AOAC Método Oficial 991.

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Ocratoxina A en el maíz y la cebada
Método por cromatografía liquida
Primera Acción 1991
Acción Final 1996

(Cuantificacion para la ocratoxina A en 10 ng / g en el maíz y la cebada.)

(Atención: La ocratoxina A causa daño a los riñones y el hígado y es cancerígenos en
algunos animales. observar las indicaciones dada en la declaración introductoria de este
capítulo, y ver Apéndice B, notas de seguridad sobre los disolventes especificados.)

Metodo de rendimiento
Maíz, 10 ng ocratoxina A / g
SR = 1.7; RSDR = 20.7%

Maíz, 20 ng ocratoxina A / g
Sr= 3.3; SR = 4.6; RSDr = 20.1%; RSDR = 28.4%

Maíz, 50 ng ocratoxina A / g
SR= 12.2; RSDR = 31.7%

Cebada, 10 ng ocratoxina A / g
SR= 2.0; RSDR = 27.2%

Cebada, 20 ng ocratoxina A / g
Sr= 1.1; sR = 3.8; RSDr = 7.9%; RSDR = 26.5%

Cebada, 50 ng ocratoxina A / g
SR = 10.2; RSDR = 27.6%

A. Principio

La ocratoxina A se extrae de los granos con cloroformo-acuoso ácido fosfórico, y aislados

mediante la separación líquido-líquido en la solución de bicarbonato acouso. El extracto
se aplicó a una columna C18, y la ocratoxina A se eluye con ácido acetato de etilo-
metanol-acético. La ocratoxina A se identifica mediante cromatografía líquida en fase
inversa, y se cuantificó por fluorescencia. Cromatografía de ocratoxina A el derivado de
éster de metilo confirma la identidad.
B. Aparato
(a) Mezclador de alta velocidad; frasco con tapa con 1250 ml de capacidad

(b) Cromatografía líquida; Bomba, 0,5 - 5 ml / min, 3.000 psi, la reproducibilidad de

flujo 0,1%. Válvula de inyección con 25 ml del circuito. Para detector de
fluorescencia con rejilla, ajustar la excitación a 333 nm y emisión a 460 nm; para
detectar la fluorescencia con filtro, utilice 420 nm filtro de corte. Utilice el
registrador o integrador que sean compatibles. Condiciones de funcionamiento:
velocidad de flujo de 1.0 ml / min; sensibilidad fijada para 4-8% de respuesta
máxima de la escala de 2.0 ng ocratoxina A y <2% de ruido; tiempo de retención
10 a 13 min; volumen de inyección de 20 - 25 ml, usar 50 ml para llenar el cirucito
de 25 mL.

(c) Columna analítica de LC; Se llena con 5 mm C18 unido con gel de sílice (Supelco
Inc., Bellefonte, PA 16823, EE.UU., o equivalente).

(d) Columna de adsorción; 500 mg 40 um C18 en un tubo de 3 ml de polipropileno

(Supelco Inc, o equivalente).

(e) Colector de vacio; 12 puertos, con llaves de cierre para cada puerto para las
columnas de retención C18

(f) Filtros de fibra de vidrio; 0,33 mm de espesor, 1,5 mm de poro de retencion , 9,0
cm de diámetro (Whatman No. 934 AH, o equivalente).

(g) Microfiltro; 0,45 mm filtro de jeringa de retención de poro (Gelman Acrodisc 3CR
PTFE, Gelman Sciences, Inc., Ann Arbor, MI 48106, EE.UU., o equivalente)

C. Reactivo

(a) Solventes; Cloroformo, cloruro de metileno, acetato de etilo, benceno, y metanol,

ACS grado, en vidrio. Acetonitrilo, LC grado. (Precaución: El benceno es un
agente tóxico, produciendo tumores Uso en campana.)

(b) Productos químicos; El ácido fosfórico, bicarbonato de sodio, ácido acético, Grado
ACS.

(c) La tierra de diatomeas; Ver 973.37C (a) (ver 49.5.01).

(d) Fase móvil LC; Agua-acetonitrilo-ácido acético (99 + 99 + 2). Utilice agua de grado
LC.

(e) Solución de ácido fosfórico; 0.1M. Diluir 5.75 g de ácido fosfórico al 85% con 500
ml de agua.
 (f) Solucion estándar de Ocratoxina A; Acerca de 24 ug / ml en benceno ácido acético
(99 + 1). Determine la concentración como en 973.37C (i) (ver 49.5.01). Diluir la
solución madre con benceno - con una solución de ácido acético para obtener
solución de trabajo estándar (4 mg / mL).

(g) Solución de BF3-metanol; 14% BF3. (Precaución: Uso de la capucha. Evite el

contacto con la piel, los ojos y las vías respiratorias.)

D. Preparación de la muestra

Preparar la muestra como en 977.16 (ver 49.2.01).

E. Extracción

Pesar 50 g de porción de ensayo en la licuadora, agregar 25 ml 0,1 M de ácido fosfórico y

250 ml de cloroformo, y mezclar 3 minutos a velocidad media. Cerca de terminar de
mezclar añadir 10 g (45 ml) de tierra de diatomeas. Filtrar y extraer a través de papel de
fibra de vidrio cubierta con ca 10 g de diatomeas de tierra con un embudo Buchner de 9
cm (o por gravedad a través de 32 cm estriado de papel). Recoger > 50 ml de filtrado.

F. División

Transferir 50 ml de filtrado de embudo de separación. Añadir 10 ml de bicarbonato de

sodio al 3% , y agitar suavemente. Deje que las fases se separan. Si se froma emulsión ,
centrifugar de 2 min a 2000 rpm. Recoger la parte superior (bicarbonato) fase para la
extracción de la columna.

