LICENCIATURA EN CIENCIA Y Métodos de análisis del contenido

TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS proteínas en alimentos

QUÍMICA
Í DE LOS ALIMENTOS La determinación de la CANTIDAD DE PROTEÍNA
de un alimento no es sencilla y el valor obtenido en
cada caso depende del MÉTODO
É utilizado.

Muchos ensayos dependen de la presencia de

ÁNALISIS DEL CONTENIDO una determinada cadena lateral aminoacídica
(Lowry, Biuret).
DE PROTEÍNAS
los resultados analíticos se verán
EN LOS ALIMENTOS condicionados por la proporción del
aminoácido en cuestión en las proteínas
sometidas al ensayo y necesitarán ser
2014 referidos a alguna proteína estándar.

Dra. Roxana Verdini Otros métodos se basan en la determinación del

contenido de nitrógeno total (Kjeldahl).
rverdini@fbioyf.unr.edu.ar

Métodos de análisis del contenido Métodos de análisis del contenido

proteínas en alimentos proteínas en alimentos
Existen numerosas fuentes de NITRÓGENO NO Los métodos mas comúnmente empleados son:
PROTEICO que pueden interferir en algunos
métodos de análisis:
Kjeldahl,
aminoácidos libres, péptidos pequeños,
libres pequeños Kjeldahl/Bethelot,
Kjeldahl/Bethelot
ácidos nucleicos, fosfolípidos,
aminoazúcares, porfirina, algunas
Biuret,
vitaminas, alcaloides, ácido úrico, urea, Lowry,
iones amonio, etc.
absorbancia a 280 nm,
Otras fuentes de interferencia pueden ser los fijación de colorantes,
otros macronutrientes presentes en los alimentos
como hidratos de carbono y lípidos.
turbidimétrico.
turbidimétrico
 Métodos de análisis del contenido Método de Kjeldahl
j
proteínas en alimentos
Es un método oficial descrito en múltiples
Estos métodos se fundamentan en: normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintas
Directivas Comunitarias.

determinaciones de nitrógeno, El método de Kjeldahl se basa en los siguientes

enlaces peptídicos,
peptídicos supuestos:
la proporción de nitrógeno no proteínico en
aminoácidos aromáticos, un producto alimenticio es demasiado pequeña
absortividad UV de las proteínas, para ser significativa,
i ifi ti
grupos amino libres, una determinación del contenido de
nitrógeno
it ó t t l (refleja
total ( fl j con suficiente
fi i t precisión
i ió
propiedades de dispersión de la luz, el contenido de proteína del alimento,
capacidad de adhesión de colorantes.
colorantes lal proporción
ió que representat ell nitrógeno
it ó en
la mayor parte de las proteínas alimenticias es
de 16%.
6%

Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
FUNDAMENTO
 El ácido sulfúrico oxida la materia orgánica y se
combina con el amonio formado.
formado
 Involucra la conversión del nitrógeno presente a  Los elementos carbono e hidrógeno se
sulfato de amonio por DIGESTIÓN,
DIGESTIÓN DESTRUCCIÓN convierten en dióxido de carbono y agua.
agua
OXIDATIVA O MINERALIZACIÓN con ácido
sulfúrico.
Durante la digestión se libera el nitrógeno
proteico para formar iones de amonio.
amonio
Posteriormente el sulfato de amonio se Esta determinación incluye todo el nitrógeno
descompone por ALCALINIZACIÓN con hidróxido reducido presente (-NH
( NH2 y =NH),
=NH) de modo que los
de sodio y DESTILACIÓN del amoníaco liberado compuestos amoniacales, urea y aminoácidos
captándolo en una solución ácida. libres son también valorados.

Finalmente se realiza una VALORACIÓN del

 El uso de perlas de vidrio sirve de núcleo para la
formación de burbujas.
amoníaco.
amoníaco
 Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
ECUACIONES UN POCO DE HISTORIA

 En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl

Digestión:
g
desarrolló el proceso básico del conocido método
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 actual de análisis de proteínas por el método
Kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno
Neutralización y destilación
orgánico.

((NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

El método original fue sufriendo luego algunas
NH3 + H3BO3 +
NH4 + H2 BO3 -
modificaciones.

Titulación  Wilforth (1885)

H2BO3- + H+
 Gunning (1889)
H3BO3
 Arnold
 Winkler

Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA UN POCO DE HISTORIA

 En el método original la digestión se efectuaba  Los catalizadores permiten acortar el tiempo de

con una mezcla de ácido sulfúrico y anhídrido
fosfórico y la oxidación se completaba mediante la
adición de permanganato de potasio.
Las modificaciones del método
resultado más útiles emplean:
óxido de mercurio como catalizador de
oxidación (Wilfoth).
 K2SO4 para aumentar el punto de
ebullición del ácido sulfúrico (Gunning).
(Gunning)
 CuSO4 también como catalizador de
oxidación (Arnold).
digestión y actúan como transportadores de O2.
Cuando se usa Hg como catalizador, éste debe
ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato
que han de sodio para liberar el NH3.
 Otra modificación ampliamente aceptada es la
introducida en la etapa de destilación propuesta por
Winkler:
 originalmente se utilizaba ácido sulfúrico
valorado para captar el amoníaco,
 titulando posteriormente su exceso con
NaOH valorado.
 Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
UN POCO DE HISTORIA ESQUEMÁTICAMENTE

La modificación consiste en:

 recibir el NH3 sobre una solución de
ácido bórico,
 valorarlo directamente con solución
valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.

Ventajas: la solución de ácido bórico no necesita

ser exactamente medida,
medida eliminando los errores en
la medición del ácido valorado en el colector y por
otra parte sólo se requiere una solución valorada
H2SO4 o HCl.

Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
ESQUEMÁTICAMENTE UNIDADES DE DIGESTIÓN Y DESTILACIÓN
 Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
ALGUNOS EQUIPOS UNIDADES DE DIGESTIÓN, SCRUBBER Y BOMABA

Los equipos mas modernos vienen con un

sistema
i t d extracción
de t ió y neutralización
t li ió de
d gases:

una unidad “Scrubber” que bloquea el paso y

neutraliza las condensaciones ácidas,

una bomba de recirculación de agua que

proporciona
i un gran caudal
d l de
d vacío
í para la
l
aspiración de los gases.

Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
DESTILADORES DESTILADORES Y TITULADORES
 Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
VENTAJAS DEL MÉTODO FACTOR DE CONVERSIÓN

Apropiado para varios tipos de productos.
Alta confiabilidad.
Usado como método de referencia.
referencia
El contenido porcentual promedio de N en las
proteínas de diversos alimentos es de 16%.
16%
El factor para convertir N en proteínas sería
entonces 100/16 = 6,25.

DESVENTAJAS DEL MÉTODO Este factor general de conversión no es sin

embargo exacto, ya que las proteínas de origen
animal contienen generalmente menos nitrógeno y
Interfieren compuestos nitrogenados no
las de origen vegetal más.
proteicos.
Uso de catalizadores tóxicos o caros.
caros Así,
Así el factor de conversión para la proteína del
trigo es 5,7 y para la de productos lácteos es 6,38.
Elección del factor de conversión.

Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
FACTOR DE CONVERSIÓN FACTOR DE CONVERSIÓN

Actualmente se conoce el contenido de N, y por

lo tanto el factor apropiado,
apropiado de una gran cantidad
de productos agrícolas.

