UTILIZACIÓN PRÁCTICA DE LA CITOMETRÍA DE

FLUJO PARA EL SEGUIMIENTO DE LEVADURAS

EN ENOLOGÍA
V. GERBAUX, J. THOMAS
IFV (Instituto Francés de la Viña y el Vino) Unidad de Beaune, Francia

INTRODUCCIÓN
Las levaduras son particularmente importantes en enología.
Saccharomyces cerevisiae es la especie imprescindible que realiza la fer-
mentación alcohólica. Brettanomyces sp. es una levadura responsable de
frecuentes desviaciones organolépticas. El seguimiento de estas levaduras
no es corriente.
Los análisis automáticos han permitido el seguimiento físico-químico en
enología, pero el control microbiológico ha evolucionado poco en compa-
ración. Esta paradoja para un producto fermentado se explica porque el
vino, por sus características propias está protegido de gérmenes patóge-
nos y por lo tanto no hay exigencias para el control microbiológico. Pero,
con el doble objetivo de mejorar la calidad y controlar costos de produc-
ción, el control microbiológico debe ser reconsiderado. El costo analítico
debe ser entonces tenido en cuenta.
La citometría de flujo no es una técnica nueva. Los progresos actuales en
electrónica y óptica permiten proponer aparatos de gran eficacia adapta-
dos a los laboratorios enológicos. El IFV ha desarrollado un método de
conteo de levaduras vivas utilizando la citometría de flujo. Se han aborda-
do diferentes posibilidades de aplicación práctica considerando tanto vinos
obtenidos por bodegas como aquellos experimentales.

MATERIALES Y MÉTODOS
El aparato utilizado es un modelo Cyflow SL (Sté Partec), equipado de un
láser azul y dos captores (tamaño de partículas y fluorescencia). El análisis
propiamente dicho consiste en mezclar 0.4ml de vino, 0.4ml de solución
patrón específica y 8µl de fluorocromo (Fluoresceína di-acetato, FDA), al
cabo de 10 minutes se inyecta el preparado en el clitómetro de flujo. El
conteo de levaduras se obtiene en menos de 15 minutos. En una hora se
pueden realizar 14 análisis. El rango de conteo va de 100 a 1 millón de
células por mililitro, sin preparación previa de la muestra. Estos valores
pueden variar luego de una concentración por centrifugación o dilución.
Este método, no específico, es aplicable tanto para el conteo de
Saccharomyces, como de Brettanomyces. Salvo caso particular, estas dos
levaduras se suceden en la fermentación: Saccharomyces predomina

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durante la fermentación alcohólica y Brettanomyces tiene la facultad de
desarrollarse en los vinos secos. Su crecimiento puede llegar más o
menos tarde, durante la crianza o a veces en la botella. Si bien el método
de conteo de levaduras vivas por citometría de flujo, no es específico, su
aplicación en enología puede ser interesante en gran número de situacio-
nes.
Como en todo análisis microbiológico, las precauciones en el muestreo
son muy importantes. Para el seguimiento de Brettanomyces en vinos en
crianza, el muestreo debe hacerse sobre todo evitando las levaduras de
superficie. Para un muestreo en una barrica de roble, el uso de una jerin-
ga con capilar da buenos resultados. La muestra no debe ser tampoco
contaminada por los gérmenes presentes en el material. Por diferentes
razones, netamente la sedimentación, la población de Brettanomyces es
creciente desde la superficie hacia el fondo del contenedor. Se aconseja
entonces efectuar el muestreo por arriba de las borras. Es importante tam-
bién verificar que la fermentación alcohólica ha finalizado y que entonces
la flora de Saccharomyces cerevisiae es poco activa o no tiene actividad.
El método de referencia utilizado para el conteo de levaduras es la incuba-
ción en cajas de Petri en estufa con temperatura regulada a 28°C y 5% de
CO2. Se utiliza un medio gelatinoso "Yeast extract, Peptone, Dextrose
(YPD)". Para el conteo de Saccharomyces cerevisae, la incubación es de 2
a 3 días. Para el conteo de levaduras "totales", la incubación es de 7 días.
Para contar Brettanomyces, el medio YPD es complementado con ciclohe-
ximida a 50 mg/l para la inhibición de Saccharomyces cerevisiae y, la incu-
bación es de 7 días.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Seguimiento de una fermentación alcohólica. Un mosto de Chardonnay es
repartido en tres lotes: testigo; con agregado de fosfato de potasio (40 g/hl
después de una pérdida de 25 puntos de densidad); con adición de fosfa -
to de potasio (como en
el lote precedente) y de
activador complejo (20
g/hl después de perder
5 y 25 puntos de densi-
dad). La población de
levaduras vivas es
seguida por citometría
de flujo. El crecimiento
es rápido luego del
agregado de levaduras
(Figura 1). La fase esta-
cionaria se establece
Figura 1: Evolución de la densidad de levaduras vivas en el transcurso de la fermentación entre 60 y 70 millones
alcohólica de un mosto de chardonnay.

