Actinobacilosis

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA Y DISCRIMINACIÓN DEL

Actinobacillus pleuropneumoniae SEROTIPOS 1, 5 Y 7 POR TÉCNICAS DE PCR
MÚLTIPLE BASADAS EN GENES apxIVA Y cps
GUSTAVO ANDRÉS RODRÍGUEZ-MÉNDEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Bogotá, D. C., Julio de 2010

APROBADO
_______________________________ _______________________________
Carolina Ramírez Higuera M.Sc. Ricardo Piñeros Duque Esp. M.Sc (c)
Directora Asesor
_______________________________ _______________________________
Gustavo Arbeláez Ph.D. Fredy Gamboa Ph.D.
Jurado 1 Jurado 2
_______________________________
Marylin Hidalgo Ph.D.
Jurado 3
APROBADO
_______________________________ _______________________________
Dra. Ingrid Schuller García Ph.D. Dr. Manuel Franco Cortés Ph.D.
Decana Académica Director Programa de Posgrados
A la GLORIA de mi vida, alma y corazón
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
estudiantes en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
AGRADECIMIENTOS
Al Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario del Instituto Colombiano

Agropecuario, a su grupo de talento humano tanto profesional como técnico por
brindarme su completo apoyo, por depositar entera confianza en mí, por ayudar a
sentirme útil y perseverante, por abrirme las puertas en el momento oportuno.
A la Asociación Colombiana de Porcicultores – Fondo Nacional de la Porcicultura.
A la Dra. Mariluz Villamil y a todos los profesionales de las áreas de Medicina

Porcina, Biología Molecular y Bacteriología (Drs. Adriana C., Alejandro T., Andrea
C., Claudia C., Ivonne H., Lina P., Luz Dary R., Paula M., Víctor T. y Víctor S.). Al
Dr. Ricardo Piñeros por la oportunidad y acompañamiento, y muy especialmente a
Carolina; más que mi directora, mi mentora y apoyo incondicional.
A la planta de beneficio que permitió la recolección de las muestras, a su personal

administrativo y veterinario.
A todos aquellos que quisieron participar voluntariamente en este proyecto sin

esperar recompensa alguna. Que todo lo bueno persista en ustedes.
A Alvarito y Murcia, porque siempre serán mis verdaderos hermanos.
A todos mis fieles compañeros en este viaje que llamo vida,

a aquellos que a través de ojos sin malicia observan este mundo sin prejuicios,
a quienes cumplen con su breve destino entregados en su misma inocencia,
a quienes sin saber hablar nos servirán hasta el final con bondad y lealtad,
y porque juré protegerlos, PARA USTEDES TODO MI AMOR
TABLA DE CONTENIDO
ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS, SÍMBOLOS Y UNIDADES .............................. x

ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................. xiii
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................ xv
ÍNDICE DE ANEXOS ............................................................................................... xvi
RESUMEN................................................................................................................ xvii
ABSTRACT ............................................................................................................. xviii
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
2. ESTADO DEL ARTE .......................................................................................... 3
2.1 LA PORCICULTURA EN COLOMBIA ....................................................... 3
2.2 COMPLEJO RESPIRATORIO PORCINO .................................................... 3
2.3 Actinobacillus pleuropneumoniae .................................................................. 4
2.3.1 Características generales ....................................................................... 4
2.3.2 Serotipos ................................................................................................ 6
2.3.3 Genoma.................................................................................................. 7
2.3.4 Factores de virulencia ............................................................................ 7
2.3.4.1 Exotoxinas ............................................................................... 9
2.3.4.2 Polisacáridos capsulares (CPS) ............................................. 10
2.3.4.3 Lipopolisacáridos (LPS) .......................................................... 11
2.3.4.4 Sistemas de captación de hierro ............................................ 12
2.3.4.5 Organelos de superficie ......................................................... 12
2.3.4.6 Quorum sensing..................................................................... 13
2.3.5 Identificación ....................................................................................... 15
2.3.5.1 Bacteriológica........................................................................ 15
2.3.5.2 Inmunológica ......................................................................... 16
2.3.5.3 Molecular .............................................................................. 16
2.4 PLEURONEUMONÍA PORCINA ............................................................... 18
2.4.1 Definición e importancia ..................................................................... 18
vii
2.4.2 Epidemiología...................................................................................... 18
2.4.3 Patogenia ............................................................................................. 20
2.4.4 Patología .............................................................................................. 21
2.4.5 Diagnóstico .......................................................................................... 22
2.4.6 Tratamiento.......................................................................................... 22
2.4.7 Prevención y control ............................................................................ 23
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 25
3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................. 25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 25
4. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 27
4.1 EQUIPOS..................................................................................................... 27
4.2 CEPAS BACTERIANAS Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO ..... 27
4.3 ESPECÍMENES CLÍNICOS Y NO CLÍNICOS ..................................... 28
4.4 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE LAS PCRs MÚLTIPLES .... 30
4.4.1 Análisis bioinformáticos ...................................................................... 30
4.4.2 Iniciadores ........................................... ¡Error! Marcador no definido.
4.4.3 Extracción y preparación del ADN genómico ..................................... 32
4.4.4 Condiciones de las PCRs múltiples ..................................................... 33
4.4.5 Visualización de los productos amplificados ...................................... 33
4.4.6 Especificidad analítica ......................................................................... 34
4.4.7 Sensibilidad analítica ........................................................................... 34
4.4.8 Secuenciación de los productos amplificados ..................................... 34
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................... 35
5. RESULTADOS .................................................................................................. 37
5.1 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE LAS PCRs MÚLTIPLES .... 37
5.1.1 Análisis de oligonucleótidos................................................................ 37
5.1.2 Diseño de iniciadores .......................................................................... 38
5.1.3 Condiciones óptimas de amplificación ................................................ 39
5.2 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA ............................................................... 46
5.3 SENSIBILIDAD ANALÍTICA .................................................................. 49
viii
5.4 PROCESAMIENTO BACTERIOLÓGICO DE ESPECÍMENES ........ 52
5.5 PCR A PARTIR DE CULTIVOS PUROS ............................................... 56
5.6 PCR A PARTIR DE ESPECÍMENES ...................................................... 57
5.7 COMPARACIÓN ENTRE PRUEBAS ..................................................... 57
5.8 SECUENCIAS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS ................... 58
6. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 59
7. CONCLUSIONES.............................................................................................. 68
8. RECOMENDACIONES.................................................................................... 70
9. REFERENCIAS ................................................................................................. 72
10. ANEXOS ............................................................................................................. 87
ix
ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS, SÍMBOLOS Y UNIDADES
°C Grados Celsuis
% G+C Porcentaje de la relación guaninas/citosinas
10X 10 veces la cantidad de uso
0.5X 0.5 veces la cantidad de uso
A Absorbancia
A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae
ADN Ácido desoxirribonucleico
App Actinobacillus pleuropneumoniae
App1 A. pleuropneumoniae serotipo 1
ATCC Colección de cultivos del tipo americano
c/u Cada uno (a)
Cat. # Catálogo número
CPS Polisacáridos capsulares
CRP Complejo respiratorio porcino
dATP Deoxinucleótido trifosfatado de Adenina
dCTP Deoxinucleótido trifosfatado de Citosina
dGTP Deoxinucleótido trifosfatado de Guanina
dNTPs Deoxinucleótidos trifosfatados
dTTP Deoxinucleótido trifosfatado de Timina
E Especificidad diagnóstica
EBI Instituto bioinformático europeo
F Forward
fg Fentogramos
g Gramos
g Gravedades
h Horas
x
IC95% Intervalo de confianza al 95%
ICA Instituto Colombiano Agropecuario
K Índice Kappa
LNDV Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
mg Miligramo
min. Minutos
mL Mililitro
mM Milimolar
mPCR PCR múltiple
MgCl2 Cloruro de magnesio
Mpb Mega pares de bases
MWM Marcador de peso molecular
n Total
NAD Dinucleótido adenina-nicotinamida
NCBI Centro nacional de información biotecnológica
ng Nanogramos
nm Nanómetros
nt Nucleótidos
p/v Relación peso/volumen
pb Pares de bases
PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado
pg Picogramos
POE Procedimiento operativo estandarizado
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PPLO Organismos del tipo pleuroneumonía
PRRS Síndrome respiratorio y reproductivo porcino
R Reverse
r.p.m Revoluciones por minuto
RTX Repetición en la toxina
S Sensibilidad diagnóstica
xi
seg. Segundos
o
Tm Temperatura de anillaje
TBE Tris-borato EDTA
U/µL Unidades/microlitro
µL Microlitros
µm Micrómetro
µM Micromolar
UV Ultravioleta
V Voltios
v/v Relación volumen/volumen
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Microscopía electrónica del A. pleuropneumoniae……………………….5
Figura 2. Representación gráfica del genoma del A. pleuropneumoniae………….14
Figura 3. Esquema de los operones de las toxinas RTX. (a) ApxI, ApxII, ApxIII, y
(b) ApxIV, en cepas de referencia del A. pleuropneumoniae…………...15
Figura 4. Diagrama de la organización genética de la región de ADN involucrada

en la biosíntesis de polisacáridos capsulares en diferentes serotipos del A.
pleuropneumoniae………………………………………………………17
Figura 5. Alineamiento múltiple de la porción 3’ del gen apxIVA en el A.

pleuropneumoniae, serotipos 1-12. Representación gráfica de los
iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR e identificación de un fragmento de
amplificación de 256 pb…………………………………………………41
Figura 6. Representación gráfica de los iniciadores App1F y App1R e

identificación de un fragmento de amplificación de 430
pb………………………………………………………………………..42
Figura 7. Alineamiento múltiple de la región parcial cps en el A.

pleuropneumoniae, serotipos 5a y 5b. Representación gráfica de los
iniciadores App5F y App5R e identificación de un fragmento de
amplificación de 824 pb…………………………………………………43
Figura 8. Representación gráfica de los iniciadores App7F y App7R e

identificación de un fragmento de amplificación de 629
pb………………………………………………………………………..44
Figura 9. Ubicación espacial de las regiones parciales cps de los serotipos 1, 5a y 7,

y sus porcentajes de identidad respecto a la región parcial cps dentro del
genoma del serotipo 5b en el A. pleuropneumoniae…………………….45
Figura 10. Resultado por electroforesis en gel de agarosa de la amplificación de las

regiones apxIVA y cps-App1 a diferentes temperaturas de anillaje en
presencia de MgCl2 a 2.5 mM…………………………………………..47

regiones cps-App5 y cps-App7 a diferentes temperaturas de anillaje en
xiii
Figura 12. Resultado por electroforesis en gel de agarosa de la combinación óptima
de iniciadores para la PCR múltiple. (App1) ApToxIVF/R y App1F/R,
(App5) ApToxIVF/R y App5F/R, (App7) ApToxIVF/R y App7F/R, en
Figura 13. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de

especificidad analítica in vitro de los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR
e identificación de un fragmento de amplificación de 256
pb………………………………………………………………………..50

especificidad analítica in vitro de los iniciadores App1F y App1R e
identificación de un fragmento de amplificación de 430 pb…………….50


Figura 17. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR con ApToxIVF y ApToxIVR………………………53
analítica de la PCR con App1F y App1R……………………………….53
analítica de la PCR múltiple con ApToxIVF/R y App1F/R…………….55
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características bioquímicas en cepas del A. pleuropneumoniae…………8
Tabla 2. Técnicas de PCR múltiple desarrolladas para el diagnóstico del A.

pleuropneumoniae………………………………………………………19
Tabla 3. Distribución de serotipos del A. pleuropneumoniae por países…………24
Tabla 4. Cepas bacterianas de referencia y aislados de campo utilizadas para la

estandarización de las técnicas de PCR…………………………………29
Tabla 5. Secuencias y propiedades de los iniciadores utilizados para la detección e

identificación del A. pleuropneumoniae, serotipos 1, 5 y 7………..……31
Tabla 6. Tabla de contingencia para la comparación estadística entre los resultados

de 2 pruebas……………………………………………………………..35
xv
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Buffer TBE 10X.
Anexo 2. Especificidad in silico de los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR contra

bases de datos no redundantes.
Anexo 3. Especificidad in silico de los iniciadores App1F y App1R contra bases de

datos no redundantes.


Anexo 6. Aislamiento e identificación morfológica de colonias del A.

pleuropneumoniae.
Anexo 7. Márgenes de Landis y Koch para valorar el grado de concordancia en

función del índice Kappa.
xvi
RESUMEN
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) es un patógeno respiratorio

del ganado porcino con 15 serotipos reconocidos. En Colombia, los más prevalentes
son el 1, 5 y 7. En este trabajo se describen una serie de protocolos de PCR tipo
múltiple (mPCR) basados en la utilización de nuevos iniciadores específicos contra
las regiones de biosíntesis de polisacáridos capsulares (cps) de los serotipos 1, 5 y 7,
combinados respectivamente con nuevos iniciadores específicos contra el
determinante genético de la exotoxina IV (apxIVA), en la especie bacteriana A.
pleuropneumoniae. Los protocolos se optimizaron usando cepas de referencia y
aislados de campo colombianos, y posteriormente se aplicaron sobre tejido pulmonar
con lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina. Se determinó la especificidad y
sensibilidad tanto analítica como diagnóstica de las mPCR mediante su comparación
contra los resultados obtenidos por el método de identificación bacteriológica
convencional a partir de cultivos puros. Los resultados demostraron la aplicabilidad
de las mPCR como herramientas alternativas para la detección e identificación de
aislados del A. pleuropneumoniae, al ser técnicas rápidas, específicas, sensibles y
versátiles. En conclusión, se presentan tres protocolos de mPCR para el diagnóstico
del A. pleuropneumoniae serotipos 1, 5 y 7 a partir de cepas de referencia y aislados
de campo.
Palabras clave: A. pleuropneumoniae, exotoxina, PCR, polisacárido capsular.
xvii
ABSTRACT
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) is a respiratory pathogen of

pigs with 15 recognized serotypes. In Colombia, the most prevalent serotypes are 1, 5
and 7. This paper describes a series of multiplex PCR (mPCR) protocols based on the
use of new specific oligonucleotide primers against regions of capsular
polysaccharide biosynthesis (cps) of serotypes 1, 5 and 7, respectively combined with
new specific oligonucleotide primers against genetic determinant of the exotoxin IV
(apxIVA) in the bacterial species A. pleuropneumoniae. The protocols were optimized
using reference strains and Colombian field isolates, and subsequently applied on
lung tissue with porcine pleuropneumonia apparent injuries. It was determined the
specificity and sensitivity both the analytical and diagnostic mPCR by comparison
against results obtained by conventional bacteriological method of identification from
pure cultures. The results demonstrated the applicability of the mPCR as alternative
tools for the detection and identification of isolates of A. pleuropneumoniae, rapid
techniques to be specific, sensitive and versatile. In conclusion, we present three
mPCR protocols for diagnosis of A. pleuropneumoniae serotypes 1, 5 and 7 from
reference strains and field isolates.
Keywords: A. pleuropneumoniae, capsular polysaccharide, exotoxin, PCR.
xviii
1. INTRODUCCIÓN
El A. pleuropneumoniae es el agente etiológico de la pleuroneumonía porcina

(PP), una enfermedad respiratoria altamente contagiosa reconocida por causar
considerables pérdidas económicas a la industria porcícola mundial (cita de Wang et
al., 2001). Esta bacteria; más conocida como App, es un patógeno con 15 serotipos
reconocidos hasta el momento (Blackall et al., 2002), todos capaces de producir la
enfermedad y cuya distribución varía de país a país, región a región o predio a predio.
Por lo general, su detección como parte integral del diagnóstico de la PP, se basa en
el aislamiento bacteriano sobre medios enriquecidos seguido de la caracterización
bioquímica y posterior identificación serológica, lo que representa una rutina
dispendiosa y consumidora de tiempo valioso a la hora de obtener resultados
diagnósticos oportunos.
La clasificación en un serotipo dado de aislados del A. pleuropneumoniae se
realiza sobre la base de diferencias en sus polisacáridos capsulares (CPS); sin
embargo, varias líneas de evidencia han indicado la presentación de reacciones
cruzadas durante este proceso de serotipificación (Mittal et al., 1983; Bossé et al.,
1990; Mittal, 1990; Mittal and Bourdon, 1991; Gottschalk et al., 2000; Williams y
col, 2000; Blackall et al., 2002). Por lo tanto, el propósito de este trabajo fue
desarrollar y optimizar los primeros protocolos de amplificación molecular en
Colombia, capaces de detectar e identificar simultáneamente los serotipos 1, 5 y 7 de
la especie A. pleuropneumoniae; respectivamente, así como discriminarlos entre sí.
La primera necesidad de esta investigación consistió en escoger las regiones
blanco de amplificación. Los avances en la genética molecular del A.
pleuropneumoniae permitieron seleccionar los genes apxIVA como específico de
especie (Schaller et al., 1999) y cps como específicos de serotipo (Jessing et al.,
2008; Xu et al., 2008) para el diseño y selección de los iniciadores. Establecido esto,
el siguiente paso fue desarrollar una serie de protocolos para la amplificación
molecular convencional de estas regiones; pero con potencial de combinado múltiple,
adaptando los principios para la validación y control de calidad de los métodos de la
1
reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas (Organización Mundial de Sanidad Animal, 2004) a la estandarización de
estos ensayos. Finalmente, se optimizaron los protocolos de detección e identificación
simultánea mediante el uso de los nuevos iniciadores en la misma mezcla reactiva
cuyo resultado se evidenció en la amplificación de un producto de 256 pares de bases
(pb) específico de la especie A. pleuropneumoniae, acompañado de 3 productos de
430, 824 y 629 pb, específicos de los serotipos 1, 5 y 7, respectivamente.
Se utilizaron 22 cepas bacterianas; incluyendo 11 aislados de campo
colombianos, además de 7 cepas diferentes a la especie A. pleuropneumoniae. La
optimización de la temperatura de anillaje (Tom) y la concentración de cloruro de
magnesio (MgCl2), permitió detectar hasta 6 fentogramos (fg) de ADN inicial en la
muestra a partir de cultivos puros. Cuando los protocolos de amplificación molecular
múltiple optimizados se compararon con la técnica de identificación bacteriológica
convencional, se obtuvo una sensibilidad y especificidad diagnóstica del 100% e
índice Kappa de 1, indicando un grado de concordancia “muy bueno” entre las
mismas.
En conclusión, la tipificación es una herramienta útil en la identificación de
serotipos circulantes y estudio de brotes; sin embargo, el conocimiento de cuáles
serotipos son prevalentes en un predio, región o país, depende de metodologías de
alta calidad e interpretación objetiva que suplan las limitaciones de las técnicas del
serotipado tradicional.
2
2. ESTADO DEL ARTE
2.1 LA PORCICULTURA EN COLOMBIA
Se conoce a la porcicultura como el arte de criar cerdos, arte que está

legalmente constituido por las actividades de producción de pié de cría (granjas
genéticas) y producción comercial de lechones y cerdos para el abastecimiento del
mercado de carne fresca y la industria cárnica especializada (Congreso de la
República de Colombia, 1996).
Con un estimado de 3.924.115 cabezas de ganado porcino en el país al
término del año 2009 (Asociación Colombiana de Porcicultores, 2010), las regiones
que presentan una mayor concentración de predios porcícolas tecnificados son:
Antioquia con el 35.51%, región Occidental; constituida por los departamentos de
Caldas, Quindío, Risaralda y Valle del Cauca con el 27.93%, región Central;
constituida por los departamentos de Boyacá, Cundinamarca, Meta y Tolima con el
22.92%, costa Atlántica; constituida por los departamentos de Atlántico, Bolívar,
Cesar, Córdoba, Guajira, Magdalena y Sucre con el 6.72%, región Sur; constituida
por los departamentos de Cauca, Caquetá, Huila y Nariño con el 4.82%; y, región
Oriental; constituida por los departamentos de Arauca, Casanare, Norte de Santander
y Santander con el restante 2.64% (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural,
2007).
2.2 COMPLEJO RESPIRATORIO PORCINO
El complejo respiratorio porcino (CRP), es una composición de enfermedades

