
es útil para otros. No obstante, en
líneas generales podemos asumir lo
siguiente:

1.- Algas y cianobacterias

La mayor parte de los cultivos se han

mantenido como subcultivos seriados a
temperaturas entre 10 y 15˚C. Para
crecer estos cultivos se necesita luz
(fotosintéticos) Algunas cianobacterias
pueden conservarse bien desecadas ya
que presentan formas de resistencia
(akinetos). En general, las algas no
aguantan bien la liofilización ni la
desecación. En cuanto a la congelación
los mejores resultados se obtienen con
nitrógeno líquido.

2.- Bacterias

Prácticamente se han usado todos los

métodos conocidos con buenos y
malos resultados, aunque en líneas
generales el mejor método es la
liofilización debido a su facilidad de
transporte.

3.- Virus

Se han utilizado todos los métodos

obteniendo en líneas generales baja
supervivencia. Se recomienda para su

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