Revista Enología 02 Enero - Febrero 2010

de células por mililitro para los tres lotes experimentales. Este nivel de
población queda prácticamente constante dura0nte la fermentación alco-
hólica, realizada a una temperatura de 16 a 18°C. La caída de densidad es
acelerada en presencia de fosfato de potasio y más aun con la adición
complementaria del activador complejo. Para estos dos lotes, la población
de levaduras vivas decrece rápidamente después del agotamiento de los
azúcares (menos de 0.2 g/l constatado en un tiempo de 25 días). En el lote
testigo, la población de levaduras se mantiene a un nivel elevado durante
más tiempo, y el fin de la fermentación alcohólica es más lento (3.8 g/l de
azúcar para un tiempo de 25 días).
Durante el transcurso de la fermentación alcohólica, la citometría de flujo
permite entonces seguir en tiempo real la población de Saccharomyces
cerevisiae. Una caída de población, cuando el fin de la fermentación es
pausado, muestra la necesidad de un nuevo agregado de levaduras y per-
mite anticipar esta operación.

Seguimiento de un pie de cuba. Un vino Chardonnay, característico de un

vino de base para espumantes, es adicionado de 24 g/l de azúcar antes
de ser repartido en frascos con tapa a rosca, para la simulación de una
segunda fermentación. El protocolo de obtención del pie de cuba retoma
la técnica desarrollada por el Comité Interprofesional de Vinos de
Champagne (CIVC). Al final del tiempo aconsejado para su obtención, el
pie de cuba es mantenido para la realización de
agregados sucesivos durante una semana
(Esquema 1). Los análisis de contenido de azú-
car muestran que en el momento del segundo
agregado ("tiraje"), el pie de cuba está en déficit,
lo que no sucede al momento de los otros agre-
gados.
La figura 2 muestra que la población de levadu-
ras vivas crece ligeramente durante la implanta-

Esquema 1: Protocolo de obtención de un

pie de cuba para la elaboración de vinos
efervescentes (fuente CIVC) y manteni-
miento de ese pie de cuba para la realiza- Figura 2: Evolución de la población de levaduras en un pie de cuba mantenido para
ción de tirajes sucesivos. realizar descubes sucesivos.

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ción del pie de cuba. A pesar del agregado de un nuevo medio, la pobla-
ción de levaduras decrece para los segundo y tercer agregados. El agota-
miento de los azúcares en el pie de cuba en el momento del segundo tira-
je es aparentemente la causa de esta baja de la población. Un nuevo cre-
cimiento es constatado para el cuarto tiraje.
Paralelamente las levaduras muertas son seguidas utilizando un fluorocro-
mo específico (ioduro de propidio). El número de ellas aumenta constante-
mente luego del primer y segundo tiraje para estabilizarse después.
El seguimiento de levaduras vivas, durante la segunda fermentación,
muestra un crecimiento
inmediato y regular
para el primer tiraje,
con una fase estacio-
naria ligeramente
superior a un millón de
células /ml (Figura 3).
Se observa un tiempo
de latencia de una
semana para el segun-
do tiraje, confirmando
un estado fisiológico
Figura 3: Evolución de la población de levaduras vivas durante la toma de muestra luego
de descubes sucesivos. poco óptimo para las
células. Para el caso del tercer y cuarto tiraje, el crecimiento es inmediato
y rápido. El nivel de población en "fase estacionaria", del orden de 1.6 millo-
nes de células/ml, es superior al observado para el primer tiraje.
La citometría de flujo permite por un lado un seguimiento dinámico de la
población en un pie de cuba destinado a una fermentación en botella o a
una segunda fermentación, y además ajustar su desarrollo.