que pueden manifestarse de manera independiente; o más frecuentemente, como una
infección de etiología mixta relacionada con al menos 3 agentes infecciosos entre
víricos y bacterianos. Por lo general, se detectan patógenos tales como el virus de la
enfermedad de Aujeszky, virus de la enfermedad del ojo azul, Circovirus porcino tipo
2, virus de la Influenza porcina, Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida,
3
Streptococcus suis, A. pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis y Salmonella
cholerasuis. La enfermedad en campo afecta principalmente a cerdos en crecimiento
y engorde manifestándose de manera variada por su naturaleza polietiológica; aunque
el signo más evidente es la tos, cuya intensidad representa un aspecto muy importante
en el diagnóstico de la infección (Bochev, 2007).
La emergencia y desarrollo del CRP están asociados con la penetración del
virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS) a las granjas
porcícolas, así como la ocurrencia del Síndrome Multisistémico de Desmedro Post-
destete (PWMS), asociado generalmente al Circovirus porcino (Morozov et al.,
1998).
2.3 Actinobacillus pleuropneumoniae
2.3.1 Características generales
Conocido como App, el A. pleuropneumoniae es un patógeno exclusivo del

ganado porcino, perteneciente a la Familia Pasteurellaceae (Di Bonavenura et al.,
2010), encapsulado y no esporulado cuya estructura se adapta al modelo general de
las bacterias gram negativas (Figura 1). Invade tonsilas y tracto respiratorio, por lo
que puede ser aislado de la cavidad nasal, tonsilas, oído medio y pulmones de
animales infectados (Sidibé et al., 1993; Duff et al., 1996; Williams y col, 2000)
A la altura de sus primeros aislamientos fue asignado al género Haemophilus
con la denominación de H. parasuis, H. parahaemolyticus y H. pleuropneumoniae
(Schiefer et al., 1974; Sanford and Josephson, 1981). Posteriormente; gracias al
trabajo de Pohl et al. (1983), se pasó a incluirlo dentro del género Actinobacillus (A.
pleuropneumoniae, comb. nov.) tras demostrarse su estrecha relación con el
Actinobacillus lignieresii, sobre la base de sus características fenotípicas y secuencias
nucleotídicas mediante hibridaciones ADN-ADN. Por lo tanto, su clasificación
taxonómica vigente se considera como sigue:
4
a. b.
c. d.
Figura 1. Microscopía electrónica del A. pleuropneumoniae. (a) Cápsula, barra 200

nm (Rioux et al., 2000), (b) Fimbrias, barra 200 nm (Boekema et al., 2004), (c, d)
Apéndice flagelares, barra 500 nm (Negrete-Abascal et al., 2003).
5
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pasteurellales
Familia: Pasteurellaceae
Género: Actinobacillus
Especie: A. pleuropneumoniae
Morfológicamente, se presenta al microscopio como pequeñas células en

forma de varas o esferas (0,4 x 1 µm) acomodadas solas o en cadenas.
Bioquímicamente, es anaerobio facultativo y quimiorganotrófico con patrones
metabólicos definidos de respiración y fermentación (Killian et al., 1978; Holt et al.,
1994; Xu et al., 2008) (Tabla 1).
2.3.2 Serotipos
Sobre la base de diferencias en sus polisacáridos de cápsula principalmente

(Apartado 2.3.4.2) y lipopolisacáridos, se han establecido 15 serotipos para el A.
pleuropneumoniae (Blackall et al., 2002; Koyama et al., 2007), existendo también los
subtipos a y b para cada uno de los serotipos 1 (1a y 1b) (Jolie et al., 1994) y 5 (5a y
5b) (Nielsen, 1986). La dependencia de estos serotipos por el factor V-dinucleótido
de adenina y nicotinamida (NAD) para su crecimiento in vitro, ha permitido
agruparlos en 2 biotipos; biotipo 1 o dependiente de NAD (serotipos 1-12 y 15) y
biotipo 2 o independiente de NAD (serotipos 13 y 14). Aunque existen cepas no
serotipificables del A. pleuropneumoniae o de serotipificación imprecisa, todas estas
son capaces de desencadenar la enfermedad en campo y/o experimentalmente de
manera individual o concomitante (Marois et al., 2009; Ohba et al., 2008). Esta
diversidad ha dificultado el éxito en los procesos de vacunación, debido a que
vacunas de células completas generalmente confieren protección contra el serotipo
homólogo (Nielsen, 1984; Jolie et al., 1995), lo que a su vez desencadenó el
6
desarrollo de nuevos inmunógenos como potenciales antígenos vacunales (Apartado
2.4.7).
2.3.3 Genoma
El genoma del A. pleuropneumoniae es circular como se muestra en la Figura

2, cuya homogeneidad genética entre serotipos se evidenció gracias a los primeros
mapas físicos y genéticos de los serotipos 1 y 7 (Oswald et al., 1999). Actualmente,
se conocen las secuencias completas de los genomas de los serotipos 3 (Xu et al.,
2008), 5b (Foote et al., 2008) y 7 (Buettner et al., 2008, sin publicar), encontrándose
en el GenBank® bajo los códigos de CP000687.1, CP000569.1 y CP001091.1, cuyos
tamaños son de 2.24, 2.27 y 2.33 Mpb; respectivamente, los cuales concuerdan con
los resultados del trabajo de Chevallier et al. (1998), quienes usando la técnica de
digestión cromosomal y análisis por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE),
determinaron un tamaño aproximado de 2.3-2.4 Mpb para los genomas de los
serotipos 1-12.
ADN plasmídico también ha sido identificado (Kang et al., 2009; Chang et
al., 2002), con tamaños de hasta 6.0 Kb conteniendo genes de resistencia a
antibióticos.
2.3.4 Factores de virulencia
Varios productos (factores secretados) como estructuras (factores no

secretados) han sido descubiertos como importantes factores de virulencia en el A.
pleuropneumoniae. La presencia y localización de algunos genes asociados a estos
factores; así como su comparación, han sido documentados en el trabajo de Oswald et
al. (1999).
7
Tabla 1. Características bioquímicas del A. pleuropneumoniae biotipo 1 (Killian
et al., 1978)
Reacción Resultado Reacción Resultado

Requerimiento de factor V (NADª) + Maltosa +
Porfirina a partir de ácido δ-aminolevulínico + Melibiosa -
Indol - Sucrosa +
Ureasa + Trealosa -
Ornitina descarboxilasa - Melisitosa -
Lisina decarboxilasa - Rafinosa -
Arginina dihidrolasa - Inulina -
Hemólisis (sangre de cordero) + Almidón, soluble -
Reacción CAMPb (sangre de cordero) + Esculina -
Catalasa + Salicina -
Oxidasa - Adonitol -
β-galactosidasa + Dulcitol -
α-fucosidasa - Glicerol -
Fosfatasa alcalina + meso-Eritritol -
L-arabinosa - Manitol +
D-ribosa + Sorbitol -
D-xilosa + Inositol -
L-ramnosa - Xilitol -
D-galactosa + Acético
Ácidos finales
Ácido a partir de glucosa + Láctico
Gas a partir de glucosa - Caldo glucosa Succínico

D-fructosa + Celobiosa -
D-manosa + Lactosa 1% -
Sorbosa - Lactosa 5% -
ª Las cepas del biotipo 2, son no-dependientes de NAD.

b
CAMP: Christie-Atkins-Munch-Petersen.
8
2.3.4.1 Exotoxinas
Cuatro diferentes toxinas pertenecientes a la familia de porinas RTX (Repeat

in the toxin), han sido descubiertas en el A. pleuropneumoniae, cuya denominación
actual y uniforme; según Frey et al. (1993), es de toxinas Apx. Las toxinas RTX se
encuentran ampliamente distribuidas entre las bacterias de la Familia Pasteurellaceae
y demuestran algún tipo de actividad citotóxica o citolítica (Chien et al., 2009; Frey
and Kuhnert, 2002); por lo tanto, el patrón fenotípico en la expresión de las Apx,
determina el grado de virulencia entre los diferentes serotipos de este patógeno. Así,
conociendo que ApxI es fuertemente hemolítica y citotóxica, ApxII débilmente
hemolítica y débilmente citotóxica, y ApxIII no hemolítica pero fuertemente
citotóxica (Beck et al., 1994), se puede discernir que los serotipos más virulentos son
aquellos productores de ApxI (1, 5, 9, 10 y 11). ApxIV es la cuarta y última toxina
RTX identificada en el A. pleuropneumoniae. Es una proteína de 202 kDa cuya
actividad biológica y función aún no es clara, aunque su expresión recombinante en
E. coli mostró actividad débilmente hemolítica y sinergismo co-hemolítico con la
esfingomileinasa (β-toxina) del Staphilococcus aureus (S. aureus), conocido como
efecto CAMP (Schaller et al., 1999). Es altamente inmunogénica, por lo que se
podría inferirir que es capaz de desencadenar niveles de anticuerpos vacunales que
confieran un alto grado de protección contra el reto de campo con cualquiera de los
serotipos, como fuese demostrado por Wang et al., 2009. Comparada con ApxI,
ApxII y ApxIII, ApxIV es única en las siguientes características: (i) es producida por
todos los serotipos del App; (ii) se expresa solamente in vivo, inducción esencial en la
expresión máxima de la patogenicidad del App (Liu et al., 2009); (iii) es altamente
específico del A. pleuropneumoniae.
En general, las toxinas RTX son codificadas por operones policistrónicos de 4
genes contiguos arreglados en el orden CABD, donde A codifica la pretoxina
funcional, C codifica una proteína involucrada en la activación post-traduccional de
la pretoxina y B y D, codifican las proteínas asociadas a membrana para efectos de
secreción específica tipo I, las cuales ubican activamente las toxinas Apx en el medio
9
exterior. Los operones apx son estables en cepas de un serotipo dado por lo que
pueden ser correlacionados con aislamientos bacterianos según su producción
toxigénica inherente (Figura 3). ApxI y ApxIII son determinadas genéticamente por
los operones apxICABD y apxIIICABD; respectivamente (Jansen et al., 1993a,
1993b; Jansen et al., 1994), mientras que ApxII es determinada por apxIICA (Tu et
al., 1994), careciendo de B y D para su secreción, lo que sugiere la complementación
en trans con los productos de los genes toxigénicos acompañantes. En tanto que
ApxIV, es determinada por un solo gen, apxIVA (Schaller et al., 1999).
2.3.4.2 Polisacáridos capsulares (CPS)
La membrana externa de muchas bacterias gram negativas, está cubierta por

una cápsula compuesta de polisacáridos (CPS). En el A. pleuropneumoniae, esta
estructura está bien definida con un tamaño de 80-230 nm (Figura 1a), dependiendo
del serotipo (Jacques et al., 1988; Rioux et al., 2000) representando a su vez sus
antígenos principales de clasificación serológica (Bossé et al., 1990). La cápsula
representa un importante factor de virulencia determinante permitiendo la entrada del
A. pleuropneumoniae al hospedador y evasión de sus defensas. En el trabajo de Ward
and Inzana (1994), se demostró que los anticuerpos específicos contra los CPS de
este patógeno, no promueven su lisis mediada por complemento; mientras que en el
trabajo de Bandara et al. (2003), se encontró una relación directa entre la cantidad de
CPS y el grado de virulencia de la bacteria.
Los determinantes genéticos de los CPS en el A. pleuropneumoniae,
comprenden genes para su biosíntesis (cps) y exportación (cpx). El operón de
exportación; cpxDCBA, se encuentra sobre la hebra opuesta corriente arriba del
operón de biosíntesis, cpsABCD. Sobre la base de sus secuencias, cpx demuestra un
alto grado de identidad entre serotipos, en contraste con la baja homología de las
regiones cps (Ward and Inzana, 1997; Schuchert et al., 2004; Jessing et al., 2008; Xu
et al., 2008), sugiriendo que la diversidad de serotipos, se relaciona directamente con
las regiones de biosíntesis. La clasificación actual de los marcos de lectura abiertos
10
(ORF) de las regiones cps en los serotipos hasta ahora investigados, corresponde a la
descripción de Jessing et al. (2008) (Figura 4), según su organización genética.
2.3.4.3 Lipopolisacáridos (LPS)
Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas principales asociadas a las

membranas de las bacterias gram negativas, compuestas de tres regiones bien
definidas: (i) lípido A, anclado en la membrana externa, (ii) core oligosacárido que
contiene ácido 2-ceto-3-deoxioctulosónico (Kdo) y residuos de heptosas, y (iii)
antígeno “O”, el cual es un polisacárido que consiste de unidades repetidas (Edrrige
et al., 2002). En el A. pleuropneumoniae, la caracterización inicial de estos LPS
según su composición de azúcares, reveló 3 tipos de estructuras que pudieron ser
clasificadas en lisas (serotipos 2, 4, 7), rugosas (serotipos 3, 6) y semirugosas
(serotipos 1, 5) (Byrd and Kadis, 1989), las cuales se traducen en diferencias
fenotípicas en las colonias de estos serotipos. Posteriormente, con la caracterización
parcial de estas estructuras en los serotipos 1, 2, 5a, 5b (Altman et al., 1986; Altman
et al., 1990; St. Michael et al., 2004), 4 (Altman et al., 1989a), 6 (Altman et al.,
1989b), 8 (cita de Perry et al., 2005), 9, 11 (Beynon et al., 1992), 13 (MacLean et al.,
2004) y 15 (Perry et al., 2005), se logró dilucidar el papel del componente “O” en los
procesos de aglutinación inespecífica durante la serotipificación convencional, así
como del componente “A” en la adherencia al tejido del hospedador. Al respecto,
varias líneas de evidencia han demostrado la capacidad del A. pleuropneumoniae de
interactuar a nivel in vitro con anillos traquelaes (Bélanger et al., 1990), secreciones
del tracto respiratorio (Bélanger et al., 1994), células epiteliales del tracto respiratorio
(Paradis et al., 1994; Auger et al., 2009); así como hemoglobina porcina a través del
lípido A (Bélanger et al., 1995), sustentando no solo la connotación asignada
cronológicamente de adhesina primaria, sino representando un importante medio de
adquisición de hierro a nivel in vivo, vital para su supervivencia y establecimiento de
la infección. Su papel de endotoxina también provoca una fuerte estimulación
11
inmunológica capaz de disminuir las lesiones en la infección neumónica, como se ha
demostrado en modelos murinos (Rioux et al., 1997) y porcinos (Rioux et al., 1998).
2.3.4.4 Sistemas de captación de hierro
El hierro es uno de los nutrientes que; de no ser adquirido a partir del

hospedador, puede inhibir el crecimiento y establecimiento de la infección
patogénica. En respuesta a estas limitaciones, el A. pleuropneumoniae puede captar
hierro de la hemoglobina liberada a partir de los eritrocitos lisados por acción de sus
hemolisinas (Apartado 2.3.4.3), involucrando específicamente el lípido A de sus LPS
(Bélanger et al., 1995). Sin embargo, se conoce que utiliza otras fuentes alternativas
de hierro incluyendo transferrina porcina (D’Silva et al., 1995) y sideróforos
exógenos como hidroxamato y catecol (Diarra et al., 1996). Mientras que los
receptores específicos para la transferrina (TbpA y TbpB) se expresan en condiciones
restrictivas del metal (Ricard et al., 1991), el receptor específico tipo ferricromo
(FhuA), no es regulado por el hierro (Mikael et al., 2003). Debido a estos resultados
contrastantes y para entender mejor los mecanismos usados por el A.
pleuropneumoniae para direccionar la restricción del hierro hacia una ganancia de
estrategias patogénicas, en el trabajo de Deslandes et al. (2007) se evaluó su perfil
transcripcional imitando el medio ambiente bajo condiciones restringidas de hierro,
encontrándose un total de 92 genes expresados debido a estas condiciones, lo que
sugiere la existencia de nuevos sistemas potenciales para la adquisición del metal en
esta bacteria.
2.3.4.5 Organelos de superficie
Aunque el A. pleuropneumoniae había sido descrito como no motil e incapaz

de producir apéndice locomotores, Negrete-Abascal et al. (2003), demostraron la
presencia de estructuras polares emergentes de las superficies celulares bacterianas
(Figura 1b, c) involucrados en la motilidad bacteriana in vitro, compuestas por
12
proteínas de 65 KDa y una identidad del 100% en sus secuencias aminoacídicas N-
terminales con las flagelinas de otros patógenos gram-negativos. Por otro lado, la
presencia de fimbrias tipo IV (Tfp) han sido identificadas por microscopía electrónica
exhibiendo una arquitectura común de proteínas cuyo promotor presenta una
organización genética de 4 genes contiguos; apfABCD (Zhang et al., 2000; Boekema
et al., 2004), similar a la de bacterias relacionadas. La presencias de estos apéndices
extracelulares se relaciona directamente con la adherencia, colonización y
supervivencia del A. pleuropneumoniae en el tracto respiratorio del porcino.
2.3.4.6 Quorum sensing
El Quorum sensing es un término que describe la comunicación entre

bacterias dentro de una población, basada en la secreción de pequeñas moléculas que
funcionan como autoinductoras para tomar decisiones colectivas (Boyen et al., 2009).
Estas moléculas y genes codificantes para los componentes del Quorum sensing, han
sido reportadas en el A. pleuropneumoniae donde están involucrados en la formación
de biofilms. En los trabajos de Buettner et al. (2008) y Li et al. (2008), se demostró
que la deleción en arca y luxS; respectivamente, de vital importancia en la formación
de biolfilms en muchas especies bacterianas que los utilizan para adherirse al órgano
blanco, actúan en detrimento del crecimiento bacteriano, sugiriendo que son un
factores de regulación importantes para diferentes comportamientos incluyendo la
formación de biofilms.
Como importante factor de virulencia contribuyendo a la colonización del
tejido blanco en el hospedador, esta formación de biofilms en el A. pleuropneumoniae
fue recientemente reportada como prevalente en aislados de campo (Kaplan and
Mulks, 2005).
13
Figura 2. Representación gráfica del genoma circular del A. pleuropneumoniae,
aislado JL03. Los círculos están numerados del 1 (círculo externo) al 10 (círculo
interno). Todos los genes están coloreados de acuerdo a su función biológica: oro
para traducción, estructura ribosomal y biogénesis; naranja para procesamiento y
modificación del RNA; naranja claro para transcripción; naranja oscuro para
replicación, recombinación y reparación del ADN; blanco opaco para división celular
y cromosomal; rosado para mecanismos de defensa; tomate para señales de
transducción; pera para biogénesis de envoltura celular y membrana externa; rosado
profundo para tránsito intracelular, secreción y transporte vesicular; verde pálido para
modificaciones post-traduccionales, rotación de proteínas y chaperonas; azul rey para
producción y conversión de energía; azul para metabolismo y transporte de
carbohidratos; azul gandul para metabolismo y transporte de aminoácidos; azul cielo
para metabolismo y transporte de nucleótidos; azul claro para metabolismo de
coenzimas; siena para metabolismo de lípidos; morado para metabolismo y transporte
de iones inorgánicos; aguamarina para biosíntesis, transporte y catabolismo de
metabolitos secundarios; gris para función desconocida (Xu et al., 2008).
14
a. apxI apxII apxIII Serotipos
C A B D C A 1, 5, 9, 11
B D C A C A B D 2, 4, 6, 8
C A C A B D 3
B D C A 7, 12
C A B D 10
b. apxIVA
ORF1 A lacZ 1-15
Figura 3. (a) Esquema de los operones de las toxinas RTX ApxI, ApxII, ApxIII
(Frey et al, 1993; Beck et al., 1994) y (b) ApxIV (adaptado de Schaller et al., 1999)
en cepas de referencia de A. pleuropneumoniae. Las figuras grises representan los
extremos truncados 3’ de apxIA y 5’ de apxIIB.
2.3.5 Identificación
2.3.5.1 Bacteriológica
Se considera relativamente fácil el aislamiento del A. pleuropneumoniae a

partir de lesiones neumónicas frescas (animales recientemente muertos), en contraste
con las lesiones crónicas. Su detección e identificación in vitro se basa en el
aislamiento bacteriano en medios sólidos tales como agar sangre o agar chocolate,
15
debidamente suplementados con complejos vitamínicos; y en caso de ser necesario,
con algunos agentes inhibidores. Al cabo de 48 horas, las colonias son pequeñas,
redondas y opacas (Holt et al., 1994). El agar sangre es utilizado para observar el
fenómeno del satelitismo en dirección perpendicular a la estría nodriza de alguna
colonia hemolítica; generalmente S. aureus. La caracterización del agente se realiza
mediante reacciones bioquímicas (Tabla 1), resaltando la presencia de fuerte reacción
ureásica y capacidad hemolítica por acción sinérgica de sus toxinas con otra de
estirpe β del S. aureus conocido como efecto CAMP (Frey et al., 1994; Schaller et al.,
1999). Para el aislamiento exitoso del A. pleuropneumoniae, se deben colectar
muestras que contengan lesiones compatibles con la pleuroneumonía porcina, siendo
conservadas refrigeradas en vez de congeladas.
El diagnóstico bacteriológico ha sido bien complementado por el desarrollo de
técnicas moleculares; de las cuales, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
la más utilizada (Apartado 2.3.5.3).
2.3.5.2 Inmunológica
Anticuerpos contra A. pleuropneumoniae pueden ser detectados en el suero

sanguíneo de animales enfermos o portadores sanos a partir de la 2ª-3ª semanas post-
infección (Dreyfus et al., 2004), tema que se tratará en el Apartado 2.4.5, siendo ésta,
la inmunidad humoral, la necesaria frente a la agresión por el App.
2.3.5.3 Molecular
El A. pleuropneumoniae es capaz de persistir en los tejidos; particularmente

en la cavidad nasal, tonsilas y pulmones, por lo que su presencia puede ser revelada
por técnicas moleculares específicas. El diagnóstico por PCR ha sido más específico
en comparación con las pruebas serológicas (Apartado 2.4.5) al usar secuencias
génicas bien definidas, propiciadas por los avances en la genética molecular del App.
16
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Tipo I
cps1A cps1B
Serotipo 1
Serotipo 12 cps12A cps12B
Tipo II
cps5A cps5B cps5C cps5D
Serotipo 5a
Tipo III
cps2A cps2B cps2C cps2D