Debido a la confusión que podría derivarse del

hecho de utilizar el factor general de conversión
6 25 o el específico para la proteína en estudio
6,25

 Es necesario aclarar siempre en los informes

el factor de conversión utilizado para el cálculo
de proteínas.
 Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
ECUACIONES CÁLCULOS

Digestión:
g %N = V x N x 14 x 100
1000 p
n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Neutralización y destilación %N = V x N x 0,014 x 100

p
((NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O

NH3 + H3BO3 NH4 + H2 BO3-

+

V: mL de ácido
Titulación N: normalidad del ácido
P: gramos de muestra
H2BO3- + H+ H3BO3 ,
0,014: equivalente
q volumétrico del N

Método de Kjeldahl
j Método de Kjeldahl
j
Método de Kjeldahl/Berthelot Método de Kjeldahl /Berthelot

 Este método combina la digestión húmeda del  La absorbancia del complejo de se lee a 540 nm.
método de Kjeldahl con la reacción colorimétrica de
Bethelot.  Se calibra con solución de sulfato de amonio.
 Al producto de la digestión se le reduce la
Por lo tanto lo que se determina por este método
acidez, lleva a volumen final y luego una alícuota se
es nitrógeno total.
somete a la reacción colorimétrica.
 El NH4+ presente en la digestión sulfúrica
reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio en
medio alcalino, formándose un complejo de color
azul.
 La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra.
muestra
 Otros métodos Otros métodos
 Los alimentos son una matriz compleja por lo Método de absorbancia a 280 nm
que se sugiere que estos métodos empíricos e
indirectos sean calibrados con el método de
 El método se basa en la medición de
absorbancia a 280 nm.
Kjeldahl.
Kjeldahl
 La mayoría de las proteínas muestran una
 Se espera una buena correlación entre estos dos absorción a 280 nm., la cual se atribuye al grupo
tipos de determinaciones de proteína cuando la fenólico de la tirosina y al grupo indólico del
relación N no proteico/N proteico es baja y triptofano.
constante.
constante

Son satisfactorios para leche y cereales e
insatisfactorios para la mayoría de los vegetales y
mezclas de alimentos.

Otros métodos Otros métodos

Método de absorbancia a 280 nm
 Es un método simple, rápido y no destructivo.
 Es un método directo para la determinación de
proteínas que puede aplicarse en algunos sistemas
alimenticios.
 Es necesaria la calibración con una proteína
estándar.
La solución debe ser clara e incolora, la turbidez
puede afectar los resultados.
 El contenido de aminoácidos aromáticos difiere
considerablemente entre las distintas proteínas.
Los ácidos nucleicos interfieren (anillos de
purina y pirimida), no así el amonio.
Método de Biuret
El método comprende un ensayo colorimétrico
de un paso donde se cuantifica la formación de un
complejo estable entre proteínas y cobre (II) de
configuración desconocida.
El complejo presenta un color violeta
característico, que se puede observar a 310nm o
540-560nm el cual se da por la coordinación de un
540-560nm,
átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno.
El complejo se basa en la desprotonación de los
grupos amida para formar el enlace con el cobre (II)
o por el establecimiento de un enlace coordinado
entre el metal y los pares de electrones libres de los
átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido.
 Otros métodos Otros métodos
Método de Biuret Método de Biuret
 Después de la adición del reactivo de cobre se
requiere de tiempo para desarrollar una coloración
de Biuret estable; es necesario considerar la
posible influencia de aminoácidos libres que
forman buffer en configuración tris y amoniaco.
amoniaco
 El complejo tiene dos máximos a 330 y a 545 nm.
 La lectura se hace usualmente a 545 nm, dado
que a la longitud de onda de 330 es mas
susceptible a las interferencias.
interferencias