Realización de un “mutage”. Para simular esta operación, tres mostos de

Chardonnay, muestreados con diferentes concentraciones de azúcar y
alcohol, son tratados con diferentes dosis de dióxido de azufre (SO2). Para
los tres mostos, la población de levaduras en el momento del agregado de
dióxido de azufre
("mutage") es del orden
de 50 millones de célu-
las/ml (Tabla 1). Para el
mosto 1 (en inicio de
fermentación alcohóli-
ca), una dosis de 100
mg/l de SO2 reduce la
población de levaduras
en 103 y una dosis de
150 mg/l es necesaria
Tabla 1: Evolución de la población de levaduras vivas durante el test de “enmudecido”
para eliminarlas. Para de mostos de chardonnay

el mosto 2, la dosis de
100 mg/l de SO2 elimina la población de levaduras. Para el mosto 3 (el más
avanzado en la fermentación alcohólica), la dosis de 50 mg/l de SO2 pro-
duce un efecto limitado, y la dosis de 100 mg/l elimina la población. Las
determinaciones realizadas 24 y 48 horas después del 3 "mutage" son
similares.
La citometrîa de flujo permite realizar pruebas o test previos al "mutage" de
vinos licorosos, a fin de precisar la dosis de SO2 necesaria para el trata-
miento. Esta técnica puede ser una alternativa a los test de combinación
de SO2. También puede ser interesante para controlar la eficacia de un
"mutage" a posteriori.

Seguimiento de Brettanomyces en vinos tintos durante la crianza. Los con-

teos de Brettanomyces han sido realizados en 144 vinos rojos muestrea-
dos específicamente para este análisis (citado anteriormente en materiales
y métodos). Los vinos están secos y generalmente conservados en barri-
cas de roble. La determinación por citometría de flujo es acompañada por
otra en Caja de Petri (medio YPD con agregado de cicloheximida). Las
poblaciones de levaduras determinadas por citometría de flujo están fuer-
temente correlacionadas con las determinadas en Caja de Petri (Tabla 2).
Para esta aplicación, el límite inferior de determinación fijado es 200 célu-

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 Tabla 2: Determinación de la población de Brettanomyces en 144 vinos tintos durante la etapa de maduración

las/ml para la citometría de flujo (teniendo en cuenta la dilución a la mitad

con el patrón). Para los vinos en cuestión, el conteo en Caja de Petri indica
siempre menos de 200 Brettanomyces por ml.
En algunos casos, las determinaciones en Caja de Petri muestran pobla-
ciones muy inferiores a las obtenidas por citometría de flujo. Varias expli-
caciones son posibles. La muestra puede estar contaminado con levadu-
ras de superficie o provenientes del material. Una población activa de
Saccharomyces cerevisiae puede subsistir paralelamente a una finaliza-
ción de la fermentación alcohólica lenta. Finalmente, Brettanomyces puede
estar en un estado fisiológico que impide el desarrollo en Caja de Petri,
como lo muestra la experiencia siguiente.
Una cuba de Pinot Negro contaminado con Brettanomyces es dividida en
dos lotes: testigo y agregado de 30 mg/l de SO2. Para el lote testigo, la
población se mantiene elevada y los resultados obtenidos tanto en citome-
tría de flujo como en Cajas de Petri son equivalentes (Figura 4). Para el lote
sulfitado, los resultados
difieren según el méto-
do utilizado. En Caja de
Petri, la población es
débil y representa las
levaduras cultivables.
Paralelamente la cito-
metría de flujo tiene en
cuenta todas las leva-
duras vivas, cultivables
o no. Esta observación
pone en evidencia un
estado "vivas pero no
Figura 4 : Evolución de la población de Brettanomyces en un vino rojo sulfitado o no. cultivables" en
Brettanomyces.
Una experimentación
complementaria
muestra la relativa
buena tolerancia de
Tabla 3: Efecto inmediato del SO2 sobre la población de Brettanomyces en un vino tinto
Brettanomyces al SO2
contaminado (células/ml) (Tabla 3). Una hora

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aproximadamente luego del agregado, solo una dosis de 50 mg/l elimina
95% de la población. La dosis de 30 mg/l elimina 22% de la población de
Brettanomyces del vino 1 y 81 % de aquellas del vino 2. La eficacia del sul-
fitado depende de las características del vino (netamente del pH) y de la
población de Brettanomyces.
Durante la realización de la fermentación maloláctica y la crianza de los
vinos rojos, la citometría de flujo permite entonces seguir la presencia y el
nivel de la población de Brettanomyces. La evidencia de un crecimiento
celular muestra el grado de urgencia de una operación de estabilización.
Esta puede ser realizada antes de la aparición olfativa del carácter fenóli-
co. Paralelamente, la citometría de flujo permite ya sea de test de estabili-
zación de vinos contaminados con Brettanomyces, o de verificar la efica-
cia de una operación de estabilización en el tiempo.

