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: allergie
05/2010 • 11-20
Allo scopo di accostare il pediatra all’affascinante universo dell’allergologia molecolare, inizia con questo articolo una
serie di brevi revisioni monografiche con l’intento di poter fornire chiavi di lettura semplici e utili per l’interpretazione dei
test molecolari in allergologia.
I temi trattati comprenderanno:
1) Introduzione all’allergologia molecolare.
2) Profiline, Bet v 1 like proteins, Polcalcine.
5) LTP, Tropomiosine, Parvalbumine.
7) Proteine del Latte Vaccino, Proteine dell’Uovo, Proteine della Carne.
8) Seed Storage Proteins, Chitinasi e Allergeni del Latice.
9) Come s’interpreta un test molecolare e come si consulta un database di allergologia molecolare.
Abstract
L’identificazione e la purificazione degli allergeni è essenziale per condurre studi strutturali ed immunologici atti a
compren-dere in qual modo queste molecole possano indurre la produzione di IgE specifiche. Gli sviluppi nelle tecniche
di biologia molecolare hanno condotto alla produzione di allergeni ricombinanti con caratteristiche costanti, che
consentono la determi-nazione di IgE specifiche dirette contro varie fonti allergeniche, come ad esempio pollini, acari,
ecc. La presenza di allergeni simili in fonti allergeniche diverse è alla base del meccanismo della cross reattività. La
diagnostica molecolare permette di interpretare al meglio alcuni casi di polisensibilizzazione, osservati in precedenza con
i test cutanei e i test in vitro eseguiti con estratti allergenici.
Introduzione all’allergologia molecolare L’inizio Tenendo presente la frase formulata da uno dei maggiori
della diagnostica allergologica può esser fatto esperti di diagnostica allergologica “La diagnosi della
risalire alla scoperta dell’esistenza di IgE specifiche malattia allergica inizia e termina con la storia clinica del
nel siero di alcuni pazienti allergici nel 1967 e alla paziente e con l’esame obiettivo” 3 sarà qui condot-ta una
successiva immissione in commercio di test basati breve rassegna dei test allergologici disponibili,
sull’uso di estratti allergenici. Circa vent’anni dopo, esaminando i pro e i contro di ognuno di essi. In primo
nel 1987, è stato clonato il primo allergene ricombi- luogo è opportuno puntualizzare cosa significhino: “fon-te
nante, il Der p 1 1 2. allergenica”, “estratto allergenico” ed “allergene” 4.
c.alessandri@idi.it
Gli Autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interesse rispetto agli argomenti trattati nell’articolo.
11
Fonte allergenica I ripiegamenti strutturali di una molecola proteica
Con questo termine s’indica il contenitore materiale degli sono di primaria importanza nel meccanismo della
allergeni es.: il cane, l’uovo, il latte sono fonti allergeniche, sensibilizzazione immunologica e nella relativa ri-
non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento. sposta anticorpale. Molte proteine allergeniche, se
sottoposte al calore o all’azione di enzimi proteoli-
tici, come avviene durante la preparazione dei cibi o
durante il processo digestivo, subiscono modifi-
Allergeni cazioni con conseguente perdita degli epitopi con-
Gli allergeni sono proteine, glicoproteine o apte-ni formazionali e possibile smascheramento di epitopi
coniugati a carrier, con peso molecolare tra 5 e 150 lineari.
kDa, e punto isoelettrico compreso tra 2-10 5. Ogni Seguendo queste premesse ad esempio, gli
allergene proveniente da acari, pollini, ecc. può allergeni alimentari sono stati suddivisi in due classi
6: Allergeni alimentari di classe 1, costituiti da protei-
presentare un elevato numero di determinanti antigeni-
ci o epitopi (multivalenza immunologica). È chiamata
ne resistenti alla digestione e al calore, in grado di
comportarsi da allergeni sensibilizzanti
“epitopo” quella sequenza aminoacidica riconosciuta
(“sensitizers”) a livello gastrointestinale. In questa
da uno specifico anticorpo (IgE, IgG, ecc.). Non esi-
classe troviamo ad esempio le maggiori proteine
stono, come erroneamente spesso si è portati a dire,
allergeniche del latte, dell’uovo, del pesce, dei
delle IgE specifiche per il latte (fonte allergenica) o per
crostacei e di alcuni vege-tali.
