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Cátedra: Microbiología General.

Facultad: Ciencias Alimentación Bioquímica y Farmacia.
TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

OBJETIVO:

• Ejecutar las técnicas básicas para el aislamiento de microorganismos en cultivo puro, a partir de una
muestra que contiene una población mixta.

INTRODUCCIÓN
En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, pero si
queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos, necesitamos tenerlos como cultivos puros.

Un CULTIVO PURO es aquel que contiene una sola clase de microorganismos, todos los microorganismos
provienen de una sola célula. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento.
Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean un medio de cultivo sólido, en el que los
microorganismos generan colonias separadas.
Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si
el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de
colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son
genéticamente iguales y constituyen un clon.

La obtención de un cultivo puro, a partir de una población mixta, se lleva a cabo en dos etapas:
1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente
separados sobre la superficie de un medio de cultivo sólido, de manera que luego de la incubación ellos
formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce como aislamiento.
En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos
presentes en la población original.
2. Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga
agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como transplante.

Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir
el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al
realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas características.
El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros factores, de los
requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de
microorganismos que, por sus características y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra,
dificulten la obtención del microorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, se deben utilizar
medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes contaminantes.
La temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los microorganismos, usualmente la
temperatura óptima de los microorganismos patógenos para el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el
microorganismo que se intenta aislar es anaeróbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de
eliminar la presencia de oxígeno en el ambiente donde se desarrollará el mismo.
Basándose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se
encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudará en la selección del medio y las condiciones
de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de los síntomas de la
enfermedad que padece la persona de quien se obtuvo la muestra analizada.
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TÉCNICAS DE AISLAMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a través de la obtención de
colonias aisladas. Cada colonia representa una población de microorganismos procedentes de una sola
célula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de
microorganismo. Para ello se utilizan diferentes técnicas de aislamiento, basadas en diluir la muestra inicial
para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo
resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -70° C, en
Nitrógeno líquido a -173° C, o mediante liofilización.

• Agotamiento. Para obtener colonias aisladas por la técnica del agotamiento la muestra se extiende
sobre la superficie según se indica en la figura, de forma que al final de dicha siembra “por
agotamiento”, la cantidad de inóculo se espera sea lo suficientemente bajo como para que se
depositen células aisladas y distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras
incubar, colonias aisladas.
• Estrías escocesas. Se procede de forma similar al caso anterior, en lo que se respecta al método
general para la siembra en placa y permite también obtener colonias aisladas.

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Estrías por agotamiento

Estrías escocesas

FUNDAMENTO
Al diseminar sobre un medio de cultivo sólido una muestra de bacterias, diluida convenientemente, las
células individuales quedarán lo suficientemente separadas unas de otras y crecerán en forma de colonias
aisladas, a partir de las cuales se puede obtener un cultivo puro.

PROCEDIMIENTO

Material
- Muestra
- Pipetas automáticas.
- Tubos de vidrio
- Placas de petri
- Agar nutritivo
- Ansas

Preparación de las placas de aislamiento

(Cada estudiante preparará dos placas)

1. Marcar la tapa de cada placa estéril con su número de equipo y la fecha.

2. Fundir en un baño de agua hirviendo los tubos con 20 mL de agar nutritivo, luego de que estén
completamente fundidos, colocar en un baño de agua a 50°C.
3. Tomar el tubo de agar fundido y enfriado a 50°C, secarlo bien por fuera, flamear la boca del tubo y verter
en la placa de Petri los 20 mL del agar.
4. Después de verter el medio, si es necesario, rotar la placa cuidadosamente para distribuir el agar en
forma homogénea, teniendo cuidado de no salpicar la tapa.
5. Dejar solidificar, lo cual ocurre en aproximadamente 10 minutos y proceder a secar las placas abiertas y
en posición invertida en la estufa.

Aislamiento

Agotamiento por estrías: Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del
inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado
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número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa.
Cada una de estas bacterias originará una colonia.

1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.

2. Tomar una gota de la suspensión microbiana con el asa de platino estéril y fría, y colocarla sobre el
agar
3. Transferir el inóculo a un aréa pequeña de la superficie de la placa, próxima al borde. Extenderlo
formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción pequeña de la placa.
4. Flamear el asa y enfriarla en el centro de la placa. Rozar una vez con el asa las estrias sembradas la
primera vez y realizar sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de estrías en
dirección perpendicular a las estrías anteriores cuidando que no toque la primera.
5. Incubar una de las placas en posición invertida y en condiciones aeróbicas a 37ºC por 24 h.
6. Observar el crecimiento obtenido en las placas.

RESULTADOS

1. Anotar lo observado
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2. Dibujar lo observado

Estudio de la morfología de la colonia

Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo sólidos, las células aisladas se multiplican
sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonia, las características de
estas colonias son estudiadas y se usan en la identificación de las especies.

Las características que se le estudian a las colonias son:

- Tamaño
- Elevación
- Pigmentación
- Apariencia general
- Forma
- Superficie
- Borde

Observar a simple vista y con la ayuda de la lupa, las colonias de las placas, para determinar las
características de las mismas.

RESULTADOS

1. Anotar lo observado
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2. Dibujar lo observado

Transplante
1. Usando el filamento, trasplantar a un tubo con agar nutritivo inclinado, la colonia, de la que ya anotó
las características de acuerdo con lo indicado.

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2. Incubar a 37ºC por 24 horas.

RESULTADOS

1. Anotar lo observado
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2. Dibujar lo observado

Aislamiento por siembra de dilucciones seriadas: consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra
en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades conocidas de las mismas en una
serie de placas de petri. Considerando que alguna de las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella
en la placa, originará colonias separadas. Contando el número de colonias, el volumen sembrado en la placa
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y la dilución correspondiente, podremos calcular el número de unidades formadoras de colonias presentes en

la muestra inicial.

PROCEDIMIENTO

Material
- Muestra
- Pipetas automáticas.
- Tubos de vidrio
- Placas de petri
- Agar nutritivo
- Ansas

1. Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estériles, flameando la boca de los tubos antes y
después de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero.
2. Mediante una pipeta estéril, tomar una muestra del cultivo mixto, y depositar 1ml en el primer tubo
con 9ml de suero fisiológico (dilución 10-1).
3. Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea. Tomar otra pipeta estéril, y transferir de esta
primera dilución,1ml al siguiente tubo con 9 ml de suero fisiológico (10-2), y así sucesivamente.
4. A partir del tubo con dilución 10-2 y 10-4, con una pipeta estéril , inocular,1ml en placa AN
5. Tras incubar se podrán obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitirá conocer el
número de células existentes en el cultivo original.

Ci = N x D
Ci = Concentración inicial (unidades: número de células / ml)
N = nº de colonias
D = dilución

RESULTADOS

1. Anotar lo observado
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2. Dibujar lo observado