Puesta en evidencia del desarrollo de levaduras en vinos embotellados.

Los conteos de levaduras vivas han sido realizados en 43 vinos blancos
embotellados que presentan turbidez. El análisis en citometría de flujo es
acompañado por una determinación en Cajas de Petri con un medio no
específico. La población determinada por citometría de flujo está bien
correlacionada con la obtenida en Cajas de Petri para niveles superiores a
200 células/ml (Tabla 4). Para los niveles más débiles la citometría de flujo
es imprecisa y da valores superiores a los obtenidos en Cajas de Petri. La
turbidez del vino no está ligada con la población de levaduras vivas.
Los conteos de Brettanomyces han sido realizados en 81 vinos rojos
embotellados. La determinación por citometría de flujo es duplicada por
una determinación en Cajas de Petri (medio YPD adicionado de ciclohexi-
mida). Las determinaciones con citometría de flujo están fuertemente
correlacionadas con las obtenidas en Cajas de Petri (Tabla 5). Estas últimas

Tabla 4: Determinación de la población de levaduras vivas en 43 vinos blancos de botellas que presentaron alguna alteración

Tabla 5: Determinación de la población de Brettanomyces en 81 vinos tintos embotellados

Revista Enología 07 Enero - Febrero 2010

tienden sin embargo a presentar valores más débiles. La población viva de
Brettanomyces en una botella es más o menos añeja y puede estar com-
puesta de células vivas pero no cultivables, no mostradas en Cajas de
Petri. La turbidez encontrada no está ligada con la población encontrada.
La citometría de flujo se aplica al control de los vinos embotellados, ya sea
para asegurarse de una buena estabilidad microbiológica en el tiempo, o
para explicar un defecto constante. Esta técnica analítica puede también
dar una información interesante para la preparación de vinos a embotellar.
El conocimiento de la población de levaduras vivas, en este estado, permi-
te orientar las operaciones de estabilización consecuentemente. Con res-
pecto a Brettanomyces, netamente, este control puede evitar las contami-
naciones cruzadas ligadas a los equipamientos.

CONCLUSIONES
Los trabajos presentados muestran que múltiples aplicaciones enológicas
son hoy posibles con la citometría de flujo. El método propuesto es simple
y rápido. El hecho de no ser específico de una especie de levaduras puede
ser una ventaja. Cuando la citometría de flujo indica la presencia de una
población por debajo del límite de detección (200 células /ml o menos), la
cuestión de la especificidad no se plantea. Cuando la citometría indica la
presencia de una población de levaduras vivas, es interesante tener infor-
mación complementaria sobre el producto analizado para interpretar
correctamente el resultado: desarrollo de la fermentación alcohólica y
eventualmente maloláctica, sulfitados,… Si aparece una duda, siempre es
posible recurrir a técnicas más específicas (Cajas de Petri, PCR cuantitati-
va).
Un citómetro de flujo dedicado a aplicaciones enológicas ha sido desarro-
llado (Oenolyser, Sté Partec), como así un kit de detección que retoma el
método de análisis desarrollado por el IFV (Kit OenoYeast). El Cyflow SL,
utilizado para los trabajos presentados, y el Oenolyser han sido compara-
dos para conteos en 30
vinos diferentes (10
blanco y 20 rojos). Los
resultados obtenidos
con los dos aparatos
son muy próximos Tabla 6: Comparación de la citometría de flujo para el recuento de la población de
levaduras vivas en 30 vinos tintos y blancos
desde el punto de vista
microbiológico (Tabla 6).
La citometría de flujo está hoy a disposición de los laboratorios enológicos.
Esta técnica no necesita un medio ambiente específico. Sin embargo da
una información microbiológica que demanda una interpretación propia de
su dominio. Las condiciones de realización de las muestras a analizar son
determinantes e imponen la puesta en práctica de un procedimiento estric-
to. La citometría de flujo ofrece nuevas posibilidades para el desarrollo de
la enología predictiva y preventiva.

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