Serotipo 2
Serotipo 6 cps6A cps6B cps6C cps6D cps6E
Serotipo 7 cps7A cps7B cps7C cps7D
Serotipo 8 cps8A cps8B cps8C cps8D
Figura 4. Diagrama de la organización genética de la región de ADN involucrada en

la biosíntesis de CPS en diferentes serotipos del A. pleuropneumoniae. Las flechas
indican la localización y dirección de transcripción de los genes cps. Las flechas
azules y verdes representan marcos de lectura abiertos completos, mientras que las
flechas grises representan genes incompletos (Jessing et al., 2008)
En los trabajos de Schaller et al., 2001; Xiao et al., 2006 y Serrano-Rubio et

al. (2008), se desarrollaron técnicas de amplificación molecular; todas con diferentes
niveles de sensibilidad, capaces de detectar la especie A. pleuropneumoniae a partir
de tejidos y secreciones, pero con la limitante epidemiológica de no discriminar el
17
serotipo específico de la infección. Sobre estas limitantes, varias técnicas de PCR han
sido desarrolladas para identificar el serotipo específico dependiendo principalmente
de la prevalencia regional y/o reacciones cruzadas inespecíficas entre algunos de
ellos. En la Tabla 2 se presentan las técnicas de PCR múltiple hasta el momento
desarrolladas para la identificación de serotipo, resaltando la ausencia de una prueba
específica para los serotipos 1, 5 y 7, motivo de estudio en este trabajo.
2.4 PLEURONEUMONÍA PORCINA
2.4.1 Definición e importancia
La pleuroneumonía es la inflamación de los pulmones y de la membrana que

los recubre. En el ganado porcino, es causada por el A. pleuropneumoniae, siendo una
enfermedad que ocasiona considerables pérdidas económicas debido a la mortalidad
generada, retardo en el crecimiento, pobre valor de la canal al momento del beneficio
y costos por tratamientos y asistencia veterinaria. Además, es una de las infecciones
de mayor impacto asociadas al CRP (Apartado 2.2).
2.4.2 Epidemiología
La pleuroneumonía porcina es una enfermedad ligada a la producción

intensiva, siendo el cerdo el único hospedador natural del A. pleuropneumoniae,
aunque experimentalmente, cobayos, ratas y ratones han representado buenos
modelos para la forma aguda de la enfermedad (cita de Rodríguez y col, 2002). La
enfermedad afecta a animales de cualquier edad y se encuentra distribuida en el
ámbito mundial con la presencia de uno o más serotipos en una misma granja o un
mismo país. En la Tabla 3 se muestra el predominio de serotipos del App en varios
países, aunque esto no descarta la presencia de algún otro, además de los
predominantes.
18
Tabla 2. Técnicas de PCR múltiple desarrolladas para el diagnóstico del A.
pleuropneumoniae.
Serotipos Blanco Productos (pb) Muestra Fuente

Región cps 1114 Pulmón e Lo et al.,
5
Región cpx 715 hisopado nasal. 1998.
Región omlA 950
500 (App 2) Jessing et al.,
2, 5 y 6 Cultivo puro.d
Región cps 1114a (App 5) 2003.
720 (App 6)
Región cpx 489
1603 (App 1) Schuchert et
1, 2 y 8 Cultivo puro.
Región cps 1725 (App 2) al., 2004.
977 (App 8)
723, 811, 965, 2400 (App 1)
811, 965, 396, 2800 (App 2)
965, 396, 2400 (App 3)
811, 965, 396, 1600 (App 4)
723, 811, 965, 2800 (App 5a)
723, 811, 965, 2800 (App 5b)
811, 965, 396, 2000 (App 6)
Cultivo puro e
811, 965, 2800 (App 7) Rayamajhi et
1-15b Región apx hisopado
811, 965, 396, 2800 (App 8) al., 2005.
pulmonar.
723, 811, 965, 1600 (App 9)
723, 811, 2800 (App 10)
723, 811, 965, 1600 (App 11)
811, 965, 2400 (App 12)
811, 965, 2400 (App 13)
723, 811, 2400 (App 14)
811, 965, 396, 2800 (App 15)
Región Cultivo puro,
346
apxIVA mixto, pulmón Xiao et al.,
1-10
e hisopados 2006.
Región omlA 950c
nasal y tonsilar.
Región omlA 950c
754 (App 1) Angen et al.,
1, 7 y 12 Cultivo puro.
Región cps 396 (App 7) 2008.
559 (App 12)
Región
417e
apxIVA
Zhou et al.,
3, 6 y 8 921 (App 3) Cultivo puro.
2008a.
Región cps 718 (App 6)
1106 (App 8)
a
Se utilizaron los primers de Lo et al., 1998.
b
Los serotipos de las casillas sin color poseen un patrón único de amplificación. Los serotipos de las
casillas con color, comparten el patrón de amplificación. Al igual que en el trabajo de Sthitmatee et
al., 2003; quienes no usaron cepas de referencia de los serotipos 13, 14 y 15, no se pudieron
distinguir los serotipos 2-8, 5a-5b y 9-11.
c
Se utilizaron los primers de Jessing et al., 2003.
d
Cultivo de cepas de referencia o anteriores aislados de campo.
19
La transmisión de la pleuroneumonía porcina (A. pleuropneumoniae) se
realiza principalmente vía horizontal por contacto directo entre animales infectados y
susceptibles (Velthius et al., 2003). Se difunde rápidamente por aerosoles vía aérea en
cortas distancias, llegando a las piaras a través de la introducción de portadores
infectados (Apartado 2.4.3). Otros factores como el hacinamiento, las condiciones de
manejo y el transporte (ventilación, humedad, higiene, cambios bruscos de
temperatura o de alimentación), repercuten directamente como factores estresantes
facilitando la diseminación del patógeno.
2.4.3 Patogenia
La patogenia de la pleuroneumonía porcina solo se conoce parcialmente e

implica la participación de varias estructuras y productos del A. pleuropneumoniae,
así como otros propios del hospedador.
El App penetra en el cerdo por inhalación y coloniza las tonsilas y los
pulmones a nivel de bronquiolos terminales y alvéolos. En general, para la
colonización bacteriana se ha demostrado que el A. pleuropneumoniae es capaz de
unirse a células, anillos traqueales y secreciones del tracto respiratorio (Bélanger et
al., 1990; Bélanger et al., 1994; Paradis et al., 1994), así como células bucales
epiteliales (Hamer-Barrera et al., 2004) y hemoglobina (Bélanger et al., 1995) de
donde obtiene nutrientes a través del antígeno “O” de los LPS. En las vías
respiratorias bajas, factores del hospedador; tales como ciertos factores del mucus,
condicionan la adherencia del App. En los pulmones, las bacterias son fagocitadas
rápidamente por los macrófagos alveolares donde comienza la secreción de
exotoxinas, las cuales poseen efecto citotóxico contra ellos, siendo la ApxI y ApxIII
de particular efecto tóxico contra macrófagos alveolares (Chien et al., 2009; Beck et
al., 1994). Adicionalmente, los LPS activan la producción de citoquinas que
contribuyen al daño tisular (Huang et al., 1999).
El patógeno es capaz de persistir en el tracto respiratorio y otros órganos
durante semanas, conllevando a animales portadores clínicamente sanos,
20
considerados la principal fuente de diseminación de la enfermedad y aparición de
brotes (cita de Maas et al., 2006).
2.4.4 Patología
Aunque se considera que la pleuroneumonía porcina es una enfermedad

limitada al tracto respiratorio del hospedador; tal y como su nombre lo sugiere,
actualmente existe evidencia que indica la patogenicidad del A. pleuropneumoniae en
otros órganos tales como médula ósea (Jensen et al., 1999), hígado, bazo (Ohba et al.,
2008), sistema nervioso central, riñón (Madsen et al., 2001), corazón (Buttenschøn et
al., 1997) y articulaciones (Brandreth and Smith, 1987), produciendo osteomilitis,
hepatitis, esplenomegalia, meningitis, nefritis, endocarditis, pericarditis fibrinosa,
artritis purulenta y tenosinovitis; respectivamente.
A nivel de sistema respiratorio, la pleuroneumonía porcina se caracteriza por
presentar lesiones macroscópicas que varían dependiendo de la severidad del proceso.
En la forma aguda, los cerdos presentan fiebre, depresión y anorexia, con
sintomatología respiratoria manifestada por tos, cianosis y respiración oral. A la
necropsia, los pulmones de estos animales aparecen con áreas de consolidación
delimitadas o difusas y de color rojo oscuro pudiendo abarcar los lóbulos apical,
cardiaco y/o diafragmático, características de una neumonía hemorrágica necrotizante
que se acompaña con pleuritis fibrinosa (cita de Coelho et alli., 2004).
Las formas sub-aguda y crónica se desarrollan generalmente a partir del
proceso agudo; y en ellas, la tos intermitente, pérdida del apetito y reducción de la
velocidad del crecimiento son los síntomas más frecuentes. Las lesiones
macroscópicas se evidencian por áreas de consolidación pulmonar de apariencia
nodular de tamaño variable. Al corte, se puede observar que dichos nódulos están
compuestos por tejido necrosado. A nivel de la pleura, ésta aparece con una
inflamación adhesiva local, que muchas veces puede ser la única lesión detectable.
21
2.4.5 Diagnóstico
El diagnóstico rápido y certero de la enfermedad es crucial para controlar la

enfermedad.
El diagnóstico integral de la pleuroneumonía porcina se basa en la
observación en campo de la sintomatología y patología clínica (Apartado 2.4.4),
complementado con el aislamiento e identificación in vitro del A. pleuropneumoniae
a partir de tejido con lesiones compatibles de la enfermedad (Apartado 2.3.5.1),
constituyendo el diagnóstico de certeza aunque no discrimina entre serotipos, a
menos que se utilicen técnicas moleculares para identificar el serotipo actuante. Sin
embargo, el monitoreo serológico ha sido la metodología rutinaria para detectar la
infección en granjas porcícolas, incluyendo aquellas subclínicas o asintomáticas.
Hasta ahora, varias técnicas serológicas han sido desarrolladas para detectar
anticuerpos anti A. pleuropneumoniae tales como ELISA, incluyendo aquellas para
detectar anticuerpos contra todos los serotipos (Wang-wang et al., 2008; Dreyfus et
al., 2004), así como para serotipos específicos; individual (Klausen et al., 2007) o
combinadamente (Bossé et al., 1990). Estas metodologías no son suficientes para
realizar diagnósticos etiológicos en casos agudos, por lo tanto, deben utilizarse de
forma combinada.
2.4.6 Tratamiento
Varios medicamentos y estrategias terapéuticas han sido utilizados para el

tratamiento de la enfermedad (Fittipaldi et al., 2005; Lauritzen et al., 2005). Aunque
debe destacarse los cambios en la resistencia a los antibióticos (Gutiérrez-Martín et
al., 2006; Matter et al., 2007), probablemente debido al uso indiscriminado y
prolongado de estos medicamentos. En contraste, en el trabajo de Ramjeet et al.
(2005), se encontró que el truncamiento de residuos específicos en los
lipopolisacáridos del A. pleuropneumoniae, afecta la susceptibilidad a los péptidos
22
catiónicos, sugiriendo que un core externo intacto en los LPS es esencial para su
protección contra estos antimicrobianos.
2.4.7 Prevención y control
Ningún antígeno individual ofrece protección completa contra los 15 serotipos

del App, lo que sugiere que una eficiente protección cruzada sería conferida por
vacunas compuestas de múltiples antígenos; sin embargo, la vacunación no es capaz
de proteger a los animales de la colonización bacteriana (Oldfield et al., 2009). Al
respecto, varios antígenos y estrategias de inmunización han sido investigados como
candidatos vacunales, incluyendo toxinas Apx (Haga et al., 1997), LPS y CPS (Byrd
and Kadis, 1992), proteínas de membrana externa (OMPs) (Oldfield et al., 2008),
proteínas autotransportadoras (Oldfield et al., 2009), así como vacunas DNA (Chiang
et al., 2009), vacunas subunitarias DIVA (Maas et al., 2006) y mutantes por deleción
génica (Liu et al., 2007); que logran discriminar animales vacunados e infectados en
campo, y protocolos a diferentes dosis (Bernardy et al., 2008).
23
Tabla 3. Distribución de serotipos del A. pleuropneumoniae por países (Tomado y
adaptado de Vanden Bergh et al., 2008).
País Serotipos
Alemania 2, 7, 9
Australia 12 (41 %), 1 (30 %), 7 (24 %)
Bélgica 2 (36 %), 3 (21 %), 9 (15 %), 5b (10 %)
Corea 2 (56 %), 5 (28 %), 6 (11 %), 7 (2 %)
Croacia 2, 9
Dinamarca 2 (84 %), 6 (11 %)
España 4 (42,2 %), 7 (22,5 %), 2 (12,8 %)
Estados Unidos 1, 5
Francia 9
Hungría 2, 3, 7
Irlanda 3
2 (52,5 %), 1 (36,3 %), 5 (6,2 %),
Japón 7 (1,5 %), 8 (1,5 %), 3 (1,4 %), 12 (0,5 %)
Noruega 2
Países Bajos 2, 9, 11
Polonia 1, 9
Canadá 1 (68 %), 5 (23 %), 3-6-7-8-10-12 (9 %)
Reino Unido 2, 3, 8
Suecia 2
Suiza 2
9 (46,5 %), 2 (18,5 %), 11 (14,2 %),
República Checa 4-5-7-12 (2,4 %)
24
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Detectar e identificar simultáneamente y discriminar los serotipos 1, 5 y 7;

respectivamente, de la especie A. pleuropneumoniae, mediante la amplificación
concomitante de los genes apxIVA y cps por técnicas de PCR múltiple, orientadas al
oportuno e integral diagnóstico de la pleuroneumonía porcina y su potencial
aplicación sobre especímenes clínicos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Aplicar herramientas computacionales a la búsqueda y análisis de secuencias

nucleotídicas pertenecientes al A. pleuropneumoniae.
 Estudiar y/o diseñar primers específicos para la detección molecular de la
especie A. pleuropneumoniae y primers específicos para la identificación
molecular de los serotipos 1, 5 y 7, respectivamente.
 Establecer las condiciones químicas y térmicas óptimas para la amplificación
simultánea de las regiones especie-específica y serotipo-específicas en el A.
pleuropneumoniae.
 Evaluar la especificidad analítica in silico e in vitro de los primers utilizados
para la detección e identificación de las regiones específicas de especie y
serotipo, respectivamente.
 Determinar las cantidades mínimas de ADN detectables por las técnicas de
PCR múltiple desarrolladas y optimizadas.
 Determinar la proporción de amplificación molecular de los genes apxIVA y
cps en cepas de campo colombianas del A. pleuropneumoniae y especímenes
clínicos de origen porcino.
 Determinar la proporción de aislamientos bacterianos positivos a la especie A.
pleuropneumoniae a partir de especímenes clínicos de naturaleza pulmonar.
25
 Comparar las técnicas de amplificación molecular múltiple; enfatizando en la
región especie específica, con el método de identificación bacteriológica
convencional, a partir de cepas de referencia y cepas de campo colombianas.
 Realizar un estimado comparativo entre las técnicas de amplificación
molecular y el método de aislamiento bacteriano a partir de especímenes
pulmonares con lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina.
26
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 EQUIPOS
Todos los equipos utilizados en este estudio hacen parte de los laboratorios de
microbiología y biología molecular. De propiedad del Instituto Colombiano
Agropecuario (ICA) y ubicados en el Laboratorio Nacional de Diagnóstico
Veterinario (LNDV), sus características y detalles se mencionan a continuación:
a. Incubadora 37°C Model 320 (NAPCO. Portland USA).

b. Plancha de calentamiento Model 2050 (BL. Melrose Park, USA).
c. Microcentrífuga refrigerada Model 5417R (EPPENDORF. Netheler, GER).
d. Espectrofotómetro Nanodrop 1000 (THERMO SCIENTIFIC. Waltham,
USA).
e. Ultracongelador -70°C Ultima II (REVCO. Asheville, USA).
f. Cabina de seguridad clase II PurifierTM (LABCONCO. Kansas, USA).
g. Cabina de flujo laminar vertical PCR Cabinet (ESCO. Changi, SIN).
h. Termociclador DNA Engine Dyad (BIO-RAD. Hercules, USA).
i. Fuente de poder Powerpack 3000 (BIO-RAD. Hercules, USA).
j. Cámara de electroforesis (BIO-RAD. Hercules, USA).
k. Fotodocumentador GelDocTM XR (BIO-RAD. Segrate, ITA).
4.2 CEPAS BACTERIANAS Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Se utilizaron 7 cepas de referencia representativas de los serotipos 1-7, así

como 15 cepas de campo colombianas representativas de los serotipos 1, 5 y 7 de la
especie A. pleuropneumoniae. Adicionalmente, se colectaron 7 cepas bacterianas
representativas de especies diferentes al A. pleuropneumoniae, algunas pertenecientes
al cepario del LNDV. Todos los aislados nacionales fueron en su momento
confirmados como A. pleuropneumoniae biotipo 1 (Killian et al., 1978) y
27
serotipificados mediante el método de aglutinación rápida en placa (Mittal et al.,
1982). El total de especies bacterianas y sus descripciones respectivas, se listan en la
Tabla 4.
En este estudio no se incluyeron los serotipos 8-15 del A. pleuropneumoniae,
debido a que no estuvieron disponibles durante el transcurso del proyecto.
Para el cultivo, todas las cepas dependientes de NAD se cultivaron sobre
placas estériles con agar base sangre (OXOID, UK. Cat. # CM0271) al 7% (v/v) de
sangre ovina, a las cuales se les imprimió una estría nodriza de S. aureus posterior a
la siembra de las cepas y se incubaron durante 48 horas (h) a 37°C (4.1a) bajo
condiciones de microaerofilia.
Las especies bacterianas diferentes al A. pleuropneumoniae, se cultivaron y
cosecharon siguiendo los protocolos operativos estandarizados (POEs) del LNDV.
4.3 ESPECÍMENES CLÍNICOS Y NO CLÍNICOS
Se incluyeron especímenes porcinos de naturaleza pulmonar (clínicos) (n =

