Pembahasan

Pada praktikum kali ini yaitu dilakukan isolasi DNA plasmid. Plasmid digunakan sebagai
vektor perbanyakan/ekspresi suatu gen. Gen yang akan diamplifikasi disisipkan ke dalam plasmid.
Setelah itu, plasmid dimasukkan ke dalam bakteri melalui proses transformasi dan bakteri dikultur.
Selain untuk mengekspresikan gen tertentu, plasmid juga digunakan untuk membuat protein dalam
jumlah besar. Plasmid juga dapat bermutlipikasi dalam sel tanpa bergantung pada kromosom.
Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada beberapa
tahap yang perlu dilakukan, yaitu: lisis, ekstraksi, purifikasi dan pengendapan DNA.

Bakteri yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah salah satu contoh dari bakteri
Gram negatif, yaitu Escherichia coli BL21. Bakteri merupakan sel prokariot, dimana sel ini
memiliki beberapa perbedaan dengan sel eukariot. Salah satunya adalah DNA eukariot berbentuk
linear dan memiliki protein histon, sedangkan DNA prokariot berbentuk sirkular dan tidak
memiliki protein histon. Terdapat beberapa spesies bakteri Gram negatif yang bersifat patogen,
yang pada umunya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel bakteri gram negatif
terutama lapisan lipopolisakarida. Bakteri ini memiliki sistem membran ganda, dimana membran
plasmanya diselimuti oleh membran luar yang permeabel dan yang menjadi salah satu kelebihan
bakteri ini dibandingkan bakteri Gram positif adalah dengan adanya dinding sel tebal berupa
peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan membran luar. E.coli yang digunakan
dalam praktikum kali ini memiliki beberapa alasan, yaitu karena E.coli umumnya digunakan
sebagai indikator lingkungan dan mudah ditemukan untuk kemudian dibiakkan karena terdapat
banyak di lingkungan dan terdapat pula di dalam tubuh manusia tepatnya di dalam usus.

Sebelum melakukan isolasi DNA plasmid, dilakukan dahulu tahapan penyiapan suspensi
bakteri E.coli, yaitu dengan mengkultivasi bakteri E.coli pada media Luria-Bertani broth (LB). LB
merupakan media yang sifatnya selektif karena terdapat nutrisi dan ampisilin, di mana hal ini dapat
merangsang E.coli agar resistensi terhadap antibiotik dan dapat menghambat kontaminan yang
peka terhadap ampisilin. Bakteri tersebut di inokulasikan ke dalam medium LB untuk dilakukan
pembiakkan bakteri, yaitu dengan dilakukan pengocokan 200-250 rpm selam 18 jam. Lalu
dipindahkan ke dalam tabung eppendorf dan dikocok. Setelah itu supernatan yang terbentuk
dibuang. Hasil akhir dari proses penyiapan suspensi bakteri ini adalah pellet bakteri yang nantinya
akan di resuspensi saat akan digunakan.
 Prosedur isolasi plasmid dari bakteri E.coli dapat dilakukan pada suhu kamar. Pelet sel
bakteri diresuspensi dalam 200 μL Buffer PD1 menggunakan vortex atau dengan pemipetan
berulang sampai tidak terdapat sisa gumpalan. Fungsi dari Buffer PD1 yaitu untuk meresuspensi
pelet sel bakteri setelah pemanenan dengan menggunakan sentrifus. Larutan Buffer PD1 terdiri
dari 50 mM glukosa, 25 mM Tris-Cl (pH 8.0),dan 10 mM EDTA (pH 8.0). Fungsi dari glukosa
yaitu untuk menyamakan potensial osmotik sel selama proses lysis menggunakan SDS, dan larutan
EDTA sebagai kelator untuk mengikat ion Mg2+ yang bertujuan untuk menginaktivasi enzim
DNase.

Setelah bakteri diberi Buffer PD1, suspensi bakteri ditambahkan 200 μL Buffer PD2.
Larutan Buffer PD2 terdiri dari NaOH dan SDS, fungsi larutan ini untuk melisiskan sel dengan
cara melarutkan membran sel oleh SDS (Sodium Dodesil Sulfat), dan mendenaturasi DNA
kromosom namun tidak mendenaturasi DNA plasmid. SDS juga berfungsi sebagai pendenaturasi
protein untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif pada proses
elektroforesis gel. DNA plasmid tidak akan terdenaturasi karena sifatnya yang covalently closed
circular DNA (cccDNA), kemudian tabung dikocok dengan cara dibolak-balik 10 kali sampai
larutan menjadi kental dan agak jernih. Pengocokan ini tidak boleh menggunakan vortex, karena
dapat menyebabkan pemotongan DNA kromosom dan membuat proses pelysisan berjalan
sempurna dan larutan tidak boleh diinkubasi lebih dari 5 menit, karena dapat menyebabkan
denaturasi bentuk superkoil dari DNA plasmid.