G. Preparación de columna

Coloque las Columnas C18 en puertos múltiples de vacío con 25 ml Erlenmeyer o vasos
de precipitados en el interior del colector para la recogida acondicionado y lavar los
solventes. Lavar cada columna 2 X con ca 2 ml de metanol, 2 ml de agua, y 2 ml de
bicarbonato de sodio al 3%. Para acelerar eluciones, aplicar succión suave (o aplicar
presión con 5 - 10 ml jeringa adaptado a la parte superior de la columna). NO DEJE
SECO LA COLUMNA CORRIDA. Deja ca 2 mm solvente en la parte superior de la frita.

H. Extracción de la columna

Pipetear 5 ml de extracto de bicarbonato a la columna C18, siguir con 2 ml Ácido fosfórico

0,1 M, a continuación, 2 ml de H2O. Lavar el descarte. Eluir la ocratoxina A con 8 ml de
acetato de etilo-metanol-ácido acético (95 + 5 + 0.5) en 10 ml de tubo de ensayo o vial
que contiene 2 ml de agua. La Columna C18 usada se puede regenerar poniendo en
acondicionamiento como se ha descrito para las nuevas columnas. Agite o revuelva con
varilla de vidrio para mezclar las 2 fases. Pipetear 7ml de la ocratoxina A de extracto (fase
superior) con tapón de rosca . Enjuague la fase superior restante del tubo con 2 x 1 ml de
acetato de etilo y añadir a la ocratoxina A. Evaporar y extraer sólo a sequedad en baño de
vapor bajo N2
I. Determinación LC
(a) curva estándar; Preparar curva estándar al comienzo del análisis y siempre que
las condiciones cromatográficas cambian. Separar 4 - 5 ml viales con tapón de
rosca forradas de teflon, utilice jeringas uL para dispensar 25, 50, 100, y 200 uL
solución de trabajo estándar (4 ng / ml). Evaporar simplemente a sequedad bajo
N2. Añadir 1,00 ml de la fase móvil LC a cada vial para concentraciones finales
ocratoxina A de 2.5, 5, 10, y 20 ng / 25 uL. Cromatografiar cada solución estándar.
Utilizando el origen como punto fijo, las alturas de los picos de parcela o áreas vs
2.5, 5, 10, 20 ng ocratoxina A para linealidad. Calcular (normalizar) respuesta (R1-
4) de ocratoxina para 1 ng A para cada una de las 4 concentraciones estándar
(C1-4). Calcula respuesta promedio (Ra) para 4 concentraciones estándar, y
determinar porcentaje de desviación (D) de los valores individuales de la media de
la siguiente manera:

Ra = (R1/C1 + R2/C2 +R3/C3 + R4/C4)/4

D = 100 [(R/C) – Ra]/Ra
La desviación debe ser de 5% Si el valor D> 5 omitir y calcular la tasa de uso 3
estandares . Si 3 valores no están de acuerdo,a las soluciones estándar de
cromatografía, entonces preparar nuevas soluciones estándar.

(b) Muestra; Disolver el extracto de la muestra de H en la fase móvil LC (500 uL) y se

filtra a través de 0,45 um microfiltro en 5 ml del frasco con tapón de rosca.
Cromatógrafo de muestra. Identificar la ocratoxina A el tiempo de retención (debe
ser igual a la de la ocratoxina estándar A). Si la muestra ocratoxina A da respuesta
fuera del rango de la curva estándar, ajustar el volumen de la muestra mediante la
concentración o dilución de la solución de muestra. Reserva la solucion restante
de la muestra para la confirmación de la identidad mediante la formación de éster
metílico. Calcula ocratoxina A la concentración en la muestra de la siguiente
manera.

OTA (ng/g) = (Rs x VT)/(Ra VI W) = (Rs F)/Ra

Donde
W = (50 g x 50 ml x 5 ml) / (250 ml x 10 ml) = 5 g (peso de muestra de prueba
representado por extracto final)
Rs = respuesta de la muestra de ensayo inyectado
Ra = medio calculado respuestas normalizadas (respuesta de 1 ng ocratoxina A)
de las 4 concentraciones de la solución de trabajo estándar;
VT = volumen de la muestra de ensayo = final (500 uL)
VI = muestra de ensayo inyectado (25 uL)
F = 4.
 J. La confirmación de la identidad de la ocratoxina A porla formación de éster
metílico

Cuantitativamente transferir muestra reservada restante , I (b), tomar 25 ml en el embudo

de separación, utilizando 3 '1 ml de cloruro de metileno para enjuagar el vial. Agitar y dejar
que las capas se separan. Recoger la capa inferior en 5 ml del vial y evaporar a
sequedad. Transferir 100 ml de trabajo estándar de ocratoxina A a otro vial 5 ml y se
evapora a sequedad. Añadir 0,5 ml 14% BF3-metanol a cada vial, tapar, y llevar a baño
maria por 15 minutos a 50 - 60 ° C. Se evapora a sequedad bajo N2. Si H2O está
presente, añadir 1 ml de acetonitrilo y continuar la evaporación a sequedad. Dejar enfriar
y diluir con la Fase móvil de LC el mismo volumen que se utilizo para el análisis de LC.
Cromatógrafo derivatizó muestra y el estándar. La confirmación positiva es la
desaparición del pico en Rt para la ocratoxina A (10-12 min) y el aspecto del nuevo pico
en la misma Rt como éster metílico nivel de ocratoxina A (aproximadamente 15 minutos
más tarde). Preparación cuantitativa cuidadosa de éster puede confirmar el análisis
cuantitativo de la ocratoxina A en la muestra, y debe estar de acuerdo 5%.

Referencia: J. AOAC Int. 75, 48 (1992).

No. CAS 303-47-9 (ocratoxina A)

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