100) recolectados en una planta de beneficio porcino en la ciudad de Bogotá y 15
hisopados (no clínicos o asintomáticos) entre nasales (n = 8) y tonsilares (n = 7)
recolectados en campo.
El tejido pulmonar se tomó directamente del paquete de vísceras rojas
mediante la escisión de áreas sobre el parénquima con lesiones aparentes de
pleuroneumonía porcina e inmediatamente depositadas individualmente en bolsas
estériles herméticas. La recolección de los tejidos se realizó en 4 días diferentes de la
semana, distribuidos equitativamente durante 1 mes.
El total de especímenes clínicos corresponde a la cantidad máxima permitida
por parte de la administración de la planta de beneficio, mientras que los hisopados
provinieron de animales asintomáticos como parte de un estudio anexo realizado en el
LNDV, lo cuales se procesaron mediante las técnicas desarrolladas y optimizadas en
este trabajo.
28
Tabla 4. Cepas bacterianas de referencia y cepas de campo utilizadas
para la estandarización de las técnicas de PCR.
Microorganismo Cepa Fuente

Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 4074 ATCCa
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 2 S 1536 ATCC
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 3 S 1421 ATCC
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 4 M62 ATCC
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5 K17 ATCC
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 6 Femo ATCC
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 WF83 España
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 Jun-25-99* LNDVb
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 Jun-26-99 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 7-IX-99 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 2-XI-00 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5 10-02-06 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5 27-X-06* LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5 31-X-06 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 14-X-99 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 Dic-24/99 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 17-08-00* LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 29-VIII-00 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 28-II-02 LNDV
Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 7 1-XII-05 LNDV
Staphylococcus aureus 12702 NCIMBc
Haemophilus parasuis 01-III-2006 LNDV
Streptococcus suis No. 702644 ATCC
Micoplasma hyopneumoniae 11-XII-2006 LNDV
Pasteurella multocida Jul-02-08 LNDV
Salmonella cholerasuis 13666 NCIMB
Escherichia coli 25922 ATCC
a
Cepas de referencia. ATCC, American-type Culture Collection.
b
Aislados de campo. LNDV, Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario.
c
Cepas de referencia. NCIMB, National Collection of Industrial Bacteria
* Cepas control positivo para la PCR.
29
Todos los especímenes se mantuvieron bajo condiciones de refrigeración (4-
8°C) hasta su llegada al laboratorio para su procesamiento.
4.4 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE LAS PCRs MÚLTIPLES
4.4.1 Análisis bioinformáticos
Como parte del componente bioinformático de este trabajo, se recurrió a las

bases de datos del Genbank® del servidor del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y EMBL del servidor del
Instituto Bioinformático Europeo (EBI) (http://www.ebi.ac.uk.embl/) para la
búsqueda de secuencias nucleotídicas pertenecientes al A. pleuropneumoniae. Las
secuencias escogidas se analizaron mediante los algoritmos Align del servidor NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y ClustalW del servidor EBI
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/).
El análisis de oligonucleótidos ya reportados (Tabla 2), se basó en el estudio
de sus características y propiedades mediante los programas Oligoanalyzer®
(http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/), así como su especificidad
in silico mediante la herramienta de búsqueda de alineamientos locales básicos
(BLAST) del servidor NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
4.4.2 Iniciadores
Se diseñaron cuatro diferentes parejas de iniciadores con el programa Primer3

versión 0.4.0 de libre acceso (http://frodo.wi.mit.edu), las cuales consistieron de 1
pareja para la detección de la especie A. pleuropneumoniae y 3 parejas adicionales
para la identificación de los serotipos 1, 5 y 7, respectivamente (Tabla 5).
30
Tabla 5. Secuencias y propiedades de los iniciadores utilizados para la detección e identificación simultánea y
discriminación del A. pleuropneumoniae, serotipos 1, 5 y 7.
% Tamaño del
# Nombre Función Secuencia (5’ → 3’) Longitud Tom Fuente
G+C producto
Este
1 ApToxIVF Forward GAC TGG GGA CGT AAC TCG G 19 60.52 63.13
trabajo
256 pb
Este
2 ApToxIVR Reverse CTC GGC TAA ACC AAA GTT CG 20 59.88 50.00
trabajo
Este
3 App1F Forward TGA TCC AGA TGA TTT TCT TAG CC 23 58.59 39.13
trabajo
430 pb
Este
4 App1R Reverse TTT CTC AGG CTT TTG CCA AG 20 60.49 45.00
trabajo
Este
5 App5F Forward GTA GCC ACA AGA CCC GAA TG 20 60.52 55.00
trabajo
824 pb
Este
6 App5R Reverse TCA AAT GCA GCT TCA AGG AG 20 59.15 45.00
trabajo
Este
7 App7F Forward GGC AGG CAG TAG ATT CTT GG 20 59.84 55.00
trabajo
629 pb
Este
8 App7R Reverse CCC CTG CTG CTC TAA CGT AT 20 59.36 55.00
trabajo
31
Se establecieron las siguientes propiedades como los criterios de selección de
los nuevos iniciadores: longitud, % G+C, tamaño del producto de amplificación,
formación de estructuras secundarias, Tom y especificidad in silico contra bases de
Se estableció la necesidad de diseñar nuevos iniciadores sobre el análisis de
los ya existentes y sus aspectos por mejorar respecto a los requerimientos óptimos
para su uso en las PCRs de tipo múltiple.
4.4.3 Extracción y preparación del ADN genómico
Se obtuvo el templado de ADN bacteriano para el desarrollo y optimización

de las PCRs múltiples a partir de cultivos puros de todas las cepas utilizadas en este
estudio (Tabla 4) mediante el método descrito por Jessing et al. (2003). Brevemente,
se tomaron asadas de cada uno de los aislados que se diluyeron individualmente en
200 µL de agua ultrapura (GIBCOTM, USA. Cat. # 10977023) contenida en tubos
libres de DNAsas y RNAsas con capacidad para 1.5 mL, los cuales se depositaron en
una plancha de calentamiento (4.1b) hasta alcanzar lentamente una temperatura de
100°C y se dejaron a dicha temperatura por 10 minutos, evitando que se abrieran las
tapas debido a la presión del vapor. Posteriormente, se retiraron y centrifugaron por 3
minutos a 14.000 x g (20.800 r.p.m) en una microcentrífuga refrigerada (4.1c).
Finalmente, se recuperó de cada uno de los tubos 180 µL del sobrenadante
conteniendo el ADN cuidando de no tomar el precipitado con los detritos celulares. El
material genómico se conservó sin diluir a -70°C hasta su análisis o posterior al
mismo.
Por otro lado, pequeñas cantidades (< 100 mg) de tejido pulmonar clínico se
sometieron al protocolo de extracción y purificación de ADN genómico con el kit
Easy-DNATM (INVITROGENTM, USA. Cat. # K1800-01) siguiendo las instrucciones
del fabricante, mientras que el ADN a partir de los hisopados se recibió directamente
purificado. Todos los templados se mantuvieron bajo las condiciones anteriormente
mencionadas hasta el momento de su uso.
32
4.4.4 Condiciones de las PCRs múltiples
Las técnicas de mPCR se realizaron a un volumen final de 25 µL conteniendo

cada una: (i) 1X de buffer PCR (PROMEGA, USA. Cat. # M8295 – Part. # M891A),
(ii) 0.4 mM de mezcla de deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs: dATP, dTTP, dCTP
y dGTP) (INVITROGENTM, USA. Cat. # 10297-018), (iii) 2.5 mM de MgCl2
(PROMEGA, USA. Cat. # M8295 – Part. # A351H), (iv) 0.04 U/µL de enzima Taq
polimerasa (PROMEGA, USA. Cat. # M8295 – Part. # M829B), y; dependiendo de la
mPCR en particular, se adicionaron los iniciadores (Tabla 5) en combinaciones de:
para App1, (v) 0.07 µM de ApToxIVF/R (c/u) y (vi) 0.6 µM de App1F/R (c/u); para
App5, (vii) 0.07 µM de ApToxIVF/R (c/u) y (viii) 0.6 µM de App5F/R (c/u); para
App7, (ix) 0.15 µM de ApToxIVF/R (c/u) y (x) 0.6 µM de App7F/R (c/u). Se agregó
finalmente 2 µL de templado de ADN sin diluir a cada una de las mezclas reactivas.
El perfil térmico optimizado para todas las mPCR consistió de: 94°C/5 min.,
seguido por 35 ciclos de 94°C/1 min., 58.5°C/1 min. y 72°C/1 min., con una
extensión final de 72°C/5 min. Como protocolo alternativo, se utilizó una temperatura
de 94°C/5 min., seguido por 35 ciclos de 94°C/1 min., 58.5°C/30 seg. y 72°C/1 min.,
con una extensión final de 72°C/5 min.
4.4.5 Visualización de los productos amplificados
La eficiencia de la amplificación se evaluó mediante electroforesis (4.1j) a

100 Voltios (V) durante 1 hora (4.1i) y visualización de los productos en gel de
agarosa (SIGMA, USA. Cat. # A6877) al 1.5% (p/v) en buffer TBE 0.5X (Anexo 1).
Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (10 mg/mL) (PROMEGA, USA. Cat. #
H5041).
Para las corridas electroforéticas se sembraron 10 µL del volumen final de
reacción (25 µL) y el tamaño de los productos se comparó contra un marcador de
peso molecular (MWM) con rango de 100 a 1500 pb (PROMEGA, USA. Cat. #
G2101). El resultado final de la electroforesis se fotodocumentó mediante la captura
33
de imágenes en alta resolución bajo luz ultravioleta (UV) (4.1k) utilizando el
programa Quantity One® para Windows® versión 4.2.1 (BIO-RAD, USA).
4.4.6 Especificidad analítica
Se evaluó la especificidad analítica de las técnicas moleculares (primers)

mediante la amplificación de material genómico del A. pleuropneumoniae, así como
de un grupo de especies bacterianas diferentes al agente infeccioso blanco (Tabla 4)
utilizando los protocolos químicos y térmico optimizados para esto (Apartado 4.4.4)
y visualización de los productos de amplificación como se mencionó anteriormente
(Apartado 4.4.5).
4.4.7 Sensibilidad analítica
Se determinó la sensibilidad analítica de las técnicas moleculares (mPCR)

mediante la amplificación por triplicado de material genético del agente infeccioso
diana a concentración inicial conocida (ng/µL) (4.1d), sometido a dilución
logarítmica en base 5 a punto final (1:1953125) y visualización de los productos de
amplificación diferenciables del resultado cero como se mencionó anteriormente
(Apartado 4.4.5).
4.4.8 Secuenciación de los productos amplificados
Se secuenciaron los productos de amplificación motivo de este estudio, de

entre 256 y 824 pb a partir de los iniciadores tanto F como R. La secuenciación se
realizó en Macrogen (Macrogen, KOR) por intermedio de la empresa CorpoGen
(CorpoGen, COL).
Se utilizó el software Bio-Edit para Windows® versión 7.0.9 (IBIS
BIOSCIENCES, USA) para la determinación de secuencias consenso y el algoritmo
ClustalW del servidor EBI para el alineamiento múltiple y determinación de
34
porcentajes de homología (identidad) cuando se compararon con aquellas reportadas
en las bases de datos públicas usando la herramienta BLAST.
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se calculó el coeficiente Kappa (K) con intervalo de confianza al 95% (IC

95%) para medir el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por el
método de identificación bacteriológica convencional y las técnicas alternativas de
mPCR; enfatizando en la detección especie-específica, usando el software Epi-InfoTM
versión 6.0.
Se determinaron además las características operativas de sensibilidad y
especificidad diagnósticas con base en una tabla de contingencia de 2x2 (Tabla 6).
Tabla 6. Tabla de contingencia para la comparación estadística entre

los resultados del aislamiento bacteriano y la mPCR.
Aislamiento bacteriano
Positivo Negativo Σ
PCR Positivo A (VP) B (FN) A+B
Múltiple Negativo C (FP) D (VN) C+D
Σ A+C B+D N
35
La sensibilidad (S) y especificidad (E) diagnósticas se calcularon usando las
siguientes fórmulas:
A
S=
AC
D
E=
BD
36
5. RESULTADOS
5.1 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE LAS PCRs MÚLTIPLES
5.1.1 Análisis de oligonucleótidos
Para el análisis de oligonucleótidos, se recopilaron y analizaron las técnicas de

mPCR existentes para el diagnóstico del A. pleuropneumoniae (Tabla 2). En esta
tabla se destaca el uso del gen apxIVA como diana especie-específica y los genes cps
como diana serotipo-específica. Cada una de estas parejas de oligonucleótidos se
sometió a análisis y comparación de sus propiedades físicas, como también a la
búsqueda de alineamientos locales básicos (BLAST).
Cuando se analizaron según el tamaño de su producto de amplificación, se
evidenció un rango de entre 346 a 417 pb para los iniciadores contra el gen apxIVA;
de 754 a 1.603 pb para los iniciadores dirigidos contra la región cps del App1; de
1.114 pb para los iniciadores dirigidos contra la región cps del App5, y de 396 pb
para los iniciadores dirigidos contra la región cps del App7. Cuando se analizaron
según su Tom; uno de los parámetros bajo el contexto de la mPCR, se encontró un
rango de 58.9 a 64.7°C para los iniciadores dirigidos contra el gen apxIVA; de 57 a
65.8°C para los iniciadores dirigidos contra la región cps del App1; de 65 a 65.8°C
para los iniciadores dirigidos contra la región cps del App5, y de 57.3 a 60.5°C para
los iniciadores dirigidos contra la región cps del App7. Se utilizaron los siguientes
valores como parámetros de trabajo: 0.4 µM de iniciadores y 1.5 mM de MgCl2.
Cuando se sometieron a la búsqueda de alineamientos locales básicos contra
bases de datos no redundantes, se encontraron reacciones cruzadas con diferentes
serotipos del App (resultados no publicados). Se utilizaron los siguientes valores
como parámetros de referencia: Database (others), Optimize for (somewhat similar
sequences) y Expect threshold (10.000).
En general, los oligonucleótidos reportados anteriormente para la detección e
identificación del A. pleuropneumoniae serotipos 1, 5 y 7, presentaron un rango de
37
amplificación de 346 a 1.603 pb, un rango de Tom de 57 a 66.7°C y alineamientos
con serotipos diferentes del App contra los cuales fueron diseñados originalmente,
motivo por el cuál se diseñó un nuevo set de iniciadores entre especie-específicos y
serotipo-específicos.
5.1.2 Diseño de iniciadores
Se diseñaron 4 parejas de iniciadores (Tabla 5) contra 2 regiones diferentes en

el A. pleuropneumoniae. La primera; especie-específica, y la segunda; serotipo-
.específica, basadas en las secuencias nucleotídicas reportadas en su momento en el
GenBank®. Estos iniciadores fueron seleccionados de tal manera que se pudieran
combinar de diferentes maneras sin que se afectara la visualización de los productos
finales; optimizando la diferencia entre el tamaño de los amplificados y la igualdad en
las temperaturas de anillaje, 2 parámetros de vital importancia bajo el contexto de las
mPCR.
Los iniciadores 1 y 2; denominados ApToxIVF y ApToxIVR, fueron
diseñados a partir de la secuencia consenso de las porciones 3’ del gen apxIVA en los
primeros 12 serotipos del A. pleuropneumoniae [GenBank® No. AF188858.1 (App1),
AF188857.1 (App2), AF188859.1 (App3), AF188860.1 (App4), AF188861.1
(App5a), AF188862.1 (App5b), AF188863.1 (App6), AF188864.1 (App7),
AF188868.1 (App8), AF188865.1 (App9), AF188869.1 (App10), AF188866.1
(App11), AF188867.1 (App12)]. Estos iniciadores alinearon en las posiciones 3-21
[(ApToxIVF) dirección 5’ → 3’] y 258-239 [(ApToxIVR) dirección 5’ → 3’],
resultando en un producto de amplificación de 256 pb (Figura 5).
Los iniciadores 3 y 4; denominados App1F y App1R, se diseñaron a partir de
la secuencia parcial de los genes cps del A. pleuropneumoniae serotipo 1 (GenBank®
No. AF518558.1), los cuales alinearon en las posiciones 2.832-2.854 [(App1F)
dirección 5’ → 3’] y 3.261-3.242 [(App1R) dirección 5’ → 3’], resultando en un
producto de amplificación de 430 pb (Figura 6).
38
la secuencia parcial de los genes cps del A. pleuropneumoniae serotipo 5a (GenBank®
No. AF053723.1), los cuales alinearon en las posiciones 1.641-1.660 [(App5F)
producto de amplificación de 824 pb (Figura 7). Esta región cps parcial; homóloga a
la región cps dentro del genoma completo del serotipo 5b (GenBank® No.
CP000569.1), se determinó mediante el algoritmo bl2seq, resultando en los
nucleótidos comprendidos entre las posiciones 1.804.208-1.809.296 de la minus
strand.
la secuencia parcial de los genes cps del A. pleuropneumoniae serotipo 7 (GenBank®
No. AY534317.1), los cuales alinearon en las posiciones 4.059-4.078 [(App7F)
producto de amplificación de 629 pb (Figura 8).
La posición espacial agrupada de los iniciadores serotipo-específicos respecto
a sus regiones blanco de amplificación y al genoma completo del A.
pleuropneumoniae serotipo 5b, se muestra en la Figura 9.
5.1.3 Condiciones óptimas de amplificación
Todos los experimentos in vitro se realizaron inicialmente con ADN

genómico de cepas de campo colombianas del A. pleuropneumoniae, cepas Jun-25-99
(App1), 27-X-06 (App5) y 29-VIII-00 (App7); y, como punto de partida, se
introdujeron intencionalmente variables a los parámetros esenciales de control bajo el
contexto de la mPCR como son, concentración de MgCl2 y Tom, estimada esta última
durante el diseño computacional de los iniciadores.
39
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
ApToxIVF
AF188858.1-apxIVA-App1 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188862.1-apxIVA-App5b ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188861.1-apxIVA-App5a ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188868.1-apxIVA-App8 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCTGGTGCAGGTAATGATACG 50
AF188869.1-apxIVA-App10 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCTGGTGCAGGTAATGATACG 50
******************************* ***** ************
AF188858.1-apxIVA-App1 GTTAATGGCGGTAATGGCGATGACACCCTCATCGGCGGCAAAGGTAATGA 100

AF188862.1-apxIVA-App5b GTTAATGGCGGTAATGGCGATGACACCCTCATCGGCGGCAAAGGTAATGA 100
AF188861.1-apxIVA-App5a GTTAATGGCGGTAATGGCGATGACACCCTCATCGGCGGCAAAGGTAATGA 100
AF188859.1-apxIVA-App3 GTTAATGGCGGTAATGGCGATGACACACTCATCGGCGGTATGGGTAACGA 100
AF188868.1-apxIVA-App8 GTTAACGGCGGTTATGGTGATGACACCCTCATCGGCGGCAAAGGTAATGA 100
AF188869.1-apxIVA-App10 GTTAACGGCGGTTATGGTGATGACACCCTCATCGGCGGCAAAGGTAATGA 100
***** ****** **** ******** *********** * ***** **
AF188858.1-apxIVA-App1 TATTCTAAGAGGTGGCTACGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGAC 150

AF188862.1-apxIVA-App5b TATTCTAAGAGGTGGCTACGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGAC 150
AF188861.1-apxIVA-App5a TATTCTAAGAGGTGGCTACGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGAC 150
AF188859.1-apxIVA-App3 TACGTTAAAAGGTGGGTTTGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGAC 150
AF188868.1-apxIVA-App8 TATCCTAAAAGGTAGCTACGGTGCGGACACTTATCTCTTTAGCAAAGGAC 150
AF188869.1-apxIVA-App10 TATCCTAAAAGGTAGCTACGGTGCGGACACTTATCTCTTTAGCAAAGGAC 150
** *** **** * * *********** *** ***************
AF188858.1-apxIVA-App1 ACGGACAGGATATCGTTTATGAAGATACCAATAATGATAACCGCGCAAGA 200