Tahap selanjutnya yaitu sebanyak 300 μL Bufder PD2 ditambahkan ke dalam larutan tersebut, lalu
tabung dikocok dengan cara dibolak-balik 10 kali. Larutan Bufder PD2 berisi C2H3NaO2. Fungsi
dari larutan Bufder PD2 yaitu untuk menetralisir pH, menurunkan pH (8.5 -> 5.5), untuk
meningkatkan renaturasi, menghentikan denaturasi DNA kromosomal sehingga terbentuk
presipitat DNA kromosom yang menempel dengan debris seluler, dan memisahkan DNA plasmid
yang larut di dalam supernatan. Pengocokan harus dilakukan perlahan untuk mencegah
terbentuknya endapan debris sel bakteri. Lisat bakteri yang telah dinetralkan akan berwarna putih
keruh dan kental.

Lisat bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 3 menit
untuk memisahkan pelet debris sel, DNA kromosom, dan untuk memisahkan kontaminan yang
mungkin masih terdapat pada supernatan. Supernatan dipipet ditempatkan pada PDH Column
dalam Collection Tube 2 mL. Endapan putih jangan sampai terpipet. Supernatan tersebut
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 30 detik. Cairan pada tabung
kolektor dibuang, lalu kolom diletakkan pada tabung kolektor yang sama.

Sebanyak 600 μL Wash Buffer (etanol 96 %) ditambahkan dalam kolom PDH, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 30 detik. Fungsi dari
penambahan etanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA
yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat.
Selain itu etanol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Kemudian Cairan pada tabung kolektor
dibuang, lalu kolom PDH ditempatkan dalam Collection Tube 2 mL. Sentrifugasi lagi pada
kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 3 menit pada suhu ruangan untuk mengeringkan
matriks kolom. Tujuan dari sentrifugasi adalah untuk mendapatkan pellet yang akan mengendap
di dasar kolom.

Kolom PDH dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 mL baru, lalu ditambahkan 50 μL

Elution Buffer ke bagian tengah membran matriks kolom untuk mengelusi DNA plasmid (tip
mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom). Tabung diinkubasi selama 2 menit pada suhu
ruang agar terelusi sempurna dan buffer elusi terserap dengan sempurna, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 2 menit pada suhu ruang untuk mengelusi DNA
yang telah dimurnikan. Tahap ini dapat melepaskan sisa DNA dari membran dan meningkatkan
perolehan DNA sekitar 10-20%.

Kemudian kolom dilepaskan, lalu tabung berisi DNA plasmid disimpan pada suhu -20°C.
penyimpanan DNA plasmid pada suhu -20°C dapat bertahan selama 3 bulan sedangkan pada suhu
-70°C DNA plasmid dapat bertahan selama 1 tahun.

Plasmid yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu plasmid pD861-SR, berikut ini
merupakan peta plasmid tersebut :
Deskripsi komponen fitur plasmid pD861 :

a. Kanamycin-r
Agen bakteriosidal efektif yang menghambat translokasi ribosom sehingga
menyebabkan miscoding. Gen yang mengkodekan ketahanan kanamisin adalah
Neomycin phosphotransferase II (NPT II / Neo). E.coli yang ditransformasikan dengan
plasmid yang mengandung gen resistensi kanamisin dapat tumbuh pada media yang
mengandung 25 μg / ml kanamisin. Kanamisin adalah bubuk putih ke putih yang larut
dalam air (50mg / ml).
b. Ori_pUC
Asal mula replikasi adalah urutan genom tempat replikasi dimulai. Ori pUC adalah
bentuk asal bermutasi yang berasal dari E. coli plasmid pBR322 yang memungkinkan
produksi lebih dari 500 salinan plasmid per sel.
c. P_rhaBAD
Promotor rhamnose-inducible rhaBAD mampu mengekspresikan protein rekombinan
tingkat tinggi dengan adanya L-rhamnose dan diatur secara ketat oleh glukosa tanpa
adanya rhamnose. Promotor rhaBAD mengendalikan gen rhaBAD yang disusun dalam
satu operon
d. strong RBS
Situs pengikatan ribosom (RBS) adalah urutan mRNA yang terikat oleh ribosom
selama terjemahan protein. Ini bisa berupa topi mRNA 5 di eukariota, sebuah wilayah
6-7 nukleotida di bagian hulu kodon awal AUG di prokariota (disebut urutan Shine-
Dalgarno), atau situs masuk ribosom internal (IRES) dalam virus. Ribosom prokariotik
mengenali RBS terutama melalui pasangan dasar antara RBS dan ujung rRNA 16s yang
tidak terstruktur yang membentuk bagian ribosom. Tingkat inisiasi penerima mRNA
tertentu dapat diatur dengan urutan RBS, yang menghasilkan berbagai kekuatan - kuat,
sedang atau lemah.