la caseina (proteina allergenica del latte), ma esistono
Allergeni alimentari di classe 2, costituiti da protei-ne
IgE specifiche dirette verso i determinanti epitopici del-
non resistenti al calore e alla digestione, gene-
la caseina o di altre proteine allergeniche contenute
ralmente incapaci di provocare sintomi sistemici.
nel latte. Gli epitopi possono essere “lineari” (sequen-
Sono presenti nei vegetali, ma anche in alimenti di
za di aminoacidi contigui riconosciuti dalle IgE sulla
derivazione animale (proteine termolabili del latte,
struttura primaria dell’antigene) o “conformazionali” della carne, dell’uovo) e causano sintomi per lo più
(sequenza di aminoacidi non contigui definiti dalla localizzati al cavo orale (sindrome orale allergica) in
struttura tridimensionale della proteina) (Fig. 1). Il nu- quanto, successivamente degradati a livello
mero e il tipo di epitopi conformazionali che caratte- gastrico, perdono il loro potere antigenico. I sintomi
rizzano ciascuna proteina allergenica è scarsamente compa-iono previa sensibilizzazione ad allergeni
conosciuto, mentre è assai più semplice comparare la omologhi contenuti nei pollini, (“non-sensitizing
sequenza primaria di un allergene mediante algoritmi elicitors”). Questo fenomeno, definito “cross-
di ricerca disponibili in Allergome (AllergomeAligner, reattività”, ma me-glio identificato con il termine di
www.allergome.org/script/tools.php?tool=blaster) o co-riconoscimento 7 spiega come mai alcuni pazienti
BLAST in UniProt (www.uniprot.org). possano presentare reazioni anche severe
assumendo alimenti allergiz-zanti mai prima ingeriti.
I ripiegamenti
strutturali di una
molecola proteica
sono di primaria
importanza nel
Fig. 1. Epitopi conformazionali e sequenziali.
meccanismo della
sensibilizzazione
12 immunologica e nella
relativa risposta
anticorpale.
La diagnostica molecolare in allergologia
L’allergenicità di una singola proteina, pertanto, di- sono presenti alle concentrazioni necessarie a indurre
pende: desensibilizzazione. Sono ora in commercio estratti
a) Dai determinanti antigenici (epitopi) riconosciuti da allergenici contenenti proteine naturali purificate per
anticorpi specifici tramite il loro sito combinatorio SPT: Pho d 2 (palma da dattero) 12, Pru p 3 13. Oc-corre
(paratopo). Il riconoscimento dell’epitopo da parte tuttavia ancora una standardizzazione ufficiale di questi
delle IgE avviene in ragione di almeno 6-8 ami- prodotti che pur dichiarando la presenza dell’allergene,
noacidi posti in sequenza lineare e deve esistere non documentano la sua riproducibi-lità, l’eventuale
almeno il 35% d’identità tra due proteine diverse presenza d’isoforme, la completa as-senza di altre
affinché possano essere cross reattive 8. proteine 14.
b) Dalla conformazione spaziale dell’allergene al Gli SPT, pur rappresentando un’insostituibile strumento
momento della sua esposizione a una cellula de- diagnostico in grado di riprodurre in vivo una reazio-ne
putata a presentare l’antigene, quali il IgE mediata, non sono in grado di fornire una sti-ma
macrofago, le cellule dendritiche o i linfociti B. quantitativa delle IgE 15, non sono esenti da rischi di
c) Dall’avidità (grado di reazione) tra IgE ed epito-pi anafilassi 16 17, non sono graditi ai bambini.