AF188862.1-apxIVA-App5b ACGGACAGGATATCGTTTATGAAGATACCAATAATGATAACCGCGCAAGA 200
AF188861.1-apxIVA-App5a ACGGACAGGATATCGTTTATGAAGATACCAATAATGATAACCGCGCAAGA 200
AF188868.1-apxIVA-App8 ATGGACAGGATGTCATTTATGAATATTCCAACAGTGCGAGCTCTACAAGT 200
AF188869.1-apxIVA-App10 ATGGACAGGATGTCATTTATGAATATTCCAACAGTGCGAGCTCTACAAGT 200
* ********* ** ******** ** **** * ** * * ****
40
ApToxIVR
AF188858.1-apxIVA-App1 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188862.1-apxIVA-App5b GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188861.1-apxIVA-App5a GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188868.1-apxIVA-App8 GATATCGACACCTTAAAATTTACCGATATTGGTTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188869.1-apxIVA-App10 GATATCGACACCTTAAAATTTACCGATATTGGTTTATCCGAACTTTGGTT 250
*********************** ****** ******************
ApToxIVR
AF188858.1-apxIVA-App1 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188862.1-apxIVA-App5b TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188861.1-apxIVA-App5a TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
**************************************************
AF188858.1-apxIVA-App1 AAGTCACGGTTCAAAATTGGTATTCACACCAAGATCATAAAATAGAAAAT 350

AF188862.1-apxIVA-App5b AAGTCACGGTTCAAAATTGGTATTCACACCAAGATCATAAAATAGAAAAT 350
AF188861.1-apxIVA-App5a AAGTCACGGTTCAAAATTGGTATTCACACCAAGATCATAAAATAGAAAAT 350
**************************************************
AF188858.1-apxIVA-App1 ATTCGTTTATCGAATGAGCAAACGTTGGTGAGCACTCAGGT 391

AF188862.1-apxIVA-App5b ATTCGTTTATCGAATGAGCAAACGTTGGTGAGCACTCAGGT 391
AF188861.1-apxIVA-App5a ATTCGTTTATCGAATGAGCAAACGTTGGTGAGCACTCAGGT 391
AF188868.1-apxIVA-App8 ATTCGTTTATCGAATGAGCAAATGTTGGTGAGNACTCAGGT 391
AF188869.1-apxIVA-App10 ATTCGTTTATCGAATGAGCAAATGTTGGTGAGCACTCAGGT 391
********************** ********* ********
Figura 5. Alineamiento múltiple (ClustalW) de la región 3’ del gen apxIVA del A.

pleuropneumoniae serotipos 1-12 (códigos de acceso al Genbank® en azul). Representación
gráfica de los iniciadores ApToxIVF (Forward) y ApToxIVR (Reverse) e identificación de
un fragmento de amplificación de 256 pb.
41
AF518558.1-cps-App1 GGGAAAGCAATGCCTAAAATAGATATTTGTTATTATTTTAATATTAGATCTCCAAATGCA 2280
AF518558.1-cps-App1 CTTACACAATATAAAAAACTTTTAAATAAAAAAAACATAGGCGAACAGCTAATTCATTTT 2340
AF518558.1-cps-App1 GCGCAAATGATTTTAATAGTCAAAAAAGTATTAACAACTATCAAAATCAATTGTTTTCTT 2400
AF518558.1-cps-App1 TTTTAAACTCCTATTACAGTTAAGGATAATATAATGAATAAAGTAAAACGTAAATTTAGA 2460
AF518558.1-cps-App1 AAATTACTGCGTGATCCTAAGTTGTTTTTTAGTGATATGTATTTCAAACATTCTATAAAA 2520
AF518558.1-cps-App1 ATTAAAAAAACATTTAACTGGTTAAATATGGAGGAAAACATCCAATTTACGAATGTTTCC 2580
AF518558.1-cps-App1 GCTGTATATAATGTAGAAAAATATCTTGATGATTTCTTTGATAGTATCGTTAAACAAAAT 2640
AF518558.1-cps-App1 TTATCATTTAAAAACACATACAGATTYATCTTAGTTGATGACGGCTCAAAAGATTCATCA 2700
AF518558.1-cps-App1 GCAAACATCATCAAAAAATGGCAAAAAAAATATCCAAATAATATCCACTATTATTATAAA 2760
AF518558.1-cps-App1 GAAAATGGTGGGCAAGCCTCTGCTCGTAATTTAGGACTAAAATACGTACAAACAGAATGG 2820
App1F
AF518558.1-cps-App1 GTTACCTTTATTGATCCAGATGATTTTCTTAGCCTAAATTATTTCTTAGAAGTAGATAAA 2880
***********************
AF518558.1-cps-App1 AAGTTATCAGAACATAAAAATATTGCAATGATTGTATGTAATCTATTATTTTTTATGGAA 2940
AF518558.1-cps-App1 AAGAAAGAAATTATTACTGATAAACATCCTTTAAAATTTAGATTTGAAAAAGATGTTAAT 3000
AF518558.1-cps-App1 TGTTTATCAATTAAAGATCTTAATAATAATTTAAACTTATCTGTAGCAACAAGTTTCTTT 3060
AF518558.1-cps-App1 AGAACCTCTGTAATACAAGGTAATCAACTATTATTTGATAATAGAGTAAAACCAAATTTT 3120
AF518558.1-cps-App1 GAAGATGGTAAATTTATTTCTGATTATTTATTCGAATTACAACACTATAATGCTTTATTT 3180
AF518558.1-cps-App1 TTAAAGAAACCTGTCTATTTTTATCGAAAACGTGAAGATGGTACTTCAACTTTAGATACT 3240
App1R
AF518558.1-cps-App1 TCTTGGCAAAAGCCTGAGAAATATAAAAACGTACTAGAGTATGGTTTTATTCCAATGTTA 3300
********************
AF518558.1-cps-App1 CAGAAATACCATAACAAACTATCATATGGTTCCTAATAACATTCAAAAAACGGCTCTTTA 3360
AF518558.1-cps-App1 TGATATGTATTGGTATATTCAATATCTATTAAATAGACCAGAAAAAATTAAGATTCCTAT 3420
AF518558.1-cps-App1 CTGAAAAAGATCAAGCTAAATTTTATCAACTCTATGATAAAGTATTCGCATATATTGATG 3480
AF518558.1-cps-App1 TAGAAAATATATGCAATTTATATTGCAGGAGCTTGGTTCTTTCATAAAGTAGGTATGATT 3540
AF518558.1-cps-App1 GGAGCATTTAAAAATCAAAGACCTCCTTTTCAAATTGCATATATAGAAAATATTGACCGT 3600
AF518558.1-cps-App1 GAGAAAAAGCAAATTCTTATTAGTTACTTTACTTATTTTGATGATTGTAATTCCTTTAGG 3660
AF518558.1-cps-App1 TTAAATGGTAGAGATACATTACCTGGTTACCAAAAAACAGTAACAAATACTTTTAATGAG 3720
AF518558.1-cps-App1 AAATTATTTACCTATGAAAAAAGAAGCTGGATTCCTTTTGAAAAAGAGGATGATATTTTA 3780
AF518558.1-cps-App1 ACTATTTCTTTAAATGGTCTAATGAATGAGAATAATCTGTCTAAAGGTACTCTTTTCAGT 3840
AF518558.1-cps-App1 AAAGGTATTTCTATTAATAAAATCTTATCAGCATTTACCCCGCAAGCTAAATATTTAACC 3900
AF518558.1-cps-App1 GATGGCAGTTGGCTTTTAATGGATAGAGAAACAAAAGCAGATGATAATGCTGAACATTTC 3960
Figura 6. Representación gráfica de los iniciadores App1F (Forward) y App1R

(Reverse) e identificación de un fragmento de amplificación de 430 pb. Código de
acceso al Genbank® en azul (del nucleótido 2.221 al 3.960).
42
App5F
AF053723.1-cps-App5a GAGCTGAATTATTATCTTTAGTAGCCACAAGACCCGAATGGTATAATGAAGATTATCCTA 1680
CP000569.1-cg-App5b GAGCTGAATTATTATCTTTAGTAGCCACAAGACCCGAATGGTATAATGAAGATTATCCTA 1680
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a ATAACTTAAGAGAAATATACAAAAAACTCTATACTAATAATCGAAGTGAATTATTGCAAA 1740

CP000569.1-cg-App5b ATAACTTAAGAGAAATATACAAAAAACTCTATACTAATAATCGAAGTGAATTATTGCAAA 1740
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a ACATGGCTGCTGCTTGGTATTGGGTTGATTTCTGGAAAAAACGCCTATCTGAGTTAAAAC 1800

CP000569.1-cg-App5b ACATGGCTGCTGCTTGGTATTGGGTTGATTTCTGGAAAAAACGCCTATCTGAGTTAAAAC 1800
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a AATTCTCTCATTGTTGTGTATTTTCAGGAGGTTTAATTTATCAAAAATCTTTGATTGAGT 1860

CP000569.1-cg-App5b AATTCTCTCATTGTTGTGTATTTTCAGGAGGTTTAATTTATCAAAAATCTTTGATTGAGT 1860
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a TATTAAAATATACTCCAACTAAAGTTATGGTTATGGAAAGCCTATTTACAGGAAACGAAT 1920

CP000569.1-cg-App5b TATTAAAATATACTCCAACTAAAGTTATGGTTATGGAAAGCCTATTTACAGGAAACGAAT 1920
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a ATTATTGTGAGGAACGTTATTCATCAATTGCTAATAATAGCGATATTAAACATTTAGCTA 1980

CP000569.1-cg-App5b ATTATTGTGAGGAACGTTATTCATCAATTGCTAATAATAGCGATATTAAACATTTAGCTA 1980
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a TTTTTAACTCTTATAAAAAAACATTTAGTTCAAAAAGTGAATATGATAAGGAACGAATGA 2040

CP000569.1-cg-App5b TTTTTAACTCTTATAAAAAAACATTTAGTTCAAAAAGTGAATATGATAAGGAACGAATGA 2040
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a AAGCTATTAATAAGTTCCTATTAATGAAAAATAAGAATGTCCAACAACCTACTGATTCTG 2100

CP000569.1-cg-App5b AAGCTATTAATAAGTTCCTATTAATGAAAAATAAGAATGTCCAACAACCTACTGATTCTG 2100
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a AAATATTAGTATTTAAACAACAAAAACCAATAATTACTATTATTGGACAAGTGATAAATG 2160

CP000569.1-cg-App5b AAATATTAGTATTTAAACAACAAAAACCAATAATTACTATTATTGGACAAGTGATAAATG 2160
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a ATTTTTCAGTCCTAGAATATAAAGGGAGAGGACTATCAACAATTAAAATCTATAAAGAAC 2220

CP000569.1-cg-App5b ATTTTTCAGTCCTAGAATATAAAGGGAGAGGACTATCAACAATTAAAATCTATAAAGAAC 2220
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a TTATATCTAAACTATCAGAGAATGGATTTAATGTAGTATTAAAAACTCACCCTTGGGAAG 2280

CP000569.1-cg-App5b TTATATCTAAACTATCAGAGAATGGATTTAATGTAGTATTAAAAACTCACCCTTGGGAAG 2280
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a AGAAAAAAAATAATATCCGTACATCTTTAACTAAAAATATAATAGAAGAATTTCTAAAAA 2340

CP000569.1-cg-App5b AGAAAAAAAATAATATCCGTACATCTTTAACTAAAAATATAATAGAAGAATTTCTAAAAA 2340
************************************************************
AF053723.1-cps-App5a ATCTAACTGAGAATCAACAAGAATGTATAAAAATAGTTGATCACTATTCAATAAAGAAAT 2400

CP000569.1-cg-App5b ATCTAACTGAGAATCAACAAGAATGTATAAAAATAGTTGATCACTATTCAATAAAGAAAT 2400
************************************************************
App5R
AF053723.1-cps-App5a TATTTAAACAATCTGATTTTATTATTAGTTTAAATTCTCAAGGGCTCCTTGAAGCTGCAT 2460
CP000569.1-cg-App5b TATTTAAACAATCTGATTTTATTATTAGTTTAAATTCTCAAGGGCTCCTTGAAGCTGCAT 2460
************************************************************
App5R
AF053723.1-cps-App5a TTGATGGTATAAAACCTATACAGTTAGGTAATGCTTTTTATGGAAAAAAAGGATTCACGT 2520
CP000569.1-cg-App5b TTGATGGTATAAAACCTATACAGTTAGGTAATGCTTTTTATGGAAAAAAAGGATTCACGT 2520
************************************************************
Figura 7. Alineamiento múltiple (ClustalW) de la región cps del A.

pleuropneumoniae serotipos 5a y 5b (códigos de acceso al Genbank® en azul).
Representación gráfica de los iniciadores App5F (Forward) y App5R (Reverse) e
identificación de un fragmento de amplificación de 824 pb. CP000569.1 [del
nucleótido 1.804.208 al 1.809.296 (minus strand)].
43
AY534317.1-cps-App7 CAAAATTCGACAGTGCTTTTGATACTCCTAATATGGAAGTAATCAATGAAGCTGAAATGA 3540
AY534317.1-cps-App7 AAATATATATATTCAGAAAATAATAAGGTTATATATGAAGAAAAAATTTTATAAAGCAAT 3600
AY534317.1-cps-App7 TTATCTTTTTAATGCTCCTATTATTTATTGGCGAGGATTGAAGTATTATCAGAAAAAAGA 3660
AY534317.1-cps-App7 ATGGAAAAAAGCTGAGAAATATTTTCAATTAGCAGTTACCCGTAAACCTGATCATGCATA 3720
AY534317.1-cps-App7 TAGTAATTTCAAACTAGGTATGTGCTTTTTTAAACAGAAAATGTGGGATCAAGCATACAA 3780
AY534317.1-cps-App7 CTATATTTCTATTGCCGTAAATCTTGCCCCAGAAATGCCTCTATGGAAAGTCCAATTACG 3840
AY534317.1-cps-App7 TCAGTCTGCAGCCCAATTACAAGTGAAGAAGCGCAGAAAAAGTGTGAAGAGAAATTCTGA 3900
AY534317.1-cps-App7 AAATCAGATAAGTACACCTGAAGAGTTAAAAAAAGTGACAGGCATTTCTGCTAATGAGGT 3960
AY534317.1-cps-App7 CGCGGAACAAATTTTAATTGAATTATTAGAAAAAGAACCAGAAAATCCTACAATTTATGC 4020
App7F
AY534317.1-cps-App7 GGAACTCGCATTAATTCAAAGTAAACAGGCTAAACTGTGGCAGGCAGTAGATTCTTGGAC 4080
********************
AY534317.1-cps-App7 TGAAGCTATAAATCGTAAATCTGATAATGCTATGTATTTCTATCAGTATGGAATTGTTTT 4140
AY534317.1-cps-App7 AGAAAAATTAGGGCATTATGCTAGAGCATCTGAAGCATATAAAACATCTCTTAATTTAAA 4200
AY534317.1-cps-App7 TCCTCCAAATAAAATACTTGCAGATTTGTTCTTTCGTTTAGGATTTGTAAATAAGCATCA 4260
AY534317.1-cps-App7 AGGTCATGATAATATACTGAATATTGAACTGGCAGATGAAGCTTATACTAAAGCTATTCA 4320
AY534317.1-cps-App7 GGCTGATAAAAAACTTAAATCAAAGGATTTTGGTATAGGAGTTTTCTATGAGGAACGTAG 4380
AY534317.1-cps-App7 AGATTGGCAACAAGCGGCTATAGCGTATGAAAATCAAATTGGGAAAACAATAAAAGAAGC 4440
AY534317.1-cps-App7 TGAGTTATTTTATCGTATAGGTTTTGCATATGATCGTAATTATGAGTGGGAATTGGCTGA 4500
AY534317.1-cps-App7 AATAAATTATCAAAAGGCTTTATCTATTACAGAGCGCCCAGAATGGCGTTTCCGTTTAGG 4560
AY534317.1-cps-App7 TCTTGTATTAGAGAAACAGAAGAAATTTATTCAAGCTACAAAGAATTATGAAAAAGCAGC 4620
App7R
AY534317.1-cps-App7 TATAGAGAGAAAACAATATACTCCGTATTGGTTCTATCGTTGCGCTTATACGTTAGAGCA 4680
*************
App7R
AY534317.1-cps-App7 GCAGGGGCTATATGAAAGAGCCTCAAAAATGTATTTGAAATTACGTAAAGATCCCTCATT 4740
*******
AY534317.1-cps-App7 AATTACCAAAGCAAGTCATTCATCTGTAAATGATCTTATTTTGGCATTAAATATAAAACA 4800
AY534317.1-cps-App7 TAATTATGATACTACGTCAGCTCATTCATGGTTTGAATTGGGTTCCTCTTATGAATTAAT 4860
AY534317.1-cps-App7 CCAGAACTGGGAGAAGTCGGAATATGCTTATTCTCAAGCTATTGCTAGAAGTAATGAGTT 4920
AY534317.1-cps-App7 AGTTTCGCTATGGTATTATCGTTTAGGGTTTGTTCAAATTGCTCAAGGTAAGTATTTGCA 4980
AY534317.1-cps-App7 AGCATGCGAGAGTTTAAGAAGTTATCGAGTGATGCAACGTCCGCATGGAGTAAATGAAGA 5040
AY534317.1-cps-App7 CATTCTATCAAAAGATATTAGCTACGCAGAAGTAGCCACATATAATGAATACTATAATAT 5100
AY534317.1-cps-App7 TTTAAATATAAAAGAACAAACTGTTCTATATGAAAGTTTTTCTGGGCAAGGAATGAGTTG 5160
AY534317.1-cps-App7 TAATCCATTAGCCTTATTTTTATATCTATTTAATCATAATGAATATAAGAATTGGACTCA 5220
AY534317.1-cps-App7 TATTTGGGTCATTAATGATACTAGTAATATTCCTGAAGAATATAGGAAATATGATAATGT 5280
Figura 8. Representación gráfica de los iniciadores App7F (Forward) y App7R

