IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN AGUA

DE LAGO A PARTIR DE LOS RESULTADOS ARROJADOS POR LAS

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

MARISOL VARGAS1
FREDDY SALAMANCA1
ANDRES1
CAROLINA1

RESUMEN
Con las sustancias que los organismos utilizan y desechan dentro de su metabolismo es posible identificar el tipo de
microorganismo. En la práctica se utilizaron métodos bioquímicas para su identificación. Para Citrato de Simmons se realiza
tendido con la colonia seleccionada, TSI se hace punción y tendido, LIA doble punción y se tendido. Para SIM punción a un
1/3 de profundidad en el medio, para ÚREA tendido, para RM y Voges Proskauer suspensión. Finalmente para fenilalanina se
hace tendido. Después de 8 días de haber sido encubados a una temperatura de 37°C se procedió a realizar la lectura y
agregar los últimos reactivos a la prueba de VP. Si hubo crecimiento se mezcla, se le agregó 3 gotas de KOH se mezcló de
nuevo y luego se le agregó 5 gotas de α-naftol. Para las pruebas de CS, SIM y Úrea, sus resultados fueron positivos. Negativo
para fenilalanina, VP, RM y LIA. Para TSI y LIA hubo producción negativa en H2S y positivo para CO2.

Palabras clave: pruebas bioquímicas, metabolismo, enzimas, Enterobacteriaceae,

INTRODUCCIÓN

A partir de las enzimas, productos y sustratos que las bacterias utilizan en su

metabolismo y de la presencia de un sistema indicador, las pruebas bioquímicas
ponen en evidencia el tipo de bacteria a la cual se estudia. Entre algunos de estas
pruebas encontramos:

CS: El Agar Citrato de Cimmons es un medio que preparado de color verde, es

utilizado para la diferenciación de enterobacterias, capaces de usar citrato como
única fuente de carbono. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio
es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul
de bromotimol es el indicador de pH.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato

permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio
alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono,
producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto
es indicativo de la producción de citrato permeasa. (GAMAZO,2005)

Además es visible la producción de gas carbónico como producto metabólico al

formar espuma en el menisco del medio. Las pruebas pueden ser leídas como
positivas si hay crecimiento y color azul en el pico, es negativo si el medio
permanece de color verde.

SIM: medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de

sulfuro de hidrógeno. Es útil para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
1
Estudiante Ingeniería Ambiental y Sanitaria. Facultad de Ingeniería. Microbiología.
El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, que puede ser
oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un
conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el
aldehído del reactivo de Kovac, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de
hierro a partir del tiosulfato, siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Si se produce turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de siembra es
positiva, negativo si el crecimiento se observa en la zona de siembra. Si existe una
producción de H2S se observa un ennegrecimiento en la línea de siembra ó en todo
el medio. Finalmente si hay producción de indol se forma un color rojo luego de
agregar el reactivo de Kovac.

UREA: es un medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la

actividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp., de otros
miembros de la familia Enterobacteriaceae. El extracto de levadura es la única
fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes
esenciales para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de

pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la
enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan,
liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el
medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo.

TSI: determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de

carbono: glucosa, lactosa y/o sacarosa, con producción ó no de gases (CO 2 y H2),
junto con la producción ó no de ácido sulfhídrico (H2S).

LIA: lisina-hierro-agar es un medio de cultivo utilizado para diferenciar

microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación /
desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes

para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
descarboxilasa y desaminasa.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la

producción de ácido sulfhídrico. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza
por el ennegrecimiento del medio. El púrpura de bromocresol, es el indicador de pH,
que es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o
mayor a 6.8.

Por descarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el

medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La descarboxilación de la
lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea
previamente fermentada. (PARÉS,1997)

RM: La bacteria puede fermentar la glucosa por la vía acida mixta con producción de
metabolitos como ácido láctico, fórmico y succínico, los cuales van a hacer
descender el pH inicial del medio de 6.9 a 4.2, lo cual se visualiza al agregar el
indicador de pH rojo de metilo, el cual a pH ácido vira a un color rojo.