Otros métodos Otros métodos

Método de Lowry
Método de Biuret
El método
ét d ded Lowry
L combina
bi l reacción
la ió ded
Es rápido, simple y no detecta nitrógeno de Biuret con la reducción del reactivo de Folin-
fuentes no proteicas o no peptídicas. Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico)
Es necesaria la calibración con una proteína por la oxidación de tirosina, triptofano, cisteína,
estándar. cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen,
1988).
1988)
Altas concentraciones de carbohidratos, lípidos
pueden causar opalescencia en la solución final. El proceso de oxido-reducción se acompaña de
l formación
la f ió de
d un color
l azull característico.
t í ti
Las sales de amonio también interfieren en la
reacción. Los quelatos de cobre en la estructura del
péptido
é tid facilitan
f ilit l transferencia
la t f i de
d electrones
l t d
de
Se ha encontrado poca aplicación en análisis de los grupos funcionales amino al cromóforo ácido.
alimentos debido a la presencia de interferentes
como azúcares reductores que reducen el ion  Este
E t método
ét d es útil para determinar
d t i pequeñas
ñ
cúprico en medio alcalino produciendo resultados cantidades de proteína en una disolución.
insatisfactorios Ejemplo: leche.
insatisfactorios. leche El desarrollo
d ll de
d color
l es dependiente
d di t del
d l pH,
H que
se debe mantener entre 10 y 10.5.
 Otros métodos Otros métodos
Método de Lowry
Método de Lowry
Tiene mayor sensibilidad que el método del
Biuret.
La respuesta del color varía de acuerdo al tipo de
proteína.
La intensidad del color no es estrictamente
proporcional a la concentración de proteína.
Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de
carbono interfieren en la reacción.
Es menos afectado por la turbidez de la muestra.
Es afectado por la presencia de azúcares
reductores al igual que el método de Biuret.

Otros métodos Otros métodos

Métodos de adhesión de colorante Métodos de adhesión de colorante aniónico

 Controlando el pH y la fuerza iónica del medio

los g
grupos
p funcionales ácidos y básicos de las El COLORANTE ANIÓNICO se une a los grupos
proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos catiónicos de los residuos básicos de las proteínas
de carga opuesta. (histidina, arginina, lisina) y forman un complejo
insoluble.
insoluble
Al realizarse la unión se presenta coloración o
bien un cambio de ésta. El colorante en exceso permanece soluble y se
relaciona inversamente con la concentración de
Comúnmente se usan colorantes sulfonados los proteínas.
cuales reaccionan a pH ácido con el grupo ε-amino
d la
de l lisina
li i y ell grupo guanidina
idi d la
de l arginina,
i i ell El método con el colorante NARANJA 12 está
imidazol de la histidina y un número limitado de α- descripto en la AOAC para leche fluida, helados,
amino
a o te
terminales.
a es leche en polvo descremada (λ=480 nm).

Pueden adherirse colorantes ANIÓNICOS o Algunos compuestos no proteicos como almidón

CATIÓNICOS
C Ó COS ((BRADFORD).
O ) o metales pueden unirse al colorante.
 Otros métodos Otros métodos
Método de Bradford Método de Bradford

Se basa en la unión del colorante Coomassie Los aminoácidos que son reconocidos por el
Blue G-250 a las proteínas. colorante son arginina, fenilalanina, triptofano y
prolina.
Las proteínas (aminoácidos básicos y
aromáticos) se unen a la forma azul para formar un El azul de Coomasie libre se detecta a 470 nm
complejo proteína-colorante con un coeficiente de mientras que la forma unida a proteínas a 595 nm.
extinción mayor que el colorante libre.
libre
Esto se debe a que el Coomassie se une
Este método es sensible, simple, rápido, barato y preferencialmente a los aminoácidos
pocas sustancias interfieren en su determinación.
determinación mencionados y cambia de un estado catiónico a
uno aniónico.
Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas.
básicas
No interfieren los carbohidratos.

Otros métodos Otros métodos

Método de Bradford
Espectroscopia infrarroja
Se aprovecha la absorción del grupo amida del
enlace peptídico.
peptídico
 Ventajas:
Es un método rápido, análisis de
multicomponentes
No destructivo.
Desventajas
Interferido por agua.
Proceso de calibración complejo.
complejo
 Otros métodos

Espectroscopia infrarroja reflectante

 La muestra se ilumina con seis longitudes de
onda cercanas a la radiación infrarroja y se detecta
la luz reflejada.
Consideración
Es necesaria la calibración contra un
conjunto de muestras estadísticamente
significativas, analizadas por métodos de
referencia tradicionales.
Ventajas
Rápido,
Rápido análisis de multicomponentes.
multicomponentes
Aplicable a materiales sólidos.
Cuantifica proteína en presencia de agua.