(Reverse) e identificación de un fragmento de amplificación de 629 pb. Código de
acceso al Genbank® en azul (del nucleótido 3.481 al 5.280).
44
1.804.208
1.805.848
1.805.867
1.806.652
1.806.671
1.809.016
1.809.281
1.809.296
1.809.839
1.810.303
1.811.847
1.811.869
1.812.257
1.812.276
1.813.339
1.813.358
1.813.948
1.813.968
N< >N
App 5b – cg Query
(CP000569.1)
N=2.274.482 pb
1.641
1.660
2.445
2.464
App 5a – cps Subject 824 pb 99%
(AF053723.1) 1 5.090
N=5.090 pb
2.832
2.854
3.242
3.261
App 1 – cps Subject 87% 430 pb
(AF518558.1) 1 1.297 4.798
N=4.798 pb
4.688
4.059
4.078
4.668
App 7 – cps Subject 88% 629 pb
(AY534317.1) 1 559 7.401
N=7.401 pb
Figura 9. Ubicación espacial (bl2seq) de las regiones cps (códigos de acceso al Genbank® en azul) de los serotipos 1, 5a y 7, y
sus porcentajes de identidad respecto a la región cps dentro del genoma completo del A. pleuropneumoniae 5b (del nucleótido
1.804.208 al 1.813.968). Las cajas coloreadas representan regiones homólogas. Las cajas punteadas representan regiones
variables. Las flechas representan la ubicación y dirección de los iniciadores, y las cajas rojas representan su producto de
amplificación. Distancias arbitrarias entre los valores.
45
Para la Tom, se determinó un rango de trabajo de 56 a 59°C y para la
concentración de MgCl2 se realizó una curva con rango entre 1.5 y 2.5 mM. Los
resultados por electroforesis en gel de agarosa evidenciaron la amplificación
consistente de los productos de tamaño esperado, con mejor eficiencia a 2.5 mM de
MgCl2, mientras que las condiciones óptimas en la Tom resultaron estar entre 56.5 y
58.5°C. Sin embargo; aunque la amplificación inespecífica de un producto
acompañante a la región cps del App5 a 58.5°C se minimizó con el aumento de la
Tom a 59°C, ésta resultó en detrimento de la eficiencia de amplificación en los
productos de la misma región (Figuras 10, 11). Con 58.5°C de Tom final y 1.0 mM y
3.0 mM de MgCl2, no se obtuvieron mejores resultados (resultados no publicados).
La concentración de iniciadores se mantuvo desde el principio en 0.4 µM ofreciendo
siempre óptimos resultados.
Los iniciadores fueron analizados posteriormente de modo simultáneo, de tal
manera que cada región serotipo-específica estuviera acompañada por la región
especie-específica. Para el desarrollo de estas mPCR por serotipo, se diseñó un
estudio de concentraciones inversamente proporcionales comenzando con los
iniciadores ApToxIVF/R a 0.4 µM c/u acompañando a cada pareja de iniciadores
App1F/R, App5F/R y App7F/R a 0.1 µM; c/u respectivamente, manteniendo una Tom
de 58.5°C y una concentración de MgCl2 a 2.5 mM. Mientras que la concentración de
iniciadores contra apxIVA fue disminuyendo, la concentración de iniciadores contra
cps fue aumentando; ambos, a intervalos de 0.05 µM. Finalmente, cada pareja de
productos de amplificación de 256 y 430 pb, 256 y 824 pb, y 256 y 629 pb, obtuvo
sus parámetros químicos y térmicos ideales como se evidencia en la Figura 12.
5.2 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
Se encontró un alto grado de especificidad in silico en los iniciadores

seleccionados para este estudio.
46
apxIVA cps-App1
MWM
500
430 400
300
256 200

regiones apxIVA y cps-App1, a diferentes temperaturas de anillaje en presencia de
MgCl2 a 2.5 mM. (a) 57.5°C, (b) 58°C, (c) 58.5°C y (d) 59°C. MWM (marcador de
peso molecular).
cps-App5 cps-App7
MWM
900
800 824
700
600 629
500

regiones cps-App5 y cps-App7, a diferentes temperaturas de anillaje en presencia de
MgCl2 a 2.5 mM. (a) 57.5°C, (b) 58°C, (c) 58.5°C y (d) 59°C. MWM (marcador de
peso molecular).
47
Los iniciadores 1 y 2 alinearon con los genes apxIVA con el 100% de los
serotipos reportados en la base de datos (App 1-12) (Anexo 2). De igual manera, los
iniciadores 3 y 4; 5 y 6; 7 y 8, alinearon con sus respectivas regiones parciales de
biosíntesis de polisacáridos capsulares (cps) de los serotipos 1, 5 y 7, evidenciándose
una identidad total para los serotipos contra los cuales fueron diseñados, sin
alineamientos cruzados entre ellos (Anexos 3, 4, 5).
El ensayo de especificidad analítica in vitro, se llevó a cabo aplicando las
anteriores condiciones favorables de amplificación molecular (Apartado 5.1.3) a una
colección de 22 cepas de la especie A. pleuropneumoniae, incluyendo cepas de
campo representativos de los serotipos 1 (n = 4), serotipo 5 (n = 5) y serotipo 7 (n =
7), así como 7 cepas bacterianas representativas de especies diferentes al A.
pleuropneumoniae, de las cuales 2 cepas hacen parte de la Familia Pasteurellaceae
(Haemophilus, Pasteurella).
824
629
500
430
256
Figura 12. Resultado por electroforesis en gel de agarosa de la combinación óptima de

iniciadores para la PCR múltiple serotipo específica. (App1) Iniciadores ApToxIVF/R
y App1F/R, (App5) iniciadores ApToxIVF/R y App5F/R, (App7) iniciadores
ApToxIVF/R y App7F/R, en presencia de MgCl2 2.5 mM. MWM (Marcador de peso
molecular). C- (control negativo).
48
Así, todas las cepas de referencia y cepas de campo colombianas del A.
pleuropneumoniae amplificaron el producto de tamaño esperado (256 pb) (Figura
13), mientras que los serotipos 1, 5 y 7 de la misma, amplificaron los productos de
tamaño esperado (430, 824 y 629, respectivamente) (Figuras 14, 15, 16). En igualdad
de condiciones, la aplicación del mismo protocolo químico y térmico al grupo de
cepas bacterianas diferentes a la especie A. pleuropneumoniae, demostró la
especificidad de la PCR (iniciadores) al no presentar amplificación del producto
especie-específico de tamaño esperado para esta región (256 pb) (resultados no
publicados), mismos resultados que se obtuvieron con la aplicación del protocolo
optimizado de amplificación con los iniciadores serotipo-específicos (resultados no
publicados); destacando igualmente, la falta de amplificación cruzada entre los
primeros 7 serotipos del A. pleuropneumoniae con el uso de estos iniciadores
(Figuras 14, 15, 16). Durante la estandarización de estos ensayos, las 4 parejas de
nuevos iniciadores se cruzaron con ADN porcino proveniente de tejido pulmonar sin
lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina (control negativo); criterio establecido
bajo concepto Médico Veterinario de análisis macroscópico del tejido, así como agua
ultrapura utilizada como diluyente de templado de ADN, sometida a las mismas
condiciones de extracción de material nucleico (Apartado 4.4.3) (control negativo de
extracción), en los cuales se evidenció la falta de amplificación molecular de los 4
productos de tamaño esperado.
5.3 SENSIBILIDAD ANALÍTICA
Se determinó la sensibilidad analítica de las técnicas de PCR en sus 2

versiones optimizadas; convencional y múltiple, a partir de los lisados bacterianos sin
diluir (Apartado 4.4.3). Todos los productos de amplificación se detectaron sobre
agarosa teñida con bromuro de etidio, partiendo de una concentración conocida de
ADN en las muestras de 5.35 ng/µL (App1), 2.95 ng/µL (App5) y 2.5 ng/µL (App7).
49
500
300
256 200
Figura 13. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de especificidad
in vitro de los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR e identificación de un fragmento
de amplificación de 256 pb. Carriles 1-7 [Controles positivos (DNA App 1-7
respectivamente)], carriles 8-9 [Controles negativos (Pulmón sano y control de
extracción respectivamente)]. MWW (marcador de peso molecular).
500
400 430
Figura 14. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de especificidad
in vitro de los iniciadores App1F y App1R e identificación de un fragmento de
amplificación de 430 pb. Carriles 1-7 [Controles positivos (DNA App 1-7
50
824 900
800
500
700 629
600
500
51
Para asegurar la confiabilidad de los resultados, la lectura del material
nucleico se realizó por triplicado (A260) (4.1d); al igual que las corridas
electroforéticas, obteniéndose un nivel de pureza (relación A260/A280) de 1.86 ± 0.1
lo que indicó un nivel óptimo de pureza. Con todos los amplicones estudiados
individualmente, 274 fg de ADN a partir de cultivos puros resultó ser la cantidad
mínima de material nucleico requerido para observar y detectar una banda
representativa del gen apxIVA (Figura 17); mientras que para las regiones parciales
cps, las cantidades mínimas establecidas ser 1.36 pg, 18.8 pg y 640 fg para los
serotipos 1, 5 y 7, respectivamente (Figuras 18, 19, 20). Bajo el contexto de la
mPCR, las cantidades mínimas establecidas para la visualización concomitante de los
productos especie-específicos y serotipo-específicos fueron, 171 fg (apxIVA) y 4.8 ng
(cps) para el App serotipo 1 (Figura 21), 6 fg (apxIVA) y 3.7 pg (cps) para el App
serotipo 5 (Figura 22) y, 640 fg (apxIVA) y 3.2 pg (cps) para el App serotipo 7
(Figura 23).
5.4 PROCESAMIENTO BACTERIOLÓGICO DE ESPECÍMENES
Los especímenes clínicos consistieron de tejido pulmonar con evidencia de

áreas hemorrágicas y fibrinosas al momento del corte. De la totalidad de estas
muestras colectadas (n = 100), el 74% (n = 74) mostró crecimiento bacteriano visible
sobre el medio sólido; incluida la estría nodriza de S. aureus, posterior a su
incubación a 37°C durante 48 h. De estos 74 crecimientos, el 63% (n = 53) presentó
las características de colonias pequeñas y brillantes compatibles con aquellas del A.
pleuropneumoniae junto a la estría nodriza, así como en diferentes lugares de la caja
de cultivo, las cuales se repicaron individualmente sobre nuevas cajas de cultivo
estériles y se incubaron bajo las mismas condiciones. Posterior a este tiempo, no se
obtuvo alguna colonia purificada representativa de la especie A. pleuropneumoniae, a
pesar de los intentos por aislarla y recuperarla mediante su pase alternativo a caldo
PPLO enriquecido al 5% (v/v) de suero equino y 0.1% (v/v) de Vitox (OXOID, UK.
Cat. # SR0090A).
52
500
300
256
200
Figura 17. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la PCR con ApToxIVF y ApToxIVR. Carril 1 (C+ puro), Carril 2 (1:5), Carril 3
(1:25), Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125), Carril 7 (1:15625), Carril
8 (1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125). MWM (marcador de peso
molecular).
500
400 430
de la PCR con App1F y App1R. Carril 1 (C+ puro), Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25),
Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125), Carril 7 (1:15625), Carril 8
(1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125). MWM (marcador de peso
molecular).
53
900
800 824
500
molecular).
700
600 629
500
molecular).
54
MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500
400 430
300
256
200
de la mPCR con ApToxIVF y ApToxIVR y App1F y App1R. Carril 1 (C+ puro),
Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25), Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125),
Carril 7 (1:15625), Carril 8 (1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125).
MWM (marcador de peso molecular).
MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
900
800 824
500
300
256
200
55
MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
700
600 629
500
300
256
200
Las cepas de referencia y aislados de campo colombianos del A.

pleuropneumoniae, se recuperaron siguiéndola misma metodología obteniéndose con
éxito el crecimiento de las colonias en un período mínimo de 24 horas y bordeando la
estría de S. aureus que les suministró el factor NAD para su crecimiento (Anexo 6).
La reconfirmación bioquímica de las colonias se realizó mediante las pruebas de
CAMP, hemólisis, ureasa y fermentación de glucosa y lactosa, siguiendo el POE del
LNDV y tomando como referencia los parámetros de Killian et al. (1978).
5.5 PCR A PARTIR DE CULTIVOS PUROS
Todas las cepas del A. pleuropneumoniae; entre de referencia y aislados de

campo, amplificaron un producto especie-específico de tamaño esperado de 256 pb, a
diferencia del restante de especies bacterianas utilizadas en este estudio (Tabla 4), tal
56
y como se mencionó anteriormente en el Apartado 5.2 de Especificidad Analítica. Así
mismo, todos los serotipos fueron reasignados al mismo tipo mediante nuestras
técnicas moleculares, al amplificar consistentemente productos de tamaño esperado
para cada uno de ellos; 430, 824 y 629 pb, para los serotipos 1, 5 y 7,
respectivamente.
5.6 PCR A PARTIR DE ESPECÍMENES
A diferencia de los resultados bacteriológicos, el 20% (n = 23) del total de

especímenes recolectados (n = 115); entre tejido pulmonar (n = 100) e hisopados (n =
15), amplificó positivamente la región especie-específica del A. pleuropneumoniae
(apxIVA) evidenciándose un producto de tamaño esperado (256 pb); de los cuales, el
78.2% (n = 18) provino de tejido pulmonar, mientras que el restante 21.8% (n = 5)
provino de hisopados. Como hallazgo relevante, que en solo 1 muestra amplificó
positivamente un producto de tamaño esperado para el serotipo 5 (824 pb). Todos los
ensayos se realizaron en presencia de 2 controles positivos (cepa de referencia y
aislado de campo) y 2 controles negativos [Agua ultrapura (control de extracción) y
agua ultrapura (control de reactivos)], mientras que los amplificados se compararon
contra un marcador de peso molecular con bandas a intervalos de 100 pb.
5.7 COMPARACIÓN ENTRE PRUEBAS
Teniendo en cuenta que todas las cepas del A. pleuropneumoniae utilizadas en

este estudio amplificaron consistentemente sus respectivas regiones específicas tanto
de especie como de serotipo, se realizaron 45 aislamientos consistiendo de todos los
aislados de campo; cada uno por triplicado, distribuidos proporcionalmente en 3 días.
Todas las colonias fueron reconfirmadas bioquímicamente siguiendo el POE
establecido por el LNDV para el diagnostico rutinario del App. Posteriormente, se
extrajo el material genético de cada una de ellas como se mencionó anteriormente
(Apartado 4.4.3), material que se conservó a -70°C hasta el momento de su
57
amplificación por las nuevas técnicas de PCR, con el fin de homogeneizar las
condiciones de manipulación, instrumentos y reactivos.
Con un IC 95%, los resultados del diagnóstico por aislamiento bacteriano y
caracterización bioquímica tradicional versus la mPCR, demostraron una sensibilidad
y especificidad diagnósticas del 100%; respectivamente, e índice Kappa de 1, lo que
indicó un grado de acuerdo “muy bueno” entre las dos técnicas según los márgenes
de Landis y Koch (Anexo 7). Con esto se evidenció que las técnicas de mPCR
ofrecen los mismos resultados que la metodología tradicional en la detección de la
especie A. pleuropneumoniae a partir de cultivos puros, con la ventaja que presentan
estas últimas de ser más rápidas y sencillas, además que ofrecen la posibilidad de
identificar concomitantemente el serotipo de la cepa aislada; en este caso particular,
el 1, 5 y/o 7.
En este estudio no se comparó la técnica de serotipificación convencional con
antisueros contra las mPCR, debido a que existe evidencia suficiente sobre los
problemas de reacción cruzada entre algunos de los serotipos del A.
pleuropneumoniae. Sin embargo, es menester continuar con el análisis de
especificidad in vitro con el restante de serotipos del A. pleuropneumoniae que no
pudieron ser incluidos durante el transcurso de esta investigación.
5.8 SECUENCIAS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
Todas las secuencias consenso especie-específicas y serotipo-específicas;

apxIVA y cps respectivamente, obtenidas de los productos de amplificación a partir
de aislados de campo colombianos del A. pleuropneumoniae considerados como
controles positivos (Tabla 4), demostraron un % de identidad de 99 con sus
equivalentes de referencia reportadas en el GenBank® (Figuras 5, 6, 7, 8).
58
6. DISCUSIÓN
La variabilidad antigénica del A. pleuropneumoniae representada en los 15