che trae origine, a sua volta, dalla somma del I risultati degli SPT possono variare non solo in fun-
numero degli epitopi allergenici presenti sulla zione del tipo di estratto allergenico impiegato, ma
mo-lecola (valenza), dalle dimensioni e dalla anche del tipo di lancetta, dell’abilità e della precisio-ne
confor-mazione della molecola. dell’operatore. Ugualmente i risultati delle IgE spe-
d) Dalla “maturazione dell’affinità”. Nel corso della cifiche in vitro per estratti variano in base all’estratto
risposta immune umorale, infatti, si può assistere impiegato, alla metodica impiegata (CAP, Immulite,
all’aumento dell’affinità degli anticorpi nei con- CARLA ecc.) e non sono pertanto comparabili tra di
fronti dei determinanti epitopici. loro 18. A queste variabili, che possono essere defi-nite
Tutto questo può comportare che un paziente che esame dipendenti, si devono aggiungere quelle legate
pro-duce IgE verso componenti di una determinata alla sintomatologia clinica, all’età del pazien-te, al
fonte biologica non necessariamente abbia sintomi momento in cui sono eseguiti gli accertamenti (esordio
nei con-fronti di allergeni potenzialmente cross della malattia o follow-up), alla prevalenza dell’allergia
reattivi, anche in presenza di test cutanei (SPT) o nella popolazione studiata 19 20. Il limite insuperabile
IgE specifiche posi-tive per quegli allergeni 9 10. consiste nell’impossibilità di stabilire, in un paziente
che mostra una polisensibilizzazione agli SPT o alle
IgE specifiche in vitro, se la polisensibiliz-zazione sia
dovuta a co-sensibilizzazione (sensibiliz-zazione a
Estratti allergenici molecole distinte e uniche di diverse fonti allergeniche)
Gli estratti allergenici comunemente impiegati per la o a un meccanismo di co-riconoscimento
diagnostica di laboratorio in vivo (SPT) e in vitro
(sensibilizzazione a diverse fonti allergeniche conte-
(RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche
nenti molecole omologhe) 7.
definite (cane, acari, polline di graminacee, ecc.).
Si possono ottenere risultati falsamente positivi o
La qualità di questi estratti è migliorata sempre più nel
negativi in presenza di 3 20: alti livelli di IgE totali
corso degli anni, presentando però svantaggi e limiti
difficilmente eliminabili. Gli svantaggi sono legati agli
stessi processi d’estrazione, che causano: perdita di
alcune proteine allergeniche, acquisizione di proteine I risultati delle IgE
da fonti ignote, differente concentrazione e composi-
zione proteica tra un lotto e un altro. Solo da poco specifiche in vitro per
tempo negli estratti sono quantizzate (µg/ml) le con-
centrazioni delle proteine allergeniche maggiori, ma
estratti variano in
non le minori che potrebbero essere addirittura assen-
ti 11. L’assenza o la scarsa concentrazione di proteine
base all’estratto
allergeniche nell’estratto può causare false negatività impiegato e alla
durante la diagnosi e inefficacia delle terapie iposen-
sibilizzanti se le proteine contenute nell’estratto non metodica impiegata,
C. Alessandri et al.
e non sono
pertanto
comparabili tra
di loro.
13
(> 2000 UI/l), legami monovalenti delle IgE [es. per nere, seguite da una singola lettera per la specie e
presenza di determinanti cross reattivi dei infine da un numero indicante l’ordine cronologico di
carboidrati (CCD)] 21, supplementazione di allergeni purificazione dell’allergene: es. Bet v 1, Bet (genere:
ricombinanti all’estratto 22, basso livello di IgE Betullaceae) v (specie: verrucosa) 1 (ordine arbitrario
specifiche in rappor-to alle IgE totali 20, produzione di registrazione) 25.