VP: La bacteria puede fermentar la glucosa por la vía butilen glicolica con
producción de productos neutros como el acetil metil carbinol (acetoina), el 2,3
butilen glicol y el diacetil. El producto final más frecuente es el 2,3 butilen glicol, que
es fácilmente oxidado a acetil metil carbinol y luego a di-acetil. El VP realmente es
una búsqueda de di- acetil. El VP realmente es una búsqueda de di-acetil, ya que las
condiciones de la prueba convierten fácilmente los otros dos componentes en
diacetil.

METODOLOGÍA

Del cultivo obtenido en la caja de petri de la dilución 1:10 encubada a 37°C por 8
días se seleccionó una colonia para ser utilizada en cada prueba bioquímica de la
siguiente manera:

Para la prueba de Citrato de Simmons se realizó tendido en superficie, para TSI se

hizo una punción y tendido. Para el LIA doble punción y tendido. Para SIM punción a
un 1/3 de profundidad en el medio. Para UREA tendido. Para la prueba de RM y VP
suspensión y para fenilalanina tendido.

Después de 8 días de haber sido encubados a una temperatura de 37°C se procedió

a realizar la lectura y agregar los últimos reactivos a la prueba de VP. Si hubo
crecimiento se mezcló, se agregó 3 gotas de KOH, se mezcló y luego se agregó 5
gotas de α-naftol.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

A partir de los resultados de los tubos se dio la siguiente lectura:

PRUEBA TENDIDO FONDO GAS (CO2) H2S RESULTADO

CS +
A A + -
TSI
K K + -
LIA
SIM + +
UREA +
RM -
VP -
FENILALANINA -

Con los resultados obtenidos en las pruebas en la muestra de agua es clara la

presencia de una Enterobacteriaceae.
Entre algunos de los resultados importantes, el es hecho de que la bacteria presente
en el medio no utiliza las vías acida mixta y butilin glicólica para la fermentación de
los azucares, por los resultados negativos de las pruebas de rojo metilo y Voges
Proskauer.

Para el caso de la prueba de TSI podemos observar que hubo una fermentación de
la glucosa, latosa y/o sacarosa, evidenciado en la coloración amarilla total del medio
y la producción de CO2 por aero y anaerobiosis.

En el caso de LIA hubo una descarboxilación de lisina por la alcalinidad total final del
medio.

Con los resultados obtenidos en la prueba de SIM la bacteria posee sistemas de

movilidad (flagelos).

Y con la prueba de Urea se evidencia la presencia de la Ureasa, y la presencia de

compuestos orgánicos como sustratos de metabolismo.

Con los resultados obtenidos en cada prueba y las respectivas tablas de

clasificación podemos determinar que entre los microorganismos que hay dentro del
sistema léntico están las Enterobacter y Klebsiella.

Aunque para algunas pruebas era posible la presencia del genero Clostridium, estas
se caracterizan por poseer un metabolismos estrictamente anaerobio y de un
exigente crecimiento fueron descartados.

CONCLUSIONES

A partir de los resultados arrojados por las pruebas de VP y RM podemos concluir

que la bacteria es de tipo no fermentadora de glucosa por las vías acida mixta y
butilin glicolica.

A partir de los resultados arrojados podemos concluir que entre las enzimas que
podemos encontrar dentro del metabolismo de la bacteria esta la descarboxilasa,
ureasa y triptofanasa.

BIBLIOGRAFÍA

PARÉS Ramón. Bioquímica de Microorganismos. Editorial Reverté. Sevilla España.

1997.

GAMAZO Carlos. Manual practico de microbiología. Tercera edición. Editorial

Masson. Barcelona. España. 2005

MURCIA Martha. Identificación de Enterobacterias.