serotipos reconocidos hasta el momento sobre la base de diferencias en sus CPS
(Blackall et al., 2002), ha dificultado el proceso de clasificación de sus aislados
mediante el uso de técnicas serológicas que se consideran las tradicionales y
convencionales (Mittal et al., 1982). A menudo ocurren reacciones cruzadas visibles
entre diferentes serotipos cuando se enfrentan a anticuerpos de naturaleza policlonal;
referenciando específicamente, entre el 1 y 9 (Mittal, 1990), 1 y 5 (Bossé et al.,
1990), 1 y 7 (Gottschalk et al., 2000; Williams y col, 2000), 4 y 7 (Mittal and
Bourdon, 1990), 7 y 1b (Tadjine and Mittal, 2001), 6 y 3, 6 y 5 (Mittal et al., 1983), 7
y 15 (Blackall et al., 2002); así como 1, 4 y 7 (Gottschalk et al., 2000), 2, 5 y 7
(Bossé et al., 1990) y 3, 5, 6 y 8 (Mittal et al., 1988), inconvenientes que
desencadenaron en primera instancia el desarrollo de anticuerpos de naturaleza
monoclonal (Lacouture et al., 1997), aunque resultando en una tecnología larga y
dispendiosa.
Para superar estos problemas, las metodologías genotípicas basadas en la
amplificación del material nucleico; tales como la PCR, surgieron como una
alternativa práctica al uso de aquellas fenotípicas basadas en la interacción antígeno-
anticuerpo. Los primeros reportes de técnicas de genotipificación corresponden a
Sirois et al. (1991) y Hennessy et al. (1993), seguidas por versiones mejoradas de
Gram et al. (1996) y Gram and Ahrens (1998); técnicas que en general, resultaron
poco ventajosas a la hora de diferenciar entre los serotipos de este patógeno, aunque
considerándose más sensibles que el aislamiento bacteriano. En adelante, los intentos
por mejorar el poder de discriminación entre las cepas del A. pleuropneumoniae
según su serotipo específico han sido notables; influenciados por los avances en la
genética molecular del mismo (Oswald et al., 1999), experiencias que han indicado la
necesidad de amplificar individual o simultáneamente regiones específicas tanto de
especie como de serotipo a la hora de destacar el papel del A. pleuropneumoniae
59
como patógeno en la producción de casos esporádicos y brotes de pleuroneumonía
porcina.
Aunque hasta la fecha no existe reporte de técnica alguna confiable y capaz de
diferenciar la totalidad de estos serotipos, se han publicado ya protocolos de
amplificación específica para varios de ellos (Tabla 2), sobre la base de su
prevalencia geográfica y/o reacciones cruzadas inespecíficas entre ellos. Por lo tanto,
en este trabajo se presentan 3 protocolos de mPCR que identifican y discriminan los
serotipos 1, 5 y 7; respectivamente, y detectan concomitantemente la especie A.
pleuropneumoniae, con potencial intrínseco de combinado simultáneo triple o
cuádruple a partir de cultivos bacterianos puros.
Los ensayos se optimizaron con cepas de referencia y cepas de campo
colombianas, aprovechando las ventajas de la mPCR en la cual más de una pareja de
cebadores conducen a la amplificación de 2 o más regiones diana de ADN bajo las
mismas condiciones en el proceso de reacción (Markoulatos et al., 2003). Para esto,
se diseñó un nuevo set de iniciadores específicos constituido por 4 parejas, 1 pareja
especie-específica y 3 pareas adicionales serotipo-específicas (Tabla 5). A pesar de
existir oligonucleótidos ya reportadas para la identificación de los serotipos 1, 5 y 7,
debido a sus parámetros altamente variables entre ellos bajo el contexto de la mPCR;
de especial importancia la Tom y el tamaño del producto, no permitían obtener una
combinación óptima para su uso simultáneo, combinados con aquellos específicos
para la detección de especie.
En esta especie; A. pleuropneumoniae, se han descubierto varias estructuras y
productos de patogenicidad, entre ellos los CPS (Bandara et al., 2003) y las
uniformemente denominadas exotoxinas Apx (Frey et al., 1993). Por un lado, la
cápsula es el antígeno primario de serotipo, atributo que hace de sus genes (cps) un
blanco ideal de amplificación para su identificación genotípica serotipo-específica por
PCR; por el otro, la toxina ApxIVA resultó estar presente en todos los serotipos
estudiados de esta bacteria (Schaller et al., 1999), característica que ha sido
aprovechada para detectar molecularmente sus cepas a nivel de especie mediante su
correspondiente gen, apxIVA. Por lo tanto, en este estudio se aprovechó la naturaleza
60
variable y conservada; respectivamente, de estos genes asociados a virulencia para
obtener los 8 iniciadores específicos, soportados con la aplicación de herramientas
computacionales antes, durante y después de su diseño y selección. La utilización de
esta clase de cebadores; específicos contra la región ADN capsular, ha sido
igualmente reportada como un método de genotipificación confiable en otras especies
bacterianas (Kong and Gilbert, 2003; Poyart et al., 2007; Turton et al., 2008),
incluyendo otros patógenos porcinos (Wisselink et al., 2002).
Los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR; específicos de especie, se diseñaron
para producir un fragmento de amplificación de 256 pb a partir de la secuencia
consenso de las porciones 3’ del gen apxIVA. Estos iniciadores aparearon con todas
las regiones en los 12 primeros serotipos del A. pleuropneumoniae hasta ahora
reportados en el GenBank®, las cuales demostraron un 98% de identidad (Figura 5),
correspondiendo a los hallazgos obtenidos por Schaller et al. (1999). Los iniciadores
específicos de serotipo, se diseñaron a partir de las regiones parciales cps de los
serotipos 1, 5 y 7; respectivamente. Al momento de esta investigación se encontraban
reportadas las secuencias nucleotídicas parciales involucradas en la encapsulación de
los serotipos 1 (GenBank® No. AF518558.1, AY496882.1), serotipo 2 (GenBank®
No. AY357726.1), serotipo 3 (GenBank® No. EU010971.1), serotipo 5a (GenBank®
No. AF053723.1), serotipo 6 (GenBank® No. AY534316.1), serotipo 7 (GenBank®
No. AY534317.1), serotipo 8 (GenBank® No. AY356527.1) y serotipo 12 (GenBank®
No. AY496881.1); aunque de diferente tamaño, dificultando el diseño y limitando la
confiabilidad de los iniciadores.
En respuesta a estas limitaciones, dichas regiones se ubicaron espacialmente
respecto al genoma completo del A. pleuropneumoniae serotipo 5b (GenBank® No.
CP000569.1), utilizando la secuencia AF518558.1 para el caso del serotipo 1 debido
a su mayor tamaño y utilidad bioinformática. En la Figura 9 se demuestra la posición
de las 3 secuencias parciales cps de los serotipos 1, 5 y 7, así como las regiones
homólogas (> 87% de identidad). Aunque el serotipo 5 se encuentra dividido en
subtipos a y b; cuya diferencia radica en un residuo de β-D-glucopiranosil en el
serotipo 5b (Altman et al., 1992), sus regiones parciales presentaron un 99% de
61
identidad, probablemente debido a que la región de ADN involucrada en esta
diferencia fenotípica no hacía parte de la secuencia analizada correspondiente al
serotipo 5a.
En contraste, la región parcial cps del serotipo 1 (n = 4.798 nt), evidenció una
identidad del 87% con sus primeros 1.297 nt, mientras que las región parcial cps del
serotipo 7 (n = 7.401 nt) evidenció una identidad del 88% con tan solo sus primeros
559 nt. Sin embargo, estos resultados eran de esperarse ya que; según el trabajo de
Jessing et al. (2008), los serotipos que integran el grupo de organización genética tipo
I (serotipos 1 y 12), tipo II (serotipo 5a) y III (serotipos 2, 6, 7 y 8); de acuerdo a sus
operones, no poseen homología significativa entre sus genes cps y productos
deducidos. Por lo tanto, se aprovecharon las regiones variables para el diseño de los
iniciadores serotipo-específicos.
Los iniciadores App1F y App1R, se diseñaron para producir un fragmento de
amplificación de 430 pb (Figura 6), los iniciadores App5F y App5R para producir un
fragmento de amplificación de 824 pb (Figura 7), mientras que los iniciadores
App7F y App7R para producir un fragmento de amplificación de 629 pb (Figura 8).
Ya que no existen secuencias cps disponibles reportadas para los serotipos 4, 9, 10,
11, 13, 14 y 15, se desconoce aún la probabilidad de alineamiento contra estos
serotipos, como si se conoce su probabilidad in silico contra los demás, prueba de ello
se encuentra evidenciado en los Anexos 2, 3, 4 y 5. Estas tres parejas se combinaron
respectivamente con la pareja especie-específica (ApToxIVF/R) para obtener tres
protocolos de mPCR para la detección (especie) e identificación (serotipo) simultánea
y discriminación de estos patógenos, los serotipos 1, 5 y 7 del A. pleuropneumoniae.
La combinación de iniciadores por serotipo específico, requirió cambios a nivel de
condiciones químicas, en contraste con sus condiciones térmicas, las cuales se
mantuvieron estables. En la Tabla 5, se puede observar como se mantiene una Tom
de 58.7°C ± 1 entre cada uno de los 8 iniciadores, lo que explicaría este
comportamiento aunque inicialmente se presentaron electroforéticamente bandas
inespecíficas inesperadas en los amplificados del serotipo 5 mientras se mantenía el
producto cps correspondiente (Figura 11), inconveniente que se minimizó
62
manipulando los parámetros de Tom y concentración de MgCl2. Con las Tom
establecidas, se comprueba en primera instancia el potencial de combinado
simultáneo triple y cuádruple de estos iniciadores; sustentado en segunda instancia,
en la diferencia promedio de 189 nt entre los productos de amplificación
inmediatamente adyacentes, perfectamente visibles y diferenciables posterior a su
separación electroforética.
Los primeros experimentos se realizaron con cepas de campo colombianas del
A. pleuropneumoniae y posteriormente con cepas de referencia de origen
multigeográfico; como son, App1/cepa 4074 (Argentina), App2/cepa S1536 (Suiza),
App3/cepa S1421 (Suiza), App4/cepa M62 (Estados Unidos), App5a/cepa K17
(Estados Unidos), App6/cepa Femo (Dinamarca) y App7/cepa WF83 (Canadá), lo
que supone una extensión exitosa de estos protocolos en dichos países. Las regiones
apxIVA y cps respectivas, se amplificaron esperadamente a partir de templados
purificados de estos aislamientos puros, por lo tanto, la aplicación exitosa de estos
protocolos de mPCR sobre colonias bacterianas purificadas, proporcionó un método
eficaz para la tipificación de cepas del A. pleuropneumoniae. Todos los aislados de
campo nacionales asignados en su momento como serotipos 1, 5 y 7, fueron
reasignados nuevamente a dichos serotipos por las técnicas moleculares. De igual
manera, la amplificación del gen apxIVA en el 100% de los aislados colombianos
concuerda con los resultados de Cho and Chae (2001), lo que amplía su potencial e
importancia del campo diagnóstico molecular al inmunológico y a la tecnología
vacunal.
La secuenciación constante de estas regiones en aislados de campo permitirá
caracterizar las cepas circulantes y establecer o rechazar relaciones entre ellas;
facilitando así, el conocimiento sobre la fuente u origen de las infecciones en campo y
su expansión geográfica, así como constatar, vigilar y controlar la emergencia de
aquellas nuevas que pudieran escapar a la inmunidad conferida tras la aprobación de
vacunas debido a mutaciones o recombinación genética entre las existentes. En el
trabajo de Bossé et al. (2004), se demostró la capacidad del A. pleuropneumoniae 1 y
5b de usar material genético del donador Knockout serotipo 1 como medio de
63
transformación al desencadenar reemplazamientos alélicos; resaltando así, la
naturaleza competente de los miembros de la Familia Pasteurellaceae por captar
ADN del ambiente (Redfield et al., 2006), importantes resultados sobre el
conocimiento del potencial coinfectante de varios serotipos de este patógeno en el
hospedador (Mittal et al., 1983).
Por otro lado y remitiéndonos específicamente a apxIVA, su estudio y
amplificación por PCR ha resultado ser útil en el estudio e integridad del genoma del
A. pleuropneumoniae (Schaller et al., 2001). Además; comprobada la naturaleza
estricta de su expresión in vivo, estudios complementarios determinaron que la
inserción del elemento ISAp1l previno la detección serológica de ApxIVA
(Tegetmeyer et al., 2008), lo que plantea la posibilidad que cualquier tipo de
inserción en apxIVA podría afectar el desarrollo normal de técnicas moleculares
basadas en este gen. Por lo tanto, con la revisión constante de secuencias reportadas,
se podría dilucidar el comportamiento genético en cepas de campo que pudiera
afectar potencialmente y de manera negativa la capacidad de hibridación de los
cebadores contra apxIVA.
Los análisis de especificidad in silico se complementaron a nivel in vitro con
un grupo de bacterias diferentes al A. pleuropneumoniae (Tabla 4). Todos los
ensayos de PCR fallaron en amplificar las regiones apxIVA y cps en estas especies
(resultados no publicados). Sin embargo, es recomendable ampliar el pool de
especímenes bacterianos para complementar estos análisis de especificidad. Sobre
esto, líneas de evidencia han demostrado que cepas de Actinobacillus genomoespecie
1 y Actinobacillus lignieresii han amplificado productos de tamaño esperado cuando
se han enfrentado a cebadores específicos contra el ADN capsular del A.
pleuropneumoniae (Angen et al., 2008), resultados concordantes si se tiene en cuenta
que A. lignieresii ha sido determinada como más relacionada filogenéticamente al A.
pleuropneumoniae (Borr et al., 1991); tanto así, que la reclasificación taxonómica del
Haemophilus pleuropneumoniae en A. pleuropneumoniae, se sustentó sobre el
estudio de homología ADN-ADN con A. lignieresii (Pohl et al., 1983). A esta altura,
vale la pena acotar también que las hibridaciones inespecíficas en el A. lignieresii de
64
sondas dirigidas contra apxIVA, se han evidenciado hacia su extremo 5’ (Schaller et
al., 2001), lo que comprueba y enfatiza la importancia del extremo 3’ para su
amplificación molecular y determinación especie-específica.
Es un hecho que las técnicas de PCR están complementando el aislamiento de
bacterias en los casos de detección de agentes que resultan difíciles de cultivar.
Debido a esto, se estudió el potencial de amplificación sobre otros especímenes; entre
tejido pulmonar e hisopados, a la vez que el tejido pulmonar con lesiones aparentes
de pleuroneumonía porcina se sometió a aislamiento bacteriano y caracterización
bioquímica para la determinación del A. pleuropneumoniae. Según Williams y col.
(2000), el aislamiento de este patógeno a partir de pulmones tomados en planta de
beneficio es difícil, y en este trabajo no se pudo aislar alguna cepa representativa del
A. pleuropneumoniae; en contraste, se pudo detectar material genético de esta especie
en 18 pulmones y 4 hisopados. Estas diferencias pueden ser interpretadas de manera
general e incipiente como resultado de una baja sensibilidad del cultivo respecto a la
PCR, o como una ventaja inherente de las técnicas moleculares para detectar
microorganismos viables y no viables. Al respecto, son varios los factores que
pudieron influenciar estos resultados, teniendo en cuenta que las muestras de tejido
pulmonar se tomaron de animales sin historia clínica y son considerar además, la
localización y/o extensión de las lesiones como una limitante para su recolección. Por
un lado, es probable que estos animales hubieran sido sometidos a tratamiento
médico antes de su sacrificio permitiendo el rápido aclaramiento de bacterias en los
pulmones, sobre todo si se conoce que el A. pleuropneumoniae es susceptible a un
amplio rango de antibióticos (Aarestrup and Jensen, 1999; Williams y col., 2001;
Chang et al., 2002; Gutiérrez-Martín et al., 2006); por el otro, la escasa articulación y
concordancia entre el éxito del aislamiento bacteriano y el tamaño de la muestra o
localización de la lesión en el pulmón (Mittal et al., 1983; Willson et al., 1987; Frank
et al., 1992; Lo et al., 1998; Durán Reina, 2000; Williams y col., 2000; Hernández-
Castro y col., 2002) hace pensar que estas variables no son individualmente
influyentes a la hora de obtener resultados bacteriológicos positivos, aunque tampoco
se puede dejar a un lado los errores de objetividad al momento de la selección de los
65
especímenes, así como la probabilidad de inhibición en el crecimiento del A.
pleuropneumoniae por la presencia de otras bacterias, como se encontró en esta
investigación (resultados no publicados).
Como hallazgo relevante, se encontró que en tan solo una de las muestras que
amplificaron positivamente la región apxIVA (256 pb), se amplificó alternamente un
producto cps de tamaño esperado para el serotipo 5 (825 pb), sugiriendo la
circulación de otros serotipos diferentes a los reportados por Durán Reina (2000),
probablemente algunos de los encontrados en un principio como son el 2 y el 4 (cita
de Durán Reina, 2000). Cabe anotar que; aunque esta investigación carece de
connotación epidemiológica, la naturaleza específica de la toxina ApxIV en el A.
pleuropneumoniae y la inequívoca amplificación de su determinante genético
(apxIVA) por nuestras PCR, podrían sustentar esta teoría, además de la diferencia
entre la cantidad de fuentes de tejido pulmonar utilizada en este trabajo (n = 1) en
comparación con las utilizadas por Durán Reina (2000) (n = 2), lo que implicaría una
desventaja epidemiológica respecto a las regiones geográficas y predios de los que
provenían los animales. La detección de ADN de este patógeno a partir de hisopados
también resulta ser clave a la hora de detectar animales portadores asintomáticos y
evitar así, la diseminación de la enfermedad en el hato hacia otras regiones. Esto es
particularmente importante con relación a los programas de control de enfermedades,
si bien se conoce que a Colombia entran porcinos desde países con prevalencia
reportada de otros serotipos, tales como Venezuela, Canadá, Estados Unidos y
Bélgica, situación que podría desencadenar la aparición de nuevos serotipos.
En cuanto a la sensibilidad de las técnicas, las cantidades mínimas de material
genético detectables fueron similares en sus dos versiones (convencional y múltiple),
aunque con una diferencia a favor de la mPCR para el serotipo 5 y otra en contra de
la mPCR para el serotipo 1, pudiendo esta última ser objeto de pruebas de
reestandarización para optimizar su rendimiento y adaptarse a las necesidades del
laboratorio de diagnóstico. Sin embrago, estos valores se presentan en general como
superiores cuando se compararon con protocolos previamente reportados (Gram and
Ahrens, 1998; Zhou et al., 2008).
66
El uso de iniciadores dirigidos contra regiones específicas de ADN capsular es
la metodología más prominente con potencial de uso en la tipificación del A.
pleuropneumoniae. Si se llegasen a utilizar todos los cebadores serotipo-específicos
actualmente existentes, se podrían identificar los serotipos 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 12, y;
una vez sean determinadas y publicadas las secuencias nucleotídicas específicas de
las regiones capsulares de los serotipos restantes, las técnicas podrían ser expandidas
a éstos. Además, estas secuencias podrían ayudar a dilucidar la naturaleza de las
reacciones cruzadas encontradas entre algunos de ellos como se mencionó
anteriormente.
En conclusión, en este trabajo se presentan varios protocolos de PCR que
podrían ser de gran utilidad e importancia en la detección e identificación de aislados
del A. pleuropneumoniae, especialmente en países donde los serotipos 1, 5 y 7 son
prevalentes. La capacidad de discriminación entre los mismos, así como de la especie
con otros patógenos bacterianos, sería ventajosa para entender la naturaleza
(epidemiología) y biología (virulencia) de la pleuroneumonía porcina. Su efectividad,
especificidad, sensibilidad, versatilidad, potencial multiplexado y expansión a
especímenes biológicos (clínicos y no clínicos), sustentarían su implementación en el
laboratorio de diagnóstico veterinario. Complementariamente, la metodología de
extracción y purificación de material nucleico utilizado en este estudio, podría
facilitar el procesamiento de los aislados en una sola jornada de trabajo, lo que
permitiría agilizar la entrega oportuna de los resultados.
67
7. CONCLUSIONES
El uso de la bioinformática ayuda a mejorar las investigaciones en biología

molecular. La aplicación de sus herramientas en este trabajo, incrementó la calidad de
las técnicas de PCR desarrolladas.
Se logró diseñar un nuevo conjunto de primers específicos para la detección de la

especie A. pleuropneumoniae e identificación y discriminación de los serotipos 1, 5 y
7, uniformes en sus características y propiedades y con potencial multiplexado entre
ellos.
58.5°C y 2.5 mM de MgCl2, resultaron ser las 2 condiciones que mejoraron el

desempeño de la amplificación molecular en los protocolos de mPCR y por ende, la
resolución de los productos.
Todos los primers diseñados resultaron ser altamente específicos para la

identificación de serotipo y detección de especie, cuando se sometieron a
amplificación de material nucleico proveniente de 8 especies bacterianas, incluyendo
los primeros 7 serotipos del A. pleuropneumoniae, entre cepas de campo colombianas
y cepas de referencia.
Las cantidades mínimas detectables por las nuevas técnicas, resultaron ser similares
en sus dos versiones optimizadas (convencionales y múltiples), incluso superiores a
algunos protocolos previamente reportados.
La proporción de amplificación molecular de las regiones apxIVA y cps en cepas de

campo del A. pleuropneumoniae fue de 15/15 (100%) para apxIVA-App, 4/4 (100%)
para cps-App1, 4/4 (100%) para cps-App5 y 7/7 (100%) para cps-App7, mientras que
a partir de especímenes biológicos fue de 18/100 (18%) a partir de tejido pulmonar
con lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina y de 4/15 (26.6%) a partir de
68
hisopados para la región apxIVA, y 1/15 (6.6%) a partir de hisopados para la región
cps-App5.
La proporción de aislamientos bacterianos positivos a la especie A.

pleuropneumoniae a partir de tejido pulmonar clínico fue de 0/100 (0%),
considerándose en primera instancia como consecuencia de la baja sensibilidad de la
técnica microbiológica tradicional respecto a la PCR.
La concordancia entre el método de identificación bacteriológica tradicional versus

las nuevas técnicas de mPCR fue de 1; considerado un nivel “muy bueno”,
atribuyéndole así a la PCR las mismas capacidades de los métodos rutinarios en el
diagnóstico de laboratorio de este patógeno a partir de cultivos puros; aunque más
rápida y sencilla, con la ventaja inherente que presentan las técnicas moleculares de
identificar concomitantemente el serotipo de la cepa aislada; en este caso, el 1, 5 y/o
7.
69
8. RECOMENDACIONES
Revisar constantemente las bases de datos en busca de secuencias nucleotídicas; de

interés particular, que complementen el análisis bioinformático realizado en este
estudio y soporten aquellos nuevos.
Ampliar la determinación de la especificidad (de especie) incluyendo bacterias

relacionadas; especialmente del género Actinobacillus y otros miembros de la Familia
Pasteurellaceae, con las que no se contaba al momento de la investigación.
Completar los ensayos de especificidad (de serotipo) incluyendo los serotipos del A.
pleuropneumoniae que no se utilizaron en estas pruebas (serotipos 8-15),
inmediatamente estén disponibles y al alcance de los investigadores subsiguientes.
Evaluar el potencial multiplexado in vitro de los primers serotipo-específicos; tanto

en ausencia (PCR triple) como en presencia (PCR cuádruple) de los primers especie-
específicos, con el fin de agilizar aún más la obtención de resultados.
Analizar y comparar las lesiones macro y microscópicas presentes en los especímenes

clínicos a través de estudios de concordancia, cuya finalidad sea la de mejorar la
calidad y cantidad de amplificaciones positivas a la especie A. pleuropneumoniae por
las técnicas de biología molecular.
Determinar los valores analíticos de especificidad y sensibilidad analítica de las

técnicas descritas sobre la base de su aplicación en cultivos bacterianos mixtos, así
como órganos con potencial diagnóstico alternativo, todo bajo el marco del
diagnóstico integral de la pleuroneumonía porcina.
Secuenciar periódicamente productos de amplificación positiva correspondientes a las

regiones específicas tanto de especie (apxIVA) como de serotipo (cps) en el A.
70
pleuropneumoniae, compararlas entre ellas y con aquellas de referencia internacional
en la búsqueda de mutaciones que pudieran llegar a afectar el desarrollo de las PCR,
específicamente el anillamiento de los primers o brindar información epidemiológica
valiosa.
71
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86
10. ANEXOS
Anexo 1
Buffer TBE 10X (1 litro)
Tris base 108 g

Ácido bórico 55 g
EDTA 9.3 g
__________________________________________
Disolver en 800 mL de agua destilada, ajustar pH
a 8.3 y completar a un volumen final de 1 L.
Anexo 2
Especificidad in silico (BLAST) de los iniciadores 1 y 2 contra bases de datos no
redundantes
Max Total Query E Max

Accession Description
score score coverage value ident
Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 3 str. JL03, complete

CP000687.1 37.4 124 35% 10 100%
genome
Actinobacillus pleuropneumoniae L20 serotype 5b complete

CP000569.1 37.4 219 35% 10 100%
genome
Actinobacillus pleuropneumoniae strain 13039 ApxIVA

AF188869.1 37.4 72.9 35% 10 100%
(apxIVA) gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain 405 ApxIVA (apxIVA)

AF188868.1 37.4 72.9 35% 10 100%
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain 8392 ApxIVA (apxIVA)

AF188867.1 37.4 72.9 35% 10 100%
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain 56153 ApxIVA

AF188866.1 37.4 72.9 35% 10 100%
AF188865.1 Actinobacillus pleuropneumoniae strain CVI13261 ApxIVA 37.4 72.9 35% 10 100%
Actinobacillus pleuropneumoniae strain WF83 ApxIVA

AF188864.1 37.4 72.9 35% 10 100%
Actinobacillus pleuropneumoniae strain femo ApxIVA (apxIVA)

AF188863.1 37.4 72.9 35% 10 100%
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain L20 ApxIVA (apxIVA)

AF188862.1 37.4 72.9 35% 10 100%
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain K17 ApxIVA (apxIVA)

AF188861.1 37.4 72.9 35% 10 100%
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain M62 ApxIVA (apxIVA)

AF188860.1 37.4 72.9 35% 10 100%
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae strain S1421 ApxIVA

AF188859.1 37.4 72.9 35% 10 100%
Actinobacillus pleuropneumoniae strain Shope 4074 ApxIVA

AF188858.1 37.4 72.9 35% 10 100%
Actinobacillus pleuropneumoniae strain S1536 ApxIVA

AF188857.1 37.4 72.9 35% 10 100%
Actinobacillus pleuropneumoniae MRP ATPase homolog (mrp)

AF030511.1 gene, partial cds; ApxIVA var3 (apxIVA) gene, complete cds; 37.4 72.9 35% 10 100%
and beta-galactosidase (lacZ) gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae MRP ATPase homolog (mrp)

AF021919.1 and RTX protein (apxIVA) genes, complete cds; and beta- 37.4 108 35% 10 100%
galactosidase (lacZ) gene, partial cds
Pichia guilliermondii ATCC 6260 hypothetical protein

XM_001482241.1 31.9 31.9 15% 446 100%
(PGUG_05311) mRNA, complete cds
Xenopus laevis hypothetical protein MGC83836 (MGC83836),

mRNA >gb|BC070790.1| Xenopus laevis hypothetical protein
NM_001091428.1 31.9 31.9 15% 446 100%
MGC83836, mRNA (cDNA clone MGC:83836
IMAGE:6643233), complete cds
Mus musculus BAC clone RP23-152P20 from chromosome 7,

AC126688.4 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Mus musculus BAC clone RP24-336L24 from chromosome 14,

AC122477.5 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Mus musculus chromosome 7, clone RP23-376D24, complete

AC099609.8 31.9 31.9 15% 446 100%
sequence
Mus musculus BAC clone RP23-333J1 from chromosome 14,

AC151835.4 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
XM_001891095.1 Laccaria bicolor S238N-H82 hypothetical protein partial mRNA 30.1 30.1 14% 1556 100%
Anexo 3
redundantes

Actinobacillus pleuropneumoniae strain 4074 capsular

polysaccharide export-D (cpx1D) gene; capsular polysaccharide
AF518558.1 synthesis-A (cps1A) and capsular polysaccharide synthesis-B 42.8 80.1 37% 0.26 100%
(cps1B) genes; and capsular polysaccharide synthesis-C (cps1C)
gene, partial cds
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 Cps1B (cps1B) gene,

AY496882.1 37.4 37.4 17% 11 100%
partial cds
Platypus DNA sequence from clone XX-307A9, complete

CR536601.8 37.4 62.1 17% 11 100%
sequence
PREDICTED: Apis mellifera similar to ubiquitin-conjugating

XM_392749.3 35.6 35.6 19% 38 95%
enzyme E2M (LOC409225), mRNA
Human DNA sequence from clone RP11-55C5 on chromosome 10

AL355474.15 Contains a novel gene and the 5' end of the FAM13C1 gene for 35.6 63.9 29% 38 100%
family with sequence similarity 13 member C1, complete sequence
AC007071.7 Arabidopsis thaliana chromosome 2 clone T9H9 map nga361, 35.6 86.8 18% 38 100%
complete sequence
Pongo abelii BAC clone CH276-222A20 from chromosome

AC206010.4 33.7 33.7 15% 133 100%
unknown, complete sequence
EF131321.1 Sus scrofa clone KVL1617 microsatellite sequence 33.7 33.7 15% 133 100%
AC190034.5 Rhesus Macaque BAC CH250-532C21 () complete sequence 33.7 33.7 20% 133 91%
Mus musculus chromosome 12, clone RP23-124B21, complete

AC110175.14 33.7 33.7 20% 133 91%
sequence
Human DNA sequence from clone RP11-486D20 on chromosome

AL356601.14 33.7 33.7 15% 133 100%
6, complete sequence
Mouse DNA sequence from clone RP23-337G13 on chromosome

CT010432.7 33.7 33.7 20% 133 91%
NM_072774.4 Caenorhabditis elegans F52E1.13b (F52E1.13) partial mRNA 33.7 33.7 15% 133 100%
AC108022.3 Homo sapiens BAC clone RP11-9D8 from 4, complete sequence 33.7 33.7 15% 133 100%
Mus musculus chromosome 10, clone RP23-145G7, complete

AC027700.11 33.7 33.7 20% 133 91%
sequence
U41109.3 Caenorhabditis elegans cosmid F52E1, complete sequence 33.7 33.7 15% 133 100%
Mouse DNA sequence from clone RP23-231H10 on chromosome

AL954135.7 33.7 33.7 15% 133 100%
Danio rerio lectin C-type domain containing (LOC100002702),

NM_001123404.1 31.9 31.9 14% 463 100%
mRNA
MACACA MULATTA BAC clone CH250-166F20 from

AC204751.3 31.9 31.9 17% 463 95%
chromosome unknown, complete sequence
CP000931.1 Shewanella halifaxensis HAW-EB4, complete genome 31.9 185 34% 463 100%
Homo sapiens catenin (cadherin-associated protein), delta 2 (neural

EU350953.1 plakophilin-related arm-repeat protein) (CTNND2) gene, complete 31.9 56.7 15% 463 100%
cds
CP000903.1 Bacillus weihenstephanensis KBAB4, complete genome 31.9 259 19% 463 100%
Pan troglodytes BAC clone CH251-733P1 from chromosome 1,

AC192794.3 31.9 56.7 33% 463 93%
complete sequence
CP000813.1 Bacillus pumilus SAFR-032, complete genome 31.9 316 37% 463 100%
CP000826.1 Serratia proteamaculans 568, complete genome 31.9 387 35% 463 100%
Callithrix jacchus BAC clone CH259-81H12 from chromosome

AC188761.2 31.9 56.7 28% 463 100%
unknown, complete sequence
Vitis vinifera contig VV78X270457.5, whole genome shotgun

AM448953.2 31.9 31.9 20% 463 91%
sequence
Vitis vinifera contig VV78X033971.7, whole genome shotgun

AM444295.2 31.9 31.9 14% 463 100%
sequence
EF089399.1 Uncultured marine bacterium EB0_39H12 genomic sequence 31.9 60.3 30% 463 100%
Anexo 4
redundantes

CP000569.1 Actinobacillus pleuropneumoniae L20 serotype 5b complete genome 37.4 99.4 35% 10 100%
Actinobacillus pleuropneumoniae putative glycosyltransferase

(cps5A), region 2 capsular polysaccharide biosynthesis protein
AF053723.1 (cps5B), region 2 capsular polysaccharide biosynthesis protein 37.4 74.7 35% 10 100%
(cps5C), and 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid 8-phosphate
synthetase (cps5D) genes, complete cds
Ostreococcus lucimarinus CCE9901 MC family transporter

XM_001421570.1 33.7 33.7 16% 128 100%
(OSTLU_40647) mRNA, complete cds
Ostreococcus lucimarinus CCE9901 chromosome 15, complete

CP000595.1 33.7 33.7 16% 128 100%
sequence
AC097494.3 Homo sapiens BAC clone RP11-273B19 from 4, complete sequence 33.7 33.7 16% 128 100%
Caenorhabditis briggsae hypothetical protein CBG23054 partial

XM_001673829.1 31.9 31.9 15% 446 100%
mRNA
Influenza A virus (A/ruddy turnstone/DE/2046/2001(H5N8))

EF607893.1 31.9 31.9 15% 446 100%
hemagglutinin gene, partial cds
Influenza A virus (A/ruddy turnstone/NJ/1698/2001(H5N7))

EF607891.1 31.9 31.9 15% 446 100%
hemagglutinin gene, partial cds
Vibrio harveyi ATCC BAA-1116 chromosome II, complete

CP000790.1 31.9 107 29% 446 100%
sequence
Medicago truncatula chromosome 8 clone mth2-176c9, complete

AC183305.20 31.9 31.9 17% 446 95%
sequence
Pan troglodytes BAC clone CH251-63H4 from chromosome 5,

AC191970.3 31.9 58.5 15% 446 100%
complete sequence
Pan troglodytes BAC clone CH251-404E14 from chromosome 7,

AC190214.5 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Xenopus tropicalis HMT1 hnRNP methyltransferase-like 1 (prmt2),

mRNA >gb|BC124052.1| Xenopus tropicalis HMT1 hnRNP
NM_001079238.1 31.9 31.9 15% 446 100%
methyltransferase-like 1, mRNA (cDNA clone MGC:147606
IMAGE:7864544), complete cds
Mus musculus BAC clone RP24-213I13 from chromosome 13,

AC147263.3 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Mus musculus BAC clone RP23-159J2 from chromosome 13,

AC129327.4 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Mus musculus BAC clone RP23-346N11 from chromosome 7,

AC135963.3 31.9 56.7 17% 446 100%
complete sequence
Mus musculus chromosome 3, clone RP23-105M18, complete

AC117581.8 31.9 31.9 15% 446 100%
sequence
AC004014.2 Homo sapiens BAC clone CTB-22K14 from 7, complete sequence 31.9 31.9 15% 446 100%
Pan troglodytes BAC clone RP43-16G11 from chromosome 7,

AC146035.2 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Pan troglodytes BAC clone RP43-24J7 from chromosome 7,

AC146170.2 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Pan troglodytes BAC clone RP43-32M11 from chromosome 7,

AC145773.1 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Homo sapiens chromosome 5 clone RP11-375B1, complete

AC113391.2 31.9 58.5 15% 446 100%
sequence
Homo sapiens chromosome 1 clone RP11-524L19, complete

AC097064.2 31.9 31.9 15% 446 100%
sequence
Caenorhabditis elegans C.Elegans Homeobox family member (ceh-

NM_059845.2 31.9 31.9 15% 446 100%
8) (ceh-8) partial mRNA
Homo sapiens chromosome 8, clone RP11-64H23, complete

AC087755.7 31.9 31.9 17% 446 95%
sequence
Homo sapiens chromosome 8, clone CTD1-2019D9, complete

AC068953.9 31.9 31.9 15% 446 100%
sequence
Z81143.1 Caenorhabditis elegans Cosmid ZK265, complete sequence 31.9 31.9 15% 446 100%
Anexo 5
redundantes

Actinobacillus pleuropneumoniae isolate 72-14676 serotype 7

AY534317.1 capsular polysaccharide biosynthesis gene cluster, partial 37.4 69.3 35% 10 100%
sequence
Mouse DNA sequence from clone RP23-145C23 on

BX001049.9 33.7 33.7 16% 128 100%
chromosome X, complete sequence
Pan troglodytes BAC clone CH251-711K1 from chromosome

AC193860.4 31.9 31.9 15% 446 100%
PREDICTED: Equus caballus similar to activin receptor type II

XM_001487856.1 31.9 31.9 15% 446 100%
(LOC100049823), mRNA
AM502228.1 Leishmania infantum chromosome 10 31.9 31.9 15% 446 100%
PREDICTED: Pan troglodytes similar to C19orf46 protein,

XM_001162133.1 31.9 31.9 15% 446 100%
transcript variant 1 (LOC746096), mRNA
XM_001162212.1 PREDICTED: Pan troglodytes similar to C19orf46 protein, 31.9 31.9 15% 446 100%
CP000383.1 Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406, complete genome 31.9 31.9 15% 446 100%
PREDICTED: Macaca mulatta hypothetical protein LOC711904,

XM_001100947.1 31.9 31.9 15% 446 100%
PREDICTED: Macaca mulatta hypothetical protein LOC711904,

XM_001101040.1 31.9 31.9 15% 446 100%
Zebrafish DNA sequence from clone DKEY-191M6 in linkage

CR774192.15 31.9 31.9 15% 446 100%
group 12, complete sequence
Mus musculus chromosome 6, clone RP24-358D8, complete

AC103630.10 31.9 31.9 17% 446 95%
sequence
Drosophila virilis strain Tucson 15010-1001.10 fosmid 26E5,

DQ378281.1 31.9 31.9 15% 446 100%
complete sequence
Homo sapiens 12 BAC RP13-515F16 (Roswell Park Cancer

AC121335.5 31.9 31.9 15% 446 100%
Institute Human BAC Library) complete sequence
Mus musculus 6 BAC RP24-189G6 (Roswell Park Cancer

AC155331.5 Institute (C57BL/6J Male) Mouse BAC Library) complete 31.9 56.7 29% 446 100%
sequence
Rattus norvegicus chromosome 20, major histocompatibility

BX883042.1 complex, assembled from 40 BACs, strain Brown Norway 31.9 31.9 17% 446 95%
(BN/ssNHsd), RT1n haplotype; segment 1/11
Homo sapiens chromosome 5 clone CTC-354F19, complete

AC011354.4 31.9 56.7 16% 446 100%
sequence
Homo sapiens 3 BAC RP11-35D21 (Roswell Park Cancer

AC117390.3 31.9 31.9 15% 446 100%
Homo sapiens 3 BAC RP11-163H6 (Roswell Park Cancer

AC069259.14 31.9 56.7 26% 446 100%
Mus musculus BAC clone RP24-576A3 from chromosome 6,

AC174640.3 31.9 58.5 17% 446 100%
complete sequence
Mus musculus 6 BAC RP24-178H18 (Roswell Park Cancer

AC153994.8 Institute (C57BL/6J Male) Mouse BAC Library) complete 31.9 31.9 17% 446 95%
sequence
Physcomitrella patens subsp. patens predicted protein

XM_001781983.1 30.1 30.1 14% 1557 100%
(PHYPADRAFT_171911) mRNA, complete cds
CP000683.1 Rickettsia massiliae MTU5, complete genome 30.1 54.9 25% 1557 100%
CP000821.1 Shewanella sediminis HAW-EB3, complete genome 30.1 79.6 15% 1557 100%
AP009044.1 Corynebacterium glutamicum R DNA, complete genome 30.1 54.9 25% 1557 100%
Cryptococcus neoformans var. neoformans B-3501A

XM_767928.1 30.1 30.1 14% 1557 100%
hypothetical protein (CNBJ2970) partial mRNA
PREDICTED: Strongylocentrotus purpuratus hypothetical

XM_001181243.1 30.1 30.1 16% 1557 94%
protein LOC758376 (LOC758376), mRNA
PREDICTED: Strongylocentrotus purpuratus similar to

XM_001191570.1 30.1 30.1 16% 1557 94%
MGC82900 protein (LOC591205), mRNA
Anexo 6
Aislamiento e identificación morfológica de colonias de A. pleuropneumoniae
Fuente: Lab. Bacteriología –LNDV (Este trabajo)
Fuente: Lab. Bacteriología –LNDV (Este trabajo)

Anexo 7
Márgenes de Landis y Koch para valorar el grado de acuerdo (concordancia) en
función del índice Kappa (Tomado de Molinero, 2001)
Kappa Grado de acuerdo (concordancia)

<0 Sin acuerdo
0 – 0.2 Insignificante
0.2 – 0.4 Bajo
0.4 – 0.6 Moderado
0.6 – 0.8 Bueno
0.8 – 1 Muy bueno

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA Y DISCRIMINACIÓN DEL

GUSTAVO ANDRÉS RODRÍGUEZ-MÉNDEZ

Bogotá, D. C., Julio de 2010

GUSTAVO ANDRÉS RODRÍGUEZ-MÉNDEZ

GUSTAVO ANDRÉS RODRÍGUEZ-MÉNDEZ

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946

Al Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario del Instituto Colombiano

A la Asociación Colombiana de Porcicultores – Fondo Nacional de la Porcicultura.

A la Dra. Mariluz Villamil y a todos los profesionales de las áreas de Medicina

A la planta de beneficio que permitió la recolección de las muestras, a su personal

A todos aquellos que quisieron participar voluntariamente en este proyecto sin

A Alvarito y Murcia, porque siempre serán mis verdaderos hermanos.

A todos mis fieles compañeros en este viaje que llamo vida,

ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS, SÍMBOLOS Y UNIDADES .............................. x

Figura 1. Microscopía electrónica del A. pleuropneumoniae……………………….5

Figura 2. Representación gráfica del genoma del A. pleuropneumoniae………….14

Figura 4. Diagrama de la organización genética de la región de ADN involucrada

Figura 5. Alineamiento múltiple de la porción 3’ del gen apxIVA en el A.

Figura 6. Representación gráfica de los iniciadores App1F y App1R e

Figura 7. Alineamiento múltiple de la región parcial cps en el A.

Figura 8. Representación gráfica de los iniciadores App7F y App7R e

Figura 9. Ubicación espacial de las regiones parciales cps de los serotipos 1, 5a y 7,

Figura 10. Resultado por electroforesis en gel de agarosa de la amplificación de las

Figura 11. Resultado por electroforesis en gel de agarosa de la amplificación de las

Figura 13. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de

Figura 14. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de

Figura 15. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de

Figura 16. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de

Tabla 1. Características bioquímicas en cepas del A. pleuropneumoniae…………8

Tabla 2. Técnicas de PCR múltiple desarrolladas para el diagnóstico del A.

Tabla 3. Distribución de serotipos del A. pleuropneumoniae por países…………24

Tabla 4. Cepas bacterianas de referencia y aislados de campo utilizadas para la

Tabla 5. Secuencias y propiedades de los iniciadores utilizados para la detección e

Tabla 6. Tabla de contingencia para la comparación estadística entre los resultados

Anexo 1. Buffer TBE 10X.

Anexo 2. Especificidad in silico de los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR contra

Anexo 3. Especificidad in silico de los iniciadores App1F y App1R contra bases de

Anexo 4. Especificidad in silico de los iniciadores App5F y App5R contra bases de

Anexo 5. Especificidad in silico de los iniciadores App7F y App7R contra bases de

Anexo 6. Aislamiento e identificación morfológica de colonias del A.

Anexo 7. Márgenes de Landis y Koch para valorar el grado de concordancia en

Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) es un patógeno respiratorio

Palabras clave: A. pleuropneumoniae, exotoxina, PCR, polisacárido capsular.

Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) is a respiratory pathogen of

Keywords: A. pleuropneumoniae, capsular polysaccharide, exotoxin, PCR.

El A. pleuropneumoniae es el agente etiológico de la pleuroneumonía porcina

2.1 LA PORCICULTURA EN COLOMBIA

Se conoce a la porcicultura como el arte de criar cerdos, arte que está

2.2 COMPLEJO RESPIRATORIO PORCINO

El complejo respiratorio porcino (CRP), es una composición de enfermedades

2.3 Actinobacillus pleuropneumoniae

2.3.1 Características generales

Conocido como App, el A. pleuropneumoniae es un patógeno exclusivo del

Figura 1. Microscopía electrónica del A. pleuropneumoniae. (a) Cápsula, barra 200

Morfológicamente, se presenta al microscopio como pequeñas células en

Sobre la base de diferencias en sus polisacáridos de cápsula principalmente

El genoma del A. pleuropneumoniae es circular como se muestra en la Figura

2.3.4 Factores de virulencia

Varios productos (factores secretados) como estructuras (factores no

Reacción Resultado Reacción Resultado

Ornitina descarboxilasa - Melisitosa -

Lisina decarboxilasa - Rafinosa -

Arginina dihidrolasa - Inulina -