locale di IgE specifiche e loro assenza in circolo 20, Si usano i termini di:
scarsa presenza dell’aller-gene nell’estratto 20. • Isoallergeni: equivalenti alle isoforme proteiche in
generale, indicano forme molecolari multiple
dello stesso allergene proveniente dallo stesso
organismo con un’estesa, ma non obbligatoria,
Allergeni molecolari cross-reattività. Hanno in genere un peso mole-
Negli ultimi anni sono stati caratterizzati a livello colare molto simile, la stessa struttura terziaria e
molecolare 1785 allergeni (http://www.allergome. la stessa funzione biologica e hanno almeno il
org/script/statistic.php, ultimo accesso 4 settembre 67% d’identità nella sequenza aminoacidica. Ad
2010). esempio di Bet v 1 si conoscono 31 isoallergeni
Il processo d’identificazione e caratterizzazione delle con identità di sequenza tra il 73 e il 98%. Gli
fonti allergeniche ha portato alla produzione e isoallergeni s’identificano aggiungendo un punto
commercializzazione di allergeni naturali purifica-ti o e un numero addizionale es. Bet v 1.01 fino a Bet
prodotti con tecnologia del DNA ricombinante. In tal v 1.31.
modo la produzione dei reagenti, base della • Varianti allergeniche: sono forme alternative della
diagnostica allergologica, può essere standardizzata, stessa proteina che mostrano un numero limitato di
quantificata (peso in grammi), può generare grandi sostituzioni aminoacidiche. Varianti sono state
quantità di allergeni, introdurre mutazioni sito specifi-
descritte per Der p 1, Der p 2, Amb a 1, Cry j 1 e
che per creare ipoallergeni, può clonare isoforme. Le
Bet v 1. Per indicarle si aggiungono altri due nu-
molecole ricombinanti hanno una sensibilità superiore
meri al nome dell’isoallergene, es. Bet v 1.0101. I
al 70% nel mimare la fonte allergica, sensibilità che
primi due numeri distinguono l’isoallergene e gli altri
cresce proporzionalmente all’impiego della combina-
due la variante (Bet v 1 allergene, Bet v 1.01
zione del maggior numero di proteine allergeniche
isoallergene, Bet v 1.0101 variante).
provenienti dalla stessa fonte allergenica 23 24. Pur-
troppo l’impiego di allergeni molecolari ricombinanti in
vivo (es. SPT) è consentito previa registrazione del
preparato come farmaco. Con la produzione di
Nomenclatura e classificazione allergeni naturali
degli allergeni molecolari
Le molecole allergeniche sono divise in “genuins”, vere
purificati o prodotti
marcatrici di una determinata fonte (es. Ole e 1 è la
proteina marcatrice dell’allergia al polline dell’olivo e
con tecnologia del
delle altre Oleaceae) e in “panallergeni”, proteine
condivise da fonti allergeniche anche tassonomica-
DNA ricombinante, la
mente tra loro non correlate, responsabili di apparenti
polisensibilizzazioni ai test eseguiti con estratti (es. la
produzione dei
profilina è un panallergene condiviso da pollini e ali-
menti vegetali, il suo riconoscimento da parte di un
reagenti può essere
paziente allergico ai pollini causerà positività a tutti i standardizzata,
tipi di pollini e alimenti vegetali testati, senza che
necessariamente il paziente accusi sintomi alla loro quantificata, può
esposizione).
La nomenclatura degli allergeni molecolari è definita generare grandi
in questo modo: le prime tre lettere indicano il ge-
quantità di allergeni,
14 introdurre mutazioni
sito specifiche per
creare ipoallergeni, Il microarray per la
le allergeniche
purificate, naturali o
Animali
Graminacee
C. Alessandri et al.
15
Erbe
Alberi
Cane
Cavallo
Gatto
Topo
segue
continua Tab. I
Fig. 2a. Distribuzione del siero sul vetrino. Fig 2c. Misurazione della fluorescenza.
C. Alessandri et al. 17
Il test è altresì in grado di misurare IgE specifiche
36 